における自発運動量の測定

この手順の全体的な目的は、ショウジョウバエの自発的な運動活性を定量化することです。まず、実験用のハエを収集し、熟成させることでこれを達成します。次のステップは、温度制御されたインキュベーター内に個体群モニターを設置し、適切なソフトウェアをダウンロードすることです。

次に、ショウジョウバエをガラス瓶に移し、アクティビティモニターを稼働させたポピュレーションモニター内に設置します。最終ステップはデータの解析です。最終的に、ポピュレーションモニターを用いてショウジョウバエの自発的な身体活動の差異を明らかにします。

ネガティブジオアクシスなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、複数の個体群におけるショウジョウバエの自発的な身体活動を、簡便かつ信頼性が高く、客観的に連続記録できる点にあります。この手法を用いることで、さまざまな操作がハエにどのような影響を与えるかを判断することが可能になります。手順を実演する自発的な身体活動のデモンストレーションは、研究室アシスタントのSuzanne Kowskiが行います。まず、付属のテキストプロトコルに記載されている手順に従って餌を調製し、ホットプレート上で絶えず撹拌しながら冷却させます。

各狭口ガラスバイアルに5 mLの餌を分注し、餌の量が個体群の最も低いリングよりも下にあることを確認してください。餌が室温まで冷めたことを確認します。バイアルをスポンジプラグで蓋し、4 °Cで最大2週間保存してください。

使用前にバイアルを室温まで温めておきます。次に、標準的なラボ用培地を入れたプラスチックバイアルでCanton S系統のショウジョウバエを飼育します。バイアルは、25°Cに設定された温湿度管理装置の中で、12時間の明暗サイクル条件下で保持してください。

午前中にバイアルから成虫を除去します。その後、雌が処女である状態を確保するため、羽化から8時間以内に二酸化炭素麻酔パッドを用いて、新しく羽化した個体を雌雄に分離します。5〜10日目の処女雌と雄をそれぞれ入れることで、親世代のバイアルを10本用意します。

酵母を数粒加えた標準的な飼育瓶にハエを入れる。ハエを25 °Cのインキュベーター内で、12時間の明暗サイクルで2日間飼育する。1日おきにハエを新しいプラスチック瓶に移し、産卵された卵を含む瓶を25 °Cのインキュベーター内で保持する。

次に、1日目に羽化したハエを除去して廃棄し、2日目により同期したハエの集団を回収するため、バイアルをインキュベーターに戻します。その後、二酸化炭素パッド上で、メタルスプーンを用いて、24時間以内に1バイアルあたり雄25匹と雌25匹を迅速に回収します。バイアルにELOの日数を記入してください。

実験群および対照群のそれぞれについて、少なくとも5本ずつの反復 vial を準備します。これらの vial は、温度制御された環境チャンバー内にて、25 °C、12時間明暗サイクル条件下で保持してください。

10日間、2日おきにハエを新しいプラスチック製バイアルに移します。漏斗を用いて、個体数モニターを温度制御インキュベーター内に設置します。次に、各モニターを4芯電話ケーブルで、5分岐スプリッターを介して電源供給インターフェースユニット（PSIU）に接続します。

次に、電話ケーブルをPSIUに接続します。PSIUを100〜240Vの電源コンセントに接続し、電源出力コネクタをPSIUの mating jax のいずれかに差し込みます。その後、コンピュータプログラムとPSIUおよびアクティビティモニターとの間にデータリンクを合成するために、PSIUで使用されるUSBソフトウェアをダウンロードします。

プログラムを起動します。次に、「Preferences（設定）」から、Macintosh用のシリアルポート「PSIU」を選択します。

次に、読み取り間隔を選択します。続いて、各モニター固有の製造番号によってモニターを選択します。モニターに割り当てられた番号に対応するモニター範囲を選択してください。

緑色のランプを確認し、すべてのモニターが適切に接続されていることを確認してください。赤色のランプは接続が切れていることを示します。黒いボックスが表示されている場合は、システムがオフであるか、USB接続が正しく行われていないことを示しています。

同齢の雄および雌のショウジョウバエを分離します。二酸化炭素パッドを用いて、雄10匹と雌10匹を、それぞれ室温に置いた別々のガラスバイアルに入れます。

各実験群および対照群、およびショウジョウバエの各性別について、少なくとも3本のバイアルを使用してください。ハエが餌に埋もれるのを防ぐため、二酸化炭素から回復するまでバイアルを横にした状態で保持します。室温で2時間放置し、二酸化炭素から回復させてください。その後、バイアルを個体群の中に配置します。

インキュベーター内でモニターを飼育します。餌の乾燥を防ぐため、3〜4日後にハエを新しいバイアルに移します。実験終了後、データをスキャンして重複した読み取り値を排除し、記録が完全であることを確認してください。

ファイルスキャン110xを使用してデータ収集の間隔を選択し、選択した期間の最初の24時間以内に収集されたデータを破棄します。プログラムは、各モニターの現在の総カウント数をコンピュータに送信し、再びゼロからカウントを開始します。次に、実験名を選択し、コンピュータのデータフォルダからファイルをコピーしてデータを保存します。

まず、テキストファイルに収集されたデータをExcelスプレッドシートの列に慎重にコピーしてデータ解析を開始します。次に、赤外線ビームの3つの異なる高さで収集された活動量の合計にあたる、各モニターの任意の期間内における総活動量を算出します。最後に、生物学的反復である3つのモニター間の平均移動量および標準偏差を、両側t検定を用いて決定します。

ショウジョウバエの自発的な運動活性は、ハエの性別および明暗サイクルに依存します。雄および雌のハエの平均活性を示すこのグラフに示されている通り、矢印は明期から暗期への移行点を示しています。活性の低下が見られる一方で、20日齢の雄のハエにおいて、高カロリー食を与えたハエの活性が低下したのに対し、標準食の半量を投与した低カロリー食のハエでは総活性が増加しています。

このビデオを視聴することで、ショウジョウバエの自発的な身体活動を測定する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、遺伝学的または環境的な操作がハエの活動にどのような影響を与えるかを判断するのに役立ちます。