マウスの脳に直接薬剤送達のための異粘膜移植手順
2014年7月16日
ヒト視鏡頭蓋底再建のマウスモデルは、鼻粘膜移植片を用いて、脳と鼻の間の半透過性界面を作成することが開発されている。この方法では、研究者は、全身投与された場合に他の方法で血液脳関門によって除外された高分子量治療薬の中枢神経系への送達を研究することを可能にする。
この手順の全体的な目標は、化合物を脳に送達するための従属栄養粘膜移植手術を成功させることです。これは、最初にドナーマウスから鼻中隔移植片を単離することによって達成されます。2番目のステップは、中隔から粘膜をレシピエントマウスの頭蓋骨欠損に移植することです。
次に、脳は移植片を通じて所望の期間投与されます。最後のステップは、蛍光、顕微鏡法、または免疫組織化学を使用して脳への投与手順の結果を分析し、送達された化合物の脳への拡散を示すことです。柔組織。ニューロプ医薬品の利用は、血液脳関門の存在により非常に制限されています。
私たちは、ヒト内視鏡下経鼻手術を基礎として、血液脳関門の穴に粘膜をグラフ化し、これを導管として直接脳に薬物を送達する技術を開発しました。ここでは、ボストン大学のハン研究室の博士研究員であるリッチー・コーメンが、マウスモデルでこの手法を実証します。この手順は、安楽死させたマウスの鼻の周りの皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させることから始めます。
次に、空気圧ドリルで3本の線に印を付けます。そのうちの2本の線は鼻の領域に横方向に隣接しており、3本目の線は目と一直線に並んでおり、2本の線を垂直に結んでいます。次に、腹側にドリルダウンします。
鼻中隔を周囲の組織から分離するために、鼻中隔に付着した組織から中隔を切り取ります。次に、顕微鏡下で滅菌生理食塩水に保管し、移植片を洗浄し、接続された組織をすべて取り除きます。理想的な状況は、軟骨中隔の両側に存在する粘膜を損傷することなく、すべての結合組織を成功裏に除去することです。
神学的な枠組みに取り付けられた標準的な無菌ミラーリング外科的処置を使用してマウスに麻酔をかけた後、乾燥を防ぐために眼に軟膏を塗布します。次に、頭蓋骨を露出させ、頭を水平にします。次に、空気圧ドリルを使用して頭蓋骨に直径1.25ミリメートルの円形の穴を開けます。
ATUを標的にするときは、ドリルで開けた領域を滅菌生理食塩水で濡らし、かみそりの刃を使用して頭蓋骨を取り除きます。その後、30ゲージの針の先端を使用して手動で硬膜を取り除きます。その後、粘膜を脳表面より上に配置し、上皮側が傷口から遠ざかるように細心の注意を払います。
手術用ハサミの先端を使用して、膜を軟骨から頭蓋骨と脳の表面に保持し、開頭部位のすべての骨の端にたっぷりと重ね合わせます。次に、グラフトを滅菌したニトリル片で覆います。これは、治癒中に皮膚が移植片に付着するのを防ぐように作用します。
必要に応じて余分な膜をトリミングし、グラフトと接触したニトリルの動きを避けます。次に、縫合糸で皮膚を閉じ、マウスを3〜7日間回復させてから次のステップに進みます。適切な術後治療が行われ、動物に投与するために定期的な鎮痛薬が投与されていることを確認してください。
麻酔をかけたマウスを脳定位固定装置のフレームに固定した後、縫合糸をハサミで切断し、頭蓋骨周辺の余分な皮膚を切除します。ニトリルバリアを取り外し、頭蓋骨の表面を清掃します。滅菌生理食塩水と綿棒を使用して、移植片が見えるまでその領域を清掃します。
グラフトが目的の表面積よりも大きく成長している場合は、かみそりでグラフトを切断する必要があるかもしれません。次に、エッジが頭蓋骨に接触するように、グラフトの上にウェルを置きます。次に、ウェルと頭蓋骨の間の接合部にシアノアクリレート接着剤を塗布します。
ウェルに滅菌生理食塩水を入れ、漏れがないことを確認します。その後、頭蓋骨にセメントを塗布して、ウェルを所定の位置に固定します。その後、ピペットで生理食塩水をウェルから取り出します。
接着剤が漏れていないことを確認するために、ウェルを数回洗います。次に、50マイクロリットルの蛍光デキストランを追加します。シアノアクリレート接着剤で上部に固定された円形のニトリルを使用してウェルの上部にキャップをし、接着剤がウェルの内容物に接触しないようにします。
所望の時間が経過した後、動物を安楽死させ、インプラントと脳を取り外してください。グラフトを所定の位置に保持するように注意してください。取り外したら、フラッシュし、脳を凍結します ドライアイスバスで冷却したイソブタンの溶液に、脳をOCT溶液に埋め込み、50マイクロメートルでスライスします。
目的のスライスを顕微鏡スライドに直接置きます。次に、OCT溶液が乾燥したらすぐに蛍光顕微鏡を使用してスライスを画像化します。これは、経粘膜投与後のマウス脳切片の蛍光顕微鏡画像です。
40キロダルトンのテトラエチルルミン結合デキストランを24時間使用すると、粘膜移植片が脳の表面に見えます。この技術を習得すると、適切に機能するには合計4時間の手術時間が必要です。このビデオを見た後、脳への薬物送達を目的として、鼻中隔を分離し、開頭部位に粘膜を移すことができるはずです。
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概要
本研究では、鼻粘膜移植を用いて脳と鼻の間に半透透過性の界面を構築し、ヒトの内視鏡下頭蓋底再建を模した新しいマウスモデルを提示します。この革新的なアプローチにより、血液脳関門による制限を克服し、高分子治療薬の中枢神経系への送達に関する研究を促進することが可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物医学工学
- 治療薬デリバリー
背景
- 血液脳関門は、多くの治療化合物の脳内への進入を制限している。
- 中枢神経系への薬剤投与のための現行の手法は限られている。
- 異種粘膜移植は、薬剤投与を強化するための潜在的な解決策となる。
- 本研究は、鼻腔移植を用いた新しい外科的アプローチを探索することを目的とする。
研究の目的
- 脳への薬剤送達を研究するためのマウスモデルを構築する。
- 送達インターフェースを作成するために、鼻粘膜移植を利用する。
- 脳内への化合物の拡散を分析する。
使用された手法
- ドナーマウスからの鼻中隔グラフトの採取。
- レシピエントマウスの頭蓋骨欠損部への粘膜膜の移植。
- グラフトを介した脳への特定期間の薬剤投与。
- 蛍光法、顕微鏡観察、または免疫組織化学による化合物の拡散分析。
主な結果
- 頭蓋欠損部への鼻粘膜移植の成功。
- 脳実質への化合物の拡散を実証。
- 蛍光および顕微鏡観察により、デリバリー手法の有効性を確認。
- 治療への応用における血液脳関門の克服に関する知見を提供。
結論
- 開発されたモデルは、脳へのドラッグデリバリーを研究するための有望なアプローチを提供します。
- 鼻粘膜移植により、高分子量治療薬の送達を向上させることができます。
- この手法は、中枢神経系疾患の治療における新たな治療戦略への道を切り開く可能性があります。
よくある質問
産業界への適用性
血液脳関門（BBB）の突破は、中枢神経系（CNS）治療薬開発における極めて重要な課題であり、高分子量治療薬の臨床応用の制限となってきました。本マウス粘膜移植モデルは、脳への直接投与を可能にする半透過性インターフェースを提供し、BBBの不透過性により排除される化合物の前臨床評価を可能にします。このアプローチは、治療候補物質の脳内曝露を検証することで、初期創薬におけるメカニズム的なリスク低減と予測精度の向上を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲット検証
- 科学的価値：高分子化合物の脳実質への送達を確認することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：BBB透過性に依存せず、中枢神経系（CNS）への曝露を評価するための再現性のある外科的モデルを提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 定量的な蛍光読み取り値を生成し、実験条件間での化合物の拡散を比較する。
- 運用的価値： グラフト作製および投与手順を標準化し、拡張可能な化合物スクリーニングワークフローを実現する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 脳への直接的なアクセスを検証することで、神経精神疾患治療薬の疾患関連試験を支援する。
- 運用的価値： 一貫した投与および読み出し方法により、創薬から前臨床検証までの連続性を促進する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、血液脳関門（BBB）に依存する吸収制限を回避して化合物を脳へ直接届けることを可能にするため、初期の創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学：新規治療薬の脳内曝露を確認することで、ターゲットバリデーションを支援します。
- スクリーニング：蛍光ベースの定量分析に向けた、アッセイ可能な化合物投与を可能にします。
- 分析：空間的および時間的な拡散分析のための、顕微鏡観察および免疫組織化学の結果を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：CNS透過性治療薬を必要とする神経疾患の前臨床モデリングに適合します。
- エンタープライズ再利用：探索キャンペーン全体にわたる反復的な化合物テストのための、再利用可能な手術プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 移植片を介した化合物の直接輸送を実証することで、CNS（中枢神経系）への送達におけるメカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 標準化された移植片の植え込みとウェルベースの投与により、再現性を向上させます。
- 戦略的価値： 創薬の早期段階で経験的な脳内曝露データを提供することにより、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 検証済みの送達効率に基づいた、CNS治療薬のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- グラフトの分離、開頭術、および粘膜操作におけるマイクロサージェリーの専門知識が必要です。
- 滅菌済みの手術器具、ニューマチックドリル、および蛍光顕微鏡のインフラストラクチャに依存します。
- 一貫した読み取り結果を得るために、外科、イメージング、および薬理学グループ間でのチーム横断的な標準化が必要です。
- マウスの系統や週齢に応じて、グラフトのサイズやウェルの配置に関する適応上の検討が必要です。
- 投与開始までに術後の回復期間（3–7日）が必要であり、これが研究スケジュールに影響します。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Harvesting of the Mucosal Graft
2:43
Surgical Implantation of Mucosal Graft
4:49
Administration of Dosing Solution
6:44
Analysis of Transmucosal Delivery
7:32
Results: Fluorescent Microscope Image of a Mouse Brain Slice Following Transmucosal Dosing
7:57
Conclusion
