濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

この手順の全体的な目的は、静脈内酸素投与のための、自己 assembly 脂質ベースの酸素マイクロバブル（OMS）を大量に製造することです。これは、高剪断ホモジナイザーと気密タンクを用いて、OMSの製造および連続濃縮を行うことで達成されます。第2のステップでは、特殊なシリンジを用いて、酸素を容量比70%含有するLOMエマルションを押し出します。

次に、エマルションを遠心分離で濃縮し、体積パーセントで90%の酸素フォームを得ます。最終ステップとして、体積パーセント酸素の算出および光散乱技術を用いた粒子径分布の評価を行い、品質管理を実施します。最終的に、高せん断ホモジナイズにより、体積比90%の酸素を含むOMSが2リットル製造されます。

超音波処理やアマルガメーションなどの既存の製造方法に対する本手法の主な利点は、ホモジナイズによって、治療用酸素供給の大動物試験に必要な体積であるリットルオーダーの自己組織化マイクロバブルを生成できることです。本手法の用途の一つに、高度低酸素血症の患者の治療があります。酸素ガスで満たされたマイクロバブルは、数秒以内に脱酸素化ヘモグロビンに酸素を転送し、血液の3倍の酸素含有量を運ぶためです。ホモジナイザーヘッドの深さに応じて、本手法の実証を行うことが重要となります。

完全に酸化した環境の維持、および濃縮されたLMSと水相の判別を適切に行うことは困難な場合があります。脂質ベースの酸素マイクロバブル（OMS）の製造システムは、シングルステージミキサーを備えた保持・濃縮タンク（HCT）、インライン高せん断ホモジナイザー、HCTとホモジナイザーの間で流体を移動させるためのローラーポンプ、および熱交換器で構成されています。

システムのセットアップを開始するために、底部に2つのポートと側面に3つのポートを備えた、滅菌済みの口径の広い4Lガラス回収容器をシングルステージミキサーの下に配置します。HCTポート番号1の底部ポートの1つに、先端に濃縮エマルション回収用の3方コックを取り付けた、内径3/8インチ、長さ約10インチの滅菌済み透明チューブを装着します。次に、2つ目の底部ポート（ポート番号2）に、内径3/8インチ、長さ約36インチの滅菌済みチューブを装着します。このチューブをローラーポンプに通します。

高せん断ホモジナイザーの入口には、2つのポートを持つT字管が取り付けられています。ポート番号2からローラーポンプを経由してチューブを接続し、T字管のサイドポートに接続します。もう一方のポートを、低流量酸素ガス流量計を用いて酸素タンクに接続します。

高剪断ホモジナイザーの出口ポートを、4 °Cに維持されたインライン熱交換器の入口ポートに接続します。熱交換器の出口ポートをHCTのリターンポートに接続し、クローズドループシステムを構築します。酸素タンクを流量計を介して、ポート番号4からHCTに接続します。

最後に、大気に開放されたガス組成モニターをHCTの上部ポートに取り付けます。この手順を開始するには、20gのGMP one two DYS steer oil、SN glycerol three PHOSPHOCHOLINEまたはDSPCと、10gのコレステロールをHCTの底部に入れます。1Lのplasma light AをHCTに加え、1分間手で撹拌し、できるだけ多くの脂質を水相に統合させます。

シングルステージミキサーを水相に浸し、ミキサーヘッド全体が水相に覆われていることを確認します。周囲の空気がヘッドスペースに混入するのを防ぐため、ゴムシールまたはテープを使用して、HCTの上部が気密状態で、開いたサイドポートがないことを確認してください。ポート番号4に接続されたガス源をオンにし、HCTヘッドスペースの酸素分率が95%を超えるまで待ちます。シングルステージミキサーを用いて、前駆体エマルションを5分間混合します。5,000 RPMで混合した結果、混合物は淡白色となり、目視で確認できる脂質凝集塊がない状態になるはずです。

混合後、未使用の脂質水混合液は4 °Cで最大30日間保存可能です。まず、ローラーポンプを1.3 liters per minute（LPM）で回し、前駆体エマルションを用いてクローズドループシステム全体のプライミングを行ってください。システムのプライミングが完了したら、ポンプを1.3 LPMで回したままにして、LOの製造を開始します。

インライン高せん断ホモジナイザーを7, 500 RPMで起動します。その後すぐに、ホモジナイザーの入口部分に0.5 LPMで酸素を導入します。HCT内のシングルステージミキサーは3, 500 RPMで回したままにします。

Omは、インラインホモジナイザー内のローターブレードとエマルジョンスクリーンの界面で形成されます。最初の数分以内に、液体が目に見えて粘性を増すはずです。システムを15分間運転した後、高剪断ホモジナイザーとそこへの酸素供給を停止します。

これにより相分離が抑制され、HCT内の製品を比較的均一に保つことができます。連続濃縮段階において、ガス充填エマルションの体積が約2～3倍に増加することに注意してください。製造されたOMSを回収するための140 milliliterルアーロックシリンジは、あらかじめシリンジに100 millilitersの空気を吸引した後、140 milliliterの目盛りより上の余剰なプランジャーとシリンジ部分を切り落とすという加工を施しています。

滅菌済みの改造シリンジを、回収容器のベースポート1番に取り付けられたストップコックに接続します。有的に処置したピンセットを用いてプランジャーを下げ、100 mLの液体を吸い上げ、シリンジのキャップをしっかりと閉めます。すべての液体が取り除かれるまでこの操作を繰り返します。キャップした側を下にして、冷却バケット付き遠心機を用い、225 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後、3層の物質が確認されます。最下層にある過剰な白濁した水相を排出し、廃棄してください。

第2層は明るい白色で、濃縮されたomsが含まれています。周囲のガスの混入を防ぐため、三方コックを用いて濃縮された泡をガス不透過性のガラスシリンジに移します。破裂したoms由来の遊離酸素ガスが含まれている最下層は廃棄してください。

泡の品質は、次のようにガス濃度を算出することで評価できます。高品質な泡は、ガス濃度が90体積%以上に達します。第2の品質管理として、光学光散乱法を用いてマイクロバブルのサイズを測定し、粒子径が想定範囲内にあるかを確認します。ホモジナイズ時間や処方を変更すると気泡サイズが変化する場合があるため、濃縮されたomsを含むガラス製シリンジのキャップをしっかりと閉めておく必要があることに注意してください。

ルアーロック継手を使用することで、シリンジは22 °C、4 °C、または-20 °Cで保存可能です。より低温で保存することで、保存安定性が向上する場合があります。本プロトコルを用いれば、最大2 Lの濃縮OMSを90分で製造できます。

10 µLのOMSサンプルを光学顕微鏡で観察したところ、球状のOMSおよび相対的に少量の脂質残渣が認められた。同OMSサンプルを光散乱法で評価したところ、平均粒子径は2.624 ± 0.332 µmであった。OMSの90%以上が粒子径10 µm未満であり、粒子分布は多分散であった。

エマルションの粘度は気相分率に強く依存し、したがってマイクロバブル濃度に依存していました。ガス体積分率が60、70、90%のLOMエマルションを2 mLずつ分注し、40 mmの平行平板を用いて定常状態の流れ掃引により検討しました。

ストレスを0.1から1000まで変化させたところ、ガスを60体積パーセント含有するgass OMSは、ヒト血液と同様の放射線学的プロファイルを示しました。OMSの酸素含有量は、既知の酸素欠乏状態にある脱飽和ヒト血液の分注量に、60体積パーセントOMSに含まれる様々な体積の酸素を添加することで試験しました。OMS内で添加された酸素量と血液の酸素含有量の体積的増加との関係は、1.053 ± 0.03025でした。

テストしたOMSはほぼ100%の酸素を含んでおり、trapped gas pockets（閉じ込められた気泡）がほとんど見られず、in vitroにおいてその酸素ペイロードのすべてをヒト血液へ効果的に転送できることが示唆されました。この技術を習得し、適切かつ効率的に実施すれば、90分間で2リットルのLMSを製造することが可能です。本手順を行う際は、蓄積されるOMSを視覚的に検査し、LOMフォームの濃度について品質管理を行うことが重要です。この製造手順に従い、OMSを大規模な静脈内投与および治療ガスのデリバリーに使用することができます。