Name: 濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学ぶ高せん断均質化とシリアル濃縮による脂質系酸素マイクロバブルエマルジョン製造法。遠心分離で90%酸素含有率を達成し、2リットルの大量生産が可能な医療用酸素供給技術を習得する。

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資金調達：米国陸軍の医学研究および資材コマンド（USAMRMC）と遠隔医療·先端技術研究センターが管理する。 Shunxi智は、ここで説明したように注射器の変更を貢献した。

1。システムのセットアップシステムは、単段ミキサー、インライン高剪断ホモジナイザー、HCT、ホモジナイザーとの間に流体を移動させるローラーポンプ、および熱交換器（図1）を取り付け、保持タンクを濃縮（HCT）からなる。 <ol><li>一段ミキサーの下に2ベースポートと3側面ポートを装備滅菌、広口4リットルのガラス回収容器を置きます。容器の口にミキサーヘッドを下げて（ヘッドスペースを汚染する周囲の空気を防ぐために）ゴム製のシールやテープを使用して気密フィットを保証します。 </li><li>無菌3月8日とHCTの（図1、ポート＃1）ベースポートのいずれかに合わせて」（ID）をクリアチューブ、およそ10 &quot;長い、濃縮エマルジ ​​ョンの収集のための先端の3方活栓を装備。 </li><li>無菌3/8 &quot;（ID）のチューブで二塁ポート（図1、ポート＃2）を取り付け、approximatel長さY 36 &quot;。ローラーポンプを介して、このチューブを通します。 2ポートを含むTピースと高せん断ホモジナイザーの入口にフィットし、次のように接続し、ローラーポンプを介して、ポート＃2からチューブを接続し、Tピースの側ポートに接続します。低流量酸素ガス流量計を用いて酸素タンクに他のポートを接続します。 </li><li> 4℃に維持し、インライン熱交換器の入口ポートに高剪断ホモジナイザーの出口ポートを接続閉ループシステムを作成、HCT（図1、ポート＃3）の戻り口に熱交換器の出口ポートを接続する。 </li><li> HCT（図1、ポート＃4）に（流量計を経由して）酸素タンクを取り付けます。 HCTの上部ポート（図1、ポート＃5）の大気に開放されているガス組成計を取り付けます。 </li><li>無菌性が望まれる場合には、オートクレーブによる各使用の前にガラスと金属成分を滅菌する。配管部品やプラスチックのCOを殺菌各使用前に、エチレンオキシドによるnnectors。生成物はインビボで試験される場合、これは特に重要である。 </li></ol> 2。のLOM製造<ol><li> GMP 1,2 -ジステアロイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DSPC）およびHCTの基部におけるコレステロール10gを20gのを置く。水相に可能な限り多くの脂質を統合し、1分間、HCT、手撹拌するプラズマLyte Aの1リットルを追加します。 </li><li>ミキサー全体ヘッドは水相で覆われていることを確認して、水相中に一段階ミキサーを下げます。 HCTの上部は気密（上記の手順1.1を参照）、全くのオープンサイドポートがないことであることを確認してください。ポート＃4に取り付けられたガス源をオンにして、HCTのヘッドスペースの酸素分率が&gt; 95％に達するまで待ちます。 10リットル/分（LPM）で、これは約10分を取る必要があります。 </li><li>単段ミキサーを用いて、5,000 rpmで5分間、前駆体エマルションを混合する。得られた混合物を淡い白で表示し、目に見えるLIPIが含まれているべきではないD塊。混合した後、未使用の脂質 - 水混合物は、単回使用の前に最大30日間4℃で保存することができる。 </li><li>総理1.3 LPMでのローラーポンプをオンにして前駆体エマルション全体閉ループシステム。システムが準備されると、1.3 LPMでオンポンプを保つ。 </li><li>のLOMの製造を開始するには、7,500 rpmまでのインライン高剪断ホモジナイザーをオンにします。その直後に、0.5 LPMでのホモジナイザーの入口部への酸素の流れをオンにします。 3,500 rpmで上（HCT）で一段階ミキサーを保管してください。のLOMは、インラインホモジナイザー（図2）内のロータブレード及びemulsor画面の界面に形成されている。数分以内に、流体が目に見えてより粘性になる必要があります。より厳密な手法は、製造中に、ポート1からのアリコートを除去し、粘度計を用いて分析することによって行うことができる時間の関数としての粘度を決定することである。 注：目に見える気泡はミキサーを出るチューブ中に存在する場合、酸素インライン·ホモジナイザーへの流れが高すぎる。流体は不透明であり、目に見える気泡を含まないまでガス流を下滴定する。 </li><li> 15分間のシステムを実行してから、それに高剪断ホモジナイザーおよび酸素注入をオフにしてください。エマルジョンが除去されるまで、HCT単段ミキサーを実行し続ける。これは相分離を軽減し、HCT内で比較的均一な製品を保持します。 注意：ガス充填エマルジョンの量は、シリアル濃度段階の間に約2〜3倍に増やす必要があります。そうでない場合は、その酸素が高剪断ホモジナイザーに流入され、前駆体エマルションでその脂質濃度が正しいことを確認してください。脂質濃度が低下すると生産効率が低下する。 </li></ol> 3。コレクション、集中、評価、およびのLOMのストレージ<ol><li>無菌を取り付け、収集容器上のベースポート＃1に装着活栓に140ミリリットルルアーロックシリンジを変更しました。 10を策定流体の0ミリリットル。すべての流体が除去されるまでしっかりとシリンジを繰り返し、キャップ。 <ol><li>注射器への空気の100ミリリットルを引き出す、次に140ミリリットルマークの上に余分なプランジャーとシリンジ材を切り鋸で注射器を変更します。プランジ​​ャーを策定する歯付き鉗子を使用して記入し、空の注射器。この変更は、簡単に遠心分離することができます。 </li></ol></li><li>エンドキャップ付き遠心シリンジは10分間225×gで冷蔵（4℃）バケット遠心機で下向き。 </li><li>材料の3つの層は、遠心分離後に表示されます。過剰曇っ水相の最下層を追放して捨てる。第二層は明るい白で、集中のLOMが含まれています。雰囲気ガスの汚染を防止するために三方活栓を用いて、ガス不透過性のシリンジに濃縮された泡を移す。破裂したのLOMから遊離酸素ガスを含む最終的な層を捨てる。 </li><li>泡質濃縮泡の≥90％のガスに達することによって評価することができる。カルキユル次のようにガス濃度を食べた。 体積％のガス= [（発泡体重/泡体積） - 1]×100 <ol><li>粒径が予想範囲内である場合に、第2の品質管理として、光掩蔽によるサイズのマイクロバブルを決定する。これは、均質化時間または処方の変化が気泡のサイズを変化させる可能性があることに留意すべきである。 </li></ol></li><li>しっかりとルアーロックフィッティングでガラスシリンジにキャップ。集中のLOMは、使用時にプラズマLyte Aで希釈することができる。注射器は22、4で保存するか、あるいは可能な-20℃º;より低い温度は、強化された貯蔵寿命安定性7を提供することがあります。 </li></ol>

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<li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

濃縮性の高い酸素化のLOMを作成する最も重要なステップは次のとおりです。1）HCT内のヘッドスペースが十分に酸素化されたままであることを確実にする。 2）脂質賦形剤の純度は（）貯蔵条件およびGMP製品の使用を含む最適であることを保証する; 3）粉末の脂質は、システムをプライミングする前に、水相と完全に混ぜることを保証する; 4）ガスの体積分率が70％を超えないことを確実にするためにHCT内のガス分率の増加に細心の注意を払う。 我々はここで説明する方法は、中空のマイクロバブルを作成するために、高せん断均質化を利用しています。両親媒性脂質は、インラインホモジナイザーに脂質を運ぶために使用される水相に懸濁されている。 GMPグレードの脂質は、 インビボ研究のために利用されており、それらはより少ない脂質凝集体および不純物を含有するので、一般に好ましい。格納されている場合は特に脂質は、（また、脂質​​酸化を受けやすい酸素化流体）及び細菌汚染の中。疎水性尾部はインラインホモジナイザー（図2）内に作成された周りの小さな酸素ガスマイクロバブルを配...

タンパク質、ポリマー、および脂質のシェルからなるマイクロバブルは、薬物送達のためのベクター、遺伝子治療、および超音波造影剤1-5として開発されている。これらの治療的使用は、血管内マイクロバブル持続性を必要とするので、このようなマイクロバブルは、一般に、血液中の低い溶解性を有し、気泡を安定化させる3,4パーフルオロカーボン6のような不活性、高分子量のガスが充填されている。 最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、末端器官の酸素供給を維持し、気道閉塞や低酸素血症7の期間中に血行動態不安定性を防ぐことができる酸素の治療用量を提供するように設計されています。静脈内のガス送達のために設計されたエマルジョンは、超音波造影剤または標的化薬物送達のために使用されるものとは異なる設計上の特徴を必要とする。本体は、酸素ガス（〜200ml /分）を大量に消費するため、まず、のLOMを製造する必要があり、大規模に注入された。これにより、製造プロセスが効率的である必要があります。第二に、製造プロセスは、周囲空気に（100％酸素で充填されたい）のLOMの露光を通して窒素汚染を回避するために閉ループであるべきである。のLOMの目的は、静脈内のガス送達であるので第三に、のLOMのガス留分は、エマルジ ​​ョンの粘度7による制限を認識し、最大化されるべきである。最後に、すべての静脈内注射用と同様に、粒径分布の正確な制御は、微小血管障害物08を回避するために不可欠である。 マイクロバブルの製造のためのいくつかの確立された方法がある。超音波処理は、高い強度を利用し、低周波の超音波は、マイクロバブル7,9を生成するためのガスヘッドスペースの存在下では、このような両親媒性リン脂質のような界面活性剤を含むエマルジ ​​ョンの空気-流体界面に適用した。このプロセスは、超変えることによって制御可能である超音波処理はほとんど臨床的に使用されるマイクロバブルの製造に使用されていないものの、音の周波数、パワー、パルス持続時間、得られた粒度分布は、特定のサイズ分布のマイクロバブルを生成するように調整することができる。合併は、大量の2に対応するためにスケールアップすることも困難である、密閉系、中の界面活性剤やガスの激しい機械的攪拌である。液滴ベースのマイクロ流体は、マイクロバブルの粒度分布10月13日の正確な制御が可能になります。伝統的に困難なスケールアップするものの、多チャンネルの高速マイクロフルイディクスは、マイクロバブル生産効率を高める13が記載されている。これらの方法のいずれかを用いて製造されたマイクロバブルは、遠心分画14,15及びマイクロバブル浮遊選鉱16,17として製造後小型化プロセスを必要とし得る。 非常に安定したマイクロバブルの製造のための別の確立された方法は、せん断homogenizですマイクロバブルの表面18上の安定六角形のリン脂質パターンになることができますATION 6、。この概念を踏まえ、我々は自己組織化のLOM 19を作成するために、インライン高剪断ホモジナイザーの組み込みについて説明します。このプロセスでは、ホモジナイザが急速にマイクロバブルを作成するための高い機械と油圧剪断を作成する、デュアル細かいメッシュemulsorスクリーンに近接して回転ブレード利用する。このシステムを介して脂肪乳剤のシリアル濃度はさらに遠心分離によって濃縮することができ、ますます濃厚ガス留分を、得られます。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DSPC)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>770365</td><td>代替製品:NOF Americaからの非GMP (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>あるいは、NaCl</td></tr><tr><td>ガラス収集容器</td><td>Specialty Glass, Inc.を使用することもできます。</td><td>カスタム</td><td>連絡先: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>ガス組成(酸素)モニター</td><td>Precision Medical</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>Sarns 8000 ローラーポンプ</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>モジュール式灌流システムの一部</td></tr><tr><td>BIOtherm 熱交換器</td><td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso ラボ用インラインミキサー</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td>シルバーソンVerso入口ポートのための<td>TピースTピースで多段ワークヘッドとフロントエンドエクステンションを使用</td></tr><tr><td></td><td>プロセスイノベーション</td><td>カスタム</td><td>連絡先:ブライアン・リービット - 508-423-2266</td></tr><tr><td>L5M-Aラボミキサー</td><td>シルバーソンマシンズ株式会社</td><td>NC0136483</td><td>メッシュエマルサースクリーンを使用(細かい)</td></tr><tr><td>ロチェスター・オクスナー歯付き鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-812-18</td><td></td></tr><tr><td>140mlシリンジ</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>ルアーロックがあることを確認します。</td></tr><tr><td>IX71 倒立型光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Retiga-2000R 顕微鏡カメラ</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>アキュサイザー 780A 自動希釈</td><td>PSS-NICOMP 粒子サイジングシステム</td><td>生産</td><td></td>終了</tr></tbody></table>

濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

ガス充填マイクロバブルは超音波造影および薬物送達剤として開発されている。マイクロバブルは、超音波処理、機械的攪拌、マイクロ流体デバイス、または均質化を用いて界面活性剤を処理することにより製造することができる。最近では、脂質ベースの酸素マイクロバブル（のLOM）は、生命を脅かす低酸素血症を逆転、医療緊急時に静脈内に酸素を供給するように設計され、その後の臓器損傷、心停止、死亡を防止しています。我々は、閉ループ高剪断ホモジナイザーを使用して、高度に酸素化されたマイクロバブルのスケールアップ生産のための方法を提示する。プロセスは、90分での濃縮のLOM 2 L（90体積％）を生成することができる。 60体積％に希釈したときに得られた気泡は、約2ミクロンの平均直径、および血液のそれと一致するレオロジープロファイルを有する。この技法は、この技術はトランスレーショナルリサーチラボのために有用であり得ることを示唆している、高容量および高酸素純度のLOMを生成します。

高せん断均質化は、動物の研究のために十分のLOMの（ すなわち 1日の午後内で）効率的な生産を可能にし、技術的専門知識を必要としません。一旦熟練し、濃縮のLOMの最大2 Lは90分で製造することができる。 マイクロバブルのサイズ及び形態を光学顕微鏡により光オブスキュレーションにより評価した。のLOM10μlのサンプルを可視化した場合には、球状のLOMに注意だけでなく、脂質の破片（図3A）の相対的な不足た。 GMP生成物を用いた場合に特に当てはまる。のLOMの同じサンプルは、光オブスキュレーションによって評価したところ、平均粒径が2.624±0.332ミクロン（SD）であった。のLOMの90％以上が直径&lt;10μmのようで、人口は多分散（図3B）であった。 エマルション粘度（マイクロバブル濃度にあるので）高濃度ガス留分に依存した。 2mlのアリコート応力が0.1〜10,000μN·mと変化させたとして変化するガス濃度のLOMから40ミリメー...

我々は、高剪断均質化およびシリアル濃度を用いて、静脈内酸素供給用に設計された脂質ベースの酸素の微小気泡（のLOM）の大量製造するための方法を記載している。

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

この手順の全体的な目的は、静脈内酸素投与のための、自己 assembly 脂質ベースの酸素マイクロバブル（OMS）を大量に製造することです。これは、高剪断ホモジナイザーと気密タンクを用いて、OMSの製造および連続濃縮を行うことで達成されます。第2のステップでは、特殊なシリンジを用いて、酸素を容量比70%含有するLOMエマルションを押し出します。次に、エマルションを遠心分離で濃縮し、体積パーセントで90%の酸素フォームを得ます。最終ステップとして、体積パーセント酸素の算出および光散乱技術を用いた粒子径分布の評価を行い、品質管理を実施します。最終的に、高せん断ホモジナイズにより、体積比90%の酸素を含むOMSが2リットル製造されます。超音波処理やアマルガメーションなどの既存の製造方法に対する本手法の主な利点は、ホモジナイズによって、治療用酸素供給の大動物試験に必要な体積であるリットルオーダーの自己組織化マイクロバブルを生成できることです。本手法の用途の一つに、高度低酸素血症の患者の治療があります。酸素ガスで満たされたマイクロバブルは、数秒以内に脱酸素化ヘモグロビンに酸素を転送し、血液の3倍の酸素含有量を運ぶためです。ホモジナイザーヘッドの深さに応じて、本手法の実証を行うことが重要となります。完全に酸化した環境の維持、および濃縮されたLMSと水相の判別を適切に行うことは困難な場合があります。脂質ベースの酸素マイクロバブル（OMS）の製造システムは、シングルステージミキサーを備えた保持・濃縮タンク（HCT）、インライン高せん断ホモジナイザー、HCTとホモジナイザーの間で流体を移動させるためのローラーポンプ、および熱交換器で構成されています。システムのセットアップを開始するために、底部に2つのポートと側面に3つのポートを備えた、滅菌済みの口径の広い4Lガラス回収容器をシングルステージミキサーの下に配置します。HCTポート番号1の底部ポートの1つに、先端に濃縮エマルション回収用の3方コックを取り付けた、内径3/8インチ、長さ約10インチの滅菌済み透明チューブを装着します。次に、2つ目の底部ポート（ポート番号2）に、内径3/8インチ、長さ約36インチの滅菌済みチューブを装着します。このチューブをローラーポンプに通します。高せん断ホモジナイザーの入口には、2つのポートを持つT字管が取り付けられています。ポート番号2からローラーポンプを経由してチューブを接続し、T字管のサイドポートに接続します。もう一方のポートを、低流量酸素ガス流量計を用いて酸素タンクに接続します。高剪断ホモジナイザーの出口ポートを、4 °Cに維持されたインライン熱交換器の入口ポートに接続します。熱交換器の出口ポートをHCTのリターンポートに接続し、クローズドループシステムを構築します。酸素タンクを流量計を介

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

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JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞と粒子の慣性順序を持つ単分散ドロップ生成を組み合わせることで、我々は、kHzのレートで一滴の細胞または粒子の所望の数をカプセル化する方法を説明します。我々は、二回のシングルとダブルの粒子降下を順不同カプセルのものを超えて効率を示しています。...

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備...

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

マイクロ流体ダブルエマルジョンの生成には、通常、パターン化された濡れ性を持つデバイスやカスタムメイドのガラス部品が含まれます。ここでは、表面処理や複雑な製造プロセスを必要とせず、14μmまでのダブルエマルジョンを製造できるオールポリジメチルシロキサン(PDMS)ダブルエマルジョンジェネレーターの製作と試験について説明します。...

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

1 Pa は、液滴マイクロ流体システムで実現することは困難である上径高粘度液滴を生成する位相反転共同フロー...

位相反転共同フロー構造を有するマイクロ流体デバイスをキャピラリーを用いた加工の高粘度液滴

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。...

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

このプロトコルは、プローブチップ超音波処理を使用して大量の脂質カプセル化デカフルオロブタンマイクロバブルを生成し、その後、高圧押出および機械的濾過を使用してフェーズシフトナノ液滴に凝縮する方法を記述する。...

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。...

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

このプロトコルでは、脂質マイクロバブルの作製と、マイクロバブルの物理化学的特性を保存する精製フリーの&gt;95%のラベリング効率を備えた互換性のあるワンポットマイクロバブル放射性標識法の概要を説明します。この方法は、多様な脂質マイクロバブル製剤に有効であり、放射性および/または蛍光マイクロバブルを生成するように調整できます。...

蛍光および放射性トレーサーによるマイクロバブルの作製と標識

マイクロバブル破壊（UTMD）ターゲット超音波検査は、心臓や肝臓などの超音波にアクセス可能な臓器を標的とする治療用遺伝子を含む生理活性分子の部位特異的送達を、、、指示するために使用することができます。...

超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

学ぶ高せん断均質化とシリアル濃縮による脂質系酸素マイクロバブルエマルジョン製造法。遠心分離で90%酸素含有率を達成し、2リットルの大量生産が可能な医療用酸素供給技術を習得する。

濃縮された高せん断均質化およびシリアル濃度によって脂質系酸素マイクロバブルエマルジョンの製造

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