高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

この手順の全体的な目標は、細菌の細胞分裂中のタンパク質FTSZの動的変化を観察することです。これは、FTSを発現する微妙なバチルス細胞をGFP融合と言い換える小さなアロスパッドの表面に適用することによって達成されます。次に、パッドを反転させ、ガラスカバーのスリップボトムを備えたペトリ皿に移します。

2番目のステップは、3D構造化照明顕微鏡または3D SIMイメージングシステムを使用して、細胞分裂中の細菌のタイムラプス画像を取得することです。次に、生データの品質を評価し、光退色による強度の低下が30%を超える画像を破棄します。最後のステップは、F-T-S-Z-G-F-Pタンパク質の蛍光強度分布を経時的に測定することにより、細胞分裂中のタンパク質局在の変化を定量的に解析することです。

最終的には、高速3D SIMを使用して、細菌の細胞分裂中にジオンタンパク質がどれほど動的であるかを示します。この技術が共焦点顕微鏡のような既存の技術よりも優れている点は、生命細胞の細胞分裂で起こる変化について3次元の情報が得られることです。この方法は、細菌の細胞質分裂に関する洞察を提供しますが、M哺乳類細胞など、動的なタンパク質変化を調べたい他のシステムにも適用できます。

私たちが最初にこのアイデアを思いついたのは、固定された細菌細胞の従来の3Dシミュレーション画像が、FDZタンパク質がゼドリングの周囲に均一に分布していないことを示したときでした。この分布が、Zed環の狭窄中に発生した変化に関連しているかどうかをさらに調べたいと考えました。一般に、この手法に不慣れな個人は、オイルの屈折率をサンプルに一致させないために苦労し、これにより画像の品質が低下します。

イメージング用のBacillus Subtlest細胞を調製するには、テキストプロトコルに詳述されているように、細胞を中期指数相まで増殖させます。次に、まず薄いポリエステルシートをはがして、標準的なガラス顕微鏡スライドに接着フレームを取り付けます。次に、フレームの露出した接着面を顕微鏡スライドの表面に塗布して、スライドの上に正方形のウェルを効果的に作成し、フレームに厚いポリエステルシートを取り付けたままにして、後続のステップでカバースリップが付着するのを防ぎます。

次に、溶かしたアロの67マイクロリットルのピペットが接着剤フレームに沸騰するまで、電子レンジでアロ溶液を溶かします。すぐにアロスの上にカバースリップを置き、平らな面を作り、室温で5〜10分間放置します。サンプルを採取している間、カバースリップを1〜2分間取り外します。

8, 000 RPMで遠心分離した後、サンプルの1ミリリットルのアリコートを収穫し、上清を新鮮な媒体の200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。濃縮されたサンプルの2.5マイクロリットルを取り、事前に準備されたarosパッドにピペットで移します。サンプルをアロスパッドの平らな面に沿って均等に広げます。

次に、arosパッドに触れずにピンセットを使用して顕微鏡スライドから接着フレームを取り外します。アロスパッドを顕微鏡から移します。ガラスカバーのスリップボトムが付いた直径35mmのシャーレにスライドさせます。

高解像度イメージング用。細胞懸濁液がペトリ皿のカバースリップに接触するように、arosパッドを反転させます。実験当日は、イメージングの少なくとも1時間前にOMX 3D SIMイメージングシステムの電源を入れ、システムとレーザーが完全に安定するようにします。

次に、マスター・コントローラー・ワークステーションのテキスト・プロトコルにリストされているさまざまなコンポーネントをオンにします。アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを開きます。データ保存用のファイルパスを適切なデータフォルダに設定します。

次に、ソフトワークソフトを起動します。メイン画面の光パラメータセクションで実験に必要なレーザーをオンにします。チャンネル選択からFITCカメラをアクティブにし、テキストプロトコルにリストされているパラメーターの確認に進みます。

対物レンズの上部にオイルを一滴垂らします。調製した細胞を含むサンプルペトリ皿をステージインセットに入れ、円形の加熱蓋で覆います。オイルがサンプルシャーレの底に触れるまでステージを下げますtage。

皿を15分間加熱平衡化させます 低露光設定のステージで、ナノポジショニングステージコントロールを使用してサンプルに焦点を合わせます。サンプルを上下にピントを合わせて、光がサンプルの焦点面の上下に均等に広がっているかどうかを判断します。次に、0.5ミクロンのステップサイズを使用し、画像スタックの上部と下部をマークしてから、実験タブでサンプルの中央に戻り、[厚さを取得]ボタンをクリックしてサンプル取得の厚さを設定します。

現在の露出と透過光の割合の設定で、サンプル画像の最大強度値を決定します。この値は、画像ウィンドウの下にあります。タイムラプスイメージングの場合は、露出と透過光の割合を調整して、最大強度を1100〜1400にします。

背景の上。画像については、[実験]タブの[タイムラプス]セクションをアクティブにします。必要なフレームレートと合計時間をデータファイルに設定します。

適切なファイル名を入力します。実行ボタンをクリックすると、画像取得の開始時に画像取得が開始されます。時系列の最初のフレームの画像取得の開始時の画像の最大強度値に注意してください。

最初のフレームの集録終了時に、この最初のフレームでZackを介した信号強度が10%以上減少していないことを確認します。時系列の集録が終了したら、結果の raw 画像ファイルに DV 接尾辞を付けて開き、時系列の開始から最終画像までの最大信号強度の減少を確認します。プロセスメニューから30%以上の写真の漂白が発生した時点を破棄し、SI再構築ウィンドウをアクティブにします。

すべてのパラメータに既存の設定を使用します。使用チャンネル固有のOTFボタンを有効にし、標準フィルターセットに設定します。使用チャンネル固有のKOアングルボタンをアクティブにして、標準フィルターセットに設定します。

未加工のファイルを入力ファイル空間にドラッグアンドドロップします。[実行]をクリックします。Z リングの周りの FTSZ の分布を調べて、3D 強度プロットを作成します。

次に、3D画像ファイルを開きます。個々の z スライスを表示します。表示メニュータブの下にあるボリュームビューアツールを使用します。

対象領域を切り抜くには、この 3D 画像のウィンドウ番号を入力ウィンドウに入力し、新しい未使用のウィンドウ番号を出力ウィンドウに入力します。領域選択ボタンは、元の40 x 40ミクロンの視野から個々のZリングをトリミングするために使用できるようになります。[回転]タブで目的の軸と回転角度を調整します。

「do it」ボタンをクリックします。ボリュームをスクロールして、目的のパースペクティブであるZリングを取得します。データ インスペクター ツールを使用して列行のサイズを調整し、個々の Z リングの周囲に新しい関心領域を作成します。

画像の中央をクリックして、この新しい関心領域を配置します。テキスト画像データは、関心領域内の各ピクセルの蛍光強度を表示する自動生成されたテーブルです。3Dグラフボタンをクリックして、強度プロットを最初に表示します。

または、テーブルデータの保存ボタンをクリックしてテキスト画像データをエクスポートすることもできます。ファイルメニューで、保存したテキストファイルから画像データを新しいスプレッドシートにコピーします。スプレッドシート内のすべてのセルを選択し、新しい 3D 曲面グラフを作成します。

タイムラプス データの公開用に 3D 強度プロット グラフを書式設定します。3D 画像ファイルの異なる各時点で、これらの手順を繰り返します。従来の広視野蛍光顕微鏡で可視化すると、Zリングは微弱菌の蛍光の単一の横バンドとして現れます。

このバンド全体の蛍光強度は均一です。ローカリゼーションパターンは、ここでリング内のFTSポリマーの構造構成と分布についての洞察をほとんど提供せず、同じ細胞が調べられます。FAST 3D sim方式を使用します。

3Dシミュレーション画像をZ軸を中心に回転させることで、Zリングを3次元空間における本物のリング構造として可視化することができます。分解能の向上により、リング内のFTSZの不均一分布を可視化することができます。この手法で可視化されたバチルスZ環のその他の例は、Z環の周囲の蛍光強度が決して同じではないことを示しています。

さらに、非常に低い蛍光強度またはギャップの領域が観察されます。これらの観測値を定量化するために、Zリングの3D強度プロットを作成しました。強度プロットは、蛍光の量がバチルスの最も微妙なZリングの異なる領域で最大4倍に変化する可能性があることを示しています。

3D強度プロットは、ギャップがZリング内で発生する動的変化を分析するために、バックグラウンド蛍光のベースラインレベルをほぼ読み取っていることを示しています。時間が経つと、3Dシミュレーションのタイムラプスが実行されます。この動画では、バチルス・サトルZリング内のFTSZが絶えず変化し、画像ごとに生成される強度プロットで測定されている様子をご覧いただけます。

このビデオを見れば、細菌細胞を成長させて準備する方法、3D Simを使用して細菌細胞を画像化する方法、それらを分析して定量的データを取得する方法、そして最後にプレゼンテーション品質の画像を提供する方法についてよく理解できるはずです。画像取得中は、細胞の健康状態を監視し、取得中の蛍光タンパク質の発現レベルを監視することが非常に重要です。この技術は、細菌細胞生物学の分野の他の人々が他の超解像顕微鏡法を使用し、他の細菌タンパク質を異なる生物に局在させる道を開きました。

この手順に続いて、光活性化局在化顕微鏡などの他の形態の超解像顕微鏡を実行して、FDSタンパク質の経時的な動的変化を調べることができます。