Name: 高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 学ぶ高速3D-SIMを用いたBacillus subtilisの細胞質分裂におけるFtsZタンパク質の動態解析法。この超解像顕微鏡技術により、Zリングの立体構造とタンパク質分布の時間変化を可視化し、細菌細胞生物学研究に応用できます。

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著者は、株と抗体の贈り物に対して、P. Levin、S. Moriya、S. Foster、およびM. Pinhoに感謝します。また、L. Ferrand、P. Goodwin、J. Cooper、B. Dougherty の各氏には、専門的な技術支援をいただいたことに感謝します。CBWは、オーストラリア国立保健医療研究評議会のシニアリサーチフェローシップ(571905)によってサポートされています。LTは、UTS Chancellors Postdoctoral Fellowshipの支援を受けました。MPSとATFLは、Australian Postgraduate Awardsの支援を受けました。この研究は、EJHに対するオーストラリア研究評議会ディスカバリープロジェクト助成金(DP120102010)によって支援されました。

1試料の調製<ol><li> Bの準備イメージングのための枯草菌細胞 <ol><li> Bの単一コロニーPenassayブロス（抗生物質中3としても知られているPAB）の10ミリリットルを接種するズブチリス株 SU570（168 TRPC2のFtsZ ::のFtsZ-GFP-仕様 ）16。 30℃で低速（100 rpm）で振とう機中で一晩培養する。 </li><li>高速（215 rpm）で振とうしながら30℃で新鮮なPABに0.05 600（600 nmで測定した吸光度）に一晩培養を希釈し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。 </li><li>スクリューキャップのガラス瓶に100ミリリットル1×増殖培地（PAB）での電気泳動グレードのアガロースの2グラムを追加します。オートクレーブでアガロースを溶解する。これは、数ヶ月間、4℃で保存し、必要に応じて、アガロースを溶融させるマイクロ波処理することができる。室温に設定できるようにします。 </li><li>標準GLA上に、接着剤をフレーム（ 材料の表を参照してください65μlの容量）を取り付けssの顕微鏡スライド。これを行うには、薄いポリエステルシートを取り外します（各接着フレームが2ポリエステルシート、薄い1と厚い1との間に位置し、正方形の取り外しセンターがあります）と、顕微鏡スライドの表面にフレームの露出した粘着面を適用します。これは事実上のスライドの上に四角いうまく作成されます。これはその後の工程でそれにこだわってカバースリップを防止するようにフレームに取り付けられた厚さのポリエステルシートのままにしておきます。 </li><li>接着剤フレームに67μlの沸騰ピペットまで電子レンジでアガロース溶液メルト。すぐに平坦な表面を作成し、5〜10分間室温で残すように上にカバースリップを配置。サンプルが採取されている間1〜2分間、カバースリップを削除します。 </li><li> 30秒間5,900×gで、サンプルと遠心分離機の1ミリリットルのアリコートを収穫。上清を除去し、200μlの新鮮なPABにペレットを再懸濁します。 </li><li>事前prepaに濃縮サンプルピペット2.5μlのを取る赤アガロースパッド。アガロースパッドの平らな面に沿って均等にサンプルを広げた。アガロースパッドに触れずにピンセットを用いて顕微鏡スライドからの接着フレームを削除します。 </li><li>カバーガラスの底直径35mmのペトリ皿に顕微鏡スライドからアガロースパッドを転送します。ペトリ皿の細胞懸濁液とカバーガラスとが直接接触するようにアガロースパッドを反転させる。ペトリ皿の底には、高分解能イメージングのための1.525の屈折率を有する。 </li></ol></li><li>ライブS.の調製イメージング用ブドウ球菌細胞<ol><li> S.の単一コロニーをLブロス10mlに接種黄色ブドウ球菌株のSA94（鋤-のFtsZ-GFPおよびpGL485を含むSH1000あり、r ERMは、のCm r）の25。 37℃での低速（100 rpm）でロータリーシェーカーで一晩培養する。 </li><li> 0.05のIPTG（イソ新鮮なL-ブロス中0.05 600（600 nmで測定した吸光度）の一晩培養物を希釈融合タンパク質の産生を誘導するためプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）。 </li><li>高速（215 rpm）で振とうしながら37℃で培養し、中期対数期（600〜0.4）まで成長する。 </li><li> Bについて説明したように1.1.8 - 1.1.3、手順に従ってください枯草生細胞調製物。 注：誘導性の制御下に蛍光融合タンパク質を発現する菌株について、ステップ1.1.3にアガロース溶液に誘導物質の適切な濃度を追加します。 </li></ol></li></ol>顕微鏡の調製このメソッドは、ブレイズモジュールを装着しDeltaVision OMX（光学顕微鏡、実験的な）3D-SIMイメージングシステムを使用しています。記載される実験のために、唯一つのレーザとつのカメラが使用される。照明光路は、 図1に記載されている。この方法では、顕微鏡は、適切な較正、光学伝達関数（OTF）を有していることを前提としファイルや光視準メンテナンスを実施。 <ol><li>生細胞イメージング実験のために、加熱ステージを対物（60X 1.42のNA油浸対物）に取り付けられ、セラミックステージと客観加熱の襟に接続されていることを確認してください。 </li><li>イメージングは​​少なくとも4時間前に、客観的かつ段階のヒーターの電源を入れ、ゆっくりと5℃/時間の最大レートで必要な設定温度をランプアップします。これは、画像化の前に、夕方、このプロセスを開始し、3℃/ 4時間で上昇することをお勧めします。 Bとの生細胞実験のために枯草菌は 、ほとんどの実験は30℃で実施されている。 S.のために黄色ブドウ球菌は 、全ての実験は37℃で行われる。 </li><li>実験の日に、システムおよびレーザーが完全に安定するまで画像化の前に少なくとも1時間電源を入れます。予熱する加熱されたステージに小皿段階インサートをロードします。 <ol><li>マスタコントローラワークステーションの電源を入れます。 </li><li>画像処理WORKSTATをオンにしますイオン。 </li><li>顕微鏡柵の外階にあるカメラのクーラーの電源をオンにします。 </li><li> （これらはすべて使用されませんが）sCMOSカメラのすべての電源をオンにします。 </li><li>レーザーと電子エンクロージャの内部には、オンに： <ol><li>インストゥルメント·コントローラシャーシ。 </li><li> Nanomotionシャーシ。 </li><li> Zピエゾのためのイエナコントローラ。 </li><li>すべての4ガルボモータコントローラ。 </li><li>一次レーザ制御モジュール。 </li><li>二次レーザ制御モジュール。 </li><li>すべてのカメラワークステーション。 </li><li> OMXICワークステーション。 </li></ol></li><li>マスタコントローラワークステーションで、アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを開きます。適切なデータのフォルダに保存するデータのファイルパスを設定します。 </li><li>ハードウェアを初期化するには、 ハードウェアのメニューに移動し、ハードウェアを選択し、 再起動ハードウェアのボタンをクリックします。ウィンドウを閉じる。 </li><li> 4（実験に必要なレーザーにsoftWoRx software.Turnを開始88）である。 </li><li>レーザー安全インターロック用のキースイッチをオンにします。 </li><li>正しいのダイクロイックフィルタ引き出しが目的の下に挿入されていることを確認。 GFPのためには、標準（または固定）引出しである。 </li><li> OMX SFでは、[ファイル ] メニューから[ 設定]を選択し、 引き出しドロップダウンメニューから固定ドロワーを選択します。ウィンドウを閉じる。 </li><li> ライトパラメータ]セクションで、ソフトウェアのメイン画面から次の操作を行います。 <ol><li> チャンネル選択からの励起レーザーおよび発光フィルター（FITC）カメラに適したカメラをアクティブにします。 </li><li> モードが シーケンシャルに設定されている画像を確認してください。 </li><li> 光路が SIに設定されている確認してください。 </li><li>チェックモードが 95 MHzに設定されています。 </li><li> 488レーザー励起で選択されて確認してください。 </li><li>設定する<stroNG&gt; 1×1のウィンドウサイズとビニングのための512×512サイズ。 </li></ol></li><li> 実験タブで、 タイプドロップダウンメニューからSIに設定されていることを確認。 </li><li> セクショニングがアクティブになっていることを確認し、 光学部の間隔は、0.125に設定されていること。 </li><li> スキャン開始が 中間のときのフォーカスポイントを確認してください。 </li></ol></li></ol> 3画像取得<ol><li>対物レンズの先端にオイルを一滴を適用します。 37°Cの場合、推奨される原料油は最高37℃で細菌細胞をマウントするために使用されるゲルパッドの屈折率と一致するように1.518の屈折率を有し（ ステップ1.1.3参照）。 </li><li>ステージインセットに準備された細胞を含む試料ペトリ皿を置き、円形の加熱蓋でカバーしています。オイルの底に触れるまで、ステージを下げサンプルペトリ皿。 </li><li>料理は段階で15分間加熱し、平衡化することを許可する。 （ ライトパラメータセクションにあります）5ミリ秒以下の低露出の設定を使用して、（ ナノ位置決め部に位置dZと 、）ナノ位置決めステージコン ​​トロールを使用してサンプルに焦点を当てる。アップフォーカスダウンサンプルを通る光が均等にサンプル焦点面の上下に広がっているかどうかを判断する。点広がり関数は、偶数（球面収差）でない場合、試料皿クロロホルムで対物レンズの底をきれい。油を変更し、適切な一致が、球面収差を最小限に抑えるために、石油·サンプルの屈折率との間で発見されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li> 0.5μmのdZとステップ·サイズを使用して、画像スタックの頂部および底部をマークする。サンプルの中央に戻ります。サンプル取得の厚さを設定するための実験タブのGet厚ボタンをクリックします。ケーP Zリングの上部と下部を切断しないように注意している間最小限にスタックの高さ。 B.の典型的な厚さ枯草菌のサンプルは2〜3μmのです。 </li><li>現在のエクスポージャーおよび％Tの設定でサンプル画像の最大輝度値 （Max） を決定します。この値は、イメージウィンドウの下に発見された。タイムラプスイメージングのために、イメージのバックグラウンドを超える1,100-1,400の最大強度を得るために、 露出および％Tを調整します。千上記の背景の最小強度は、画像再構成を得るために必要とされる。一回限りの画像の場合、4,000〜5,000に最大強度を増加させる。 </li><li> 実験タブでタイムラプスセクションをアクティブにします。必要なフレームレートと合計時間を設定します。 データファイルで、適切なファイル名を入力します。画像取得を開始するために[実行 ] ボタンをクリックします。 注：画像取得が完了したときにグラムREEN プログレスバーが終了し、ログファイルには、適切なデータのフォルダに設定されたデータのために表示されます。 </li></ol>データ品質のチェック4。 <ol><li>画像取得の開始時に、時系列の最初のフレームのための画像取得の開始時に画像の最大輝度値を確認します。最初のフレームの取得の終了時に、この最初のフレームのためのzスタックを介してシグナル強度が10％低下以上に存在していないことを確認する。最初の時点で光退色このレベル以上あった場合、時系列を介したデータは、分析のために不十分な品質のものとなり、時系列の取得を停止することができる。 </li><li>時系列の取得の終了時に、といった拡張子得られた原画像ファイルを開き、最終的な画像の時系列の先頭から最大信号強度の減少を把握する。蜂が持つ任意の時点を捨てるnは30％以上の光退色。 </li></ol> 5。再構築、3D-SIM像<ol><li> Processメニューから、SI再構成ウィンドウをアクティブにします。すべてのパラメータのための既存の設定を使用します。 </li><li> 利用チャネル固有OTFボタンをアクティブにして、 標準のフィルタセットに設定されています。 KOボタンを角度および標準フィルタセットに設定を使用してチャンネルの特定をアクティブにします。 </li><li> 入力ファイル·スペースにファイル（の.Dv）生をドラッグ＆ドロップします。 それを行う ]をクリックします。 _SIと入力ファイルが最後に追加されたように、出力ファイルは同じ名前になります。 注：複数のファイルが処理される場合、この再構成プロセスは、 プロセス·メニューからタスクビルダ機能を使用してタスクとして実行することができる。 </li></ol> 6。データのエクスポートおよび分析<ol><li>モードとexを上回るに3D画像を視覚化するImarisを使用して、TIFF（300 dpi）のまたはAVIファイル（圧縮なし）としてポート画像データ。 Imarisサイズ測定は上回るモードでの測定ツールを用いて行うことができる。 </li><li> 3D-SIM画像データからZ環の3次元の強度プロットを生成する。 <ol><li> Zリングの周りのFtsZの分布を調べ、3D強度プロットを作成する<ol><li>個別のz軸のスライスを表示するには、3D画像ファイルを開きます。関心領域をトリミングするビューメニュー]タブの下にあるボリュームビューアツールを使用します。 </li><li>入力ウィンドウに、この3D画像用のウィンドウ番号を入力し、出力ウィンドウに新しい、未使用のウィンドウ番号を入力してください。地域を選択ボタンは、ビューの元の40×40μmのフィールドから関心のある個別のZリングをトリミングするために利用可能になります。 </li><li>回転タブで目的の軸と回転の度合いを調整します。それを行う]ボタンをクリックします。 Zリングの所望の視点を得るために、ボリュームをスクロールします。 </li><li>データインスペクタツールを使用とtを調整彼の列/行の寸法は、個別のZリングの周りに関心のある新しい領域を作成します。この関心新しい領域を配置するために画像の中心をクリックします。テキスト画像データは、関心領域内の各画素の蛍光強度を表示し、自動的に生成されたテーブルである。 </li><li>最初は強度プロットを表示するには、3Dグラフ]ボタンをクリックします。 </li><li>別の方法として、テキスト画像データは、ファイルメニューで保存するテーブルデータ]ボタンをクリックしてエクスポートすることができます。 </li><li>新しいスプレッドシートに保存されたテキストフ​​ァイルから画像データをコピーする。スプレッドシート内のすべてのセルを選択して、新しい3Dサーフェスグラフを作成します。出版物のための3D強度プロットグラフをフォーマットします。 </li></ol></li><li> 3D画像ファイルとは別の時点のそれぞれに6.2.1.7 -時系列データの繰り返しの場合は6.2.1.1を繰り返します 。 </li></ol></li><li>時間にわたる平均蛍光強度の追跡<ol><li> fluorescenを追跡するために、テキスト、画像データを使用する関心領域の経時CE強度。 </li><li>関心領域に対応するセルを選択します。 </li><li>この関心領域についての各時点での平均蛍光強度を算出する。 </li><li>独立した折れ線グラフを生成するために、平均蛍光強度値を使用します。 </li></ol></li></ol>

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蛍光ライブセルイメージングは​​、時間とともに細胞内の動的変化の観察を可能にする強力なツールです。細菌細胞生物学のライブイメージングは​​小さいため、セルサイズが挑戦されて励起光への反復曝露に耐える細菌細胞の能力が低下している。 F3D-SIMは、すべての細胞生物学を調べるために利用可能なツールを拡大してきましたが、それは不十分な実装されていればアーティファクトが導入することができるように、慎重にこのテクニックを行う必要がある。この技術の使用の成功のための重要な考慮事項がいくつかあります。それが放出された光の点広がり関数の使用に依存広視野蛍光イメージング法であるように、放出された光の屈折率不整合と球面収差が正確な画像再構成を可能にするために避けなければならない。高品質0.17ミリメートルの厚さのカバースリップの使用は、カバーガラスの厚さのばらつきによる信号強度の変化を避けるために唇を強くお勧めします。これは、慎重にすべての実験の初期段階の間に放出される光の球面収差を評価し、必要に応じて、液浸油の屈折率を調整することが非常に重要である。それは、温度と試料の封入剤/基板の両方に依存しているので、これは、日常的に異なる場合があります。間違ったオイルの使用は、ハローやエコー信号などのアーチファクトを有する画像の劣っ再建になります。 画像再構成プロセスの最後に、各相毎に再構成の品質の尺度は、照明の各相/角度「KO角に対するベストフィット」することによって得ることができる。この値は、各角度は1未満である場合には、再構成された品質がおそらく高くなる。この値が6を超える場合には、再構成画像は、アーチファクトを含むことになる可能性が最も高い。コモンアーティファクト）が対応して、画像内のストライプの外観を私を含むグリッドの角度のいずれかに。これは、グリッドの角度から低い信号から生じ得る。 ⅱ）構造体の周囲ハローイング。これは周囲の構造に比べて明るい構造からの信号の非常に不均一なレベルに起因する、オイルの屈折率の不整合およびサンプルやイメージがするのに十分な「構造」を含むすぎ非晶質ではなく、中の構造が原因である可能性がありアルゴリズムによって認識;通常、高いバックグラウンド信号を、画像内のノイズ比の低い信号から生じるiii）の「蜂巣 &#39;; iv）はオイルによる試料の屈折率不整合にすることができる延伸/のxyに細長い構造。このアーティファクトは、不慣れなユーザのために識別することは困難である。それは、この技術の使用を開始するときに、新しいユーザーが読影と分析に関するアドバイスを経験豊富な研究者のSIMに相談することをお勧めします。 全ての蛍光生細胞イメージング実験と同様に、インポートされ慎重に最小限のアーチファクトを有する画像を再構成するために必要十分な発光信号が光退色し、細胞の光毒性の程度を最小限にするために、励起エネルギーの入力をバランスさせるアリ。過度の光退色（シングルzスタック取得全体で30％を超える）は、再構成画像内のストライピングパターンにつながる。 sCMOSカメラを用いて、超解像画像が正常にバックグラウンドより上のカウント数千程度の低い放射信号と原画像から再構成することができる。これは、非常に短い露光時間がそれによって光退色を低減し、各フレームの迅速な捕捉を可能にするために可能にすることができる。また、細胞が励起エネルギー入力から回復するためのフレーム間の時間の量を増加させる。各個別のフレームのキャプチャ時間は非常に短くすることができるように、さらに、個別の取り込み中に「モーションブラー」によって導入されるアーティファクトの程度は、この方法を用いて低減される。 このバリ3D-SIMのationは、細菌の細胞生物学者のライブイメージングのための他の利用可能な超高解像度イメージング技術よりも、他の多くの利点を提供しています。サンプルにすべての3次元で解像度が2倍の増加とイメージする能力、最大30ミクロンは、実験中に全体の細菌（および哺乳動物）細胞の画像化を可能にします。一般的にエバネッセント波で行われているような単一分子の局在化などの技術は、サンプルへの浸透の深さを達成することはできませんし、細胞全体についての情報を提供していません。この技術のためのより高いサンプリング深さを可能にする最近の進歩は、細胞全体のより良い距離分解能になることがあります。さらに、取得する原画像の数千を必要単一分子局在化技術は、空間分解能が依存するように、捕獲することができ、キャプチャフレームレートと究極達成空間分解能との間の妥協を必要とすることが、フレームレートが制限されている前夜の数規定された空間内に記録NTS。キャプチャされたフレームの数を減らすと、より低い空間分解能をもたらすが、目的の生物学的プロセスに必要な時間分解能を達成するの​​に十分であり得る。フレーム間の回復時間の量は、それによって、時系列を得ることが可能な期間および頻度を制限する生細胞における毒性を最小限にするために増加する必要があるかもしれない。そのような電子顕微鏡（EM）または電子cryotomographyなどの高解像技術（ECT）オファーは、3D-SIM（​​および他の超解像光顕微鏡技術）上の解像度を増加したが、固定したサンプルを実行する必要があります。固定及び処理がアーティファクトを導入する可能性およびラベリングの欠如は解釈が困難になる場合があります。ラベルフリーECTが悪いコントラストを有し、周囲に500から200 nmの24のサンプルの浸透深さを達成することができるので、目的のタンパク質が同定できたとしても、全細菌細胞中のタンパク質の構造を観察することはできない。標識は、免疫金と同様に、EMで使用することができる場合であっても、イメージングは​​、2Dのみで行われる。 3Dは、薄い切片とセクションの計算再建のみ達成可能である。薄い切片は、経験豊富な技術者が必要ですが、問題が発生するとアーティファクトにつながることができます。生細胞または固定細胞で、3D-SIMは、特定の様式で埋め込まれると、細胞が急速に近い天然の状態で画像化のために調製することができる必要はない。 この方法では、蛍光顕微鏡での最小限の経験を持つ研究者によって実施が比較的容易である。実験は、それが過度のバックグラウンド信号を発するか発生しないように、健康な細胞機能をサポートする媒体中で行うことができる。細菌細胞の場合、これは複雑で、最少培地又は細菌細胞の運動性を制御するための固体または半固体培地の使用の多くの種類の使用を可能にすることができる。すでに蛍光タンパク質（FP）の融合を設計しそれらの機能をテストしている多くの生物学者これらの融合は、新しい光活性化、FP融合でさらにエンジニアリングおよび検証されずに、急速にこの技術を取ることができます。私たちは、一般的な観察 ​​として、見られるS.黄色ブドウ球菌は、Bより、FP融合で撮像中に光退色をより受けました枯草菌 。グリッドパターンは、物理的な格子によって生成された独自の3D-SIM法を用いて、S.数と生細胞イメージングを行うことができなかった黄色ブドウ球菌 、FP融合。しかし、この高度なF3D-SIM法では、これらのFPの融合イメージすることができたし、これらのタグ付きタンパク質のダイナミクスをキャプチャするために、短い時系列を実行します。これはおそらく画像形成に必要な縮小露光時間によるものであり、細胞の回復のためのフレーム間の時間を増加させた。 OMXブレイズ3D-SIMは、比較的容易に、単一の実験室またはコアイメージング設備に実装することができる商業的に利用可能な技術である。ケア人工を回避するための技術を実行するように注意しなければならない貧弱な試料調製や貧弱な画像キャプチャのための事実。技術が習得されると、細菌などの小さな生物におけるタンパク質の構造およびダイナミクスの研究は、単色または多色の蛍光を行うことができる。

異なるイメージング技術の数は、さまざまな電子及び光学顕微鏡技術を含む細菌を研究するために長年にわたって使用されてきた。電子顕微鏡は、非常に高い解像度を提供しながら、ナノメートルまで、真空および造影剤の使用の必要性が固定され、埋め込まれた標本にこの技術を制限している。アーチファクトに起因長い試料調製及び当業者にも導入することができるサンプルを調製し、得られた画像を分析し、解釈するために必要とされる。光学顕微鏡は、より単純なサンプル調製および電子顕微鏡に比べて比較的容易に複数のラベルを適用することの利点を提供しています。蛍光タンパク質および色素コンジュゲートを使用して、蛍光顕微鏡で生細胞を研究する能力もまた可能である。フルオロフォアの安定性と蛍光タンパク質サイズ/構造の改善低下細胞毒性をもたらすだけでなく、カメラの検出？と思ったらにおける進歩広視野および共焦点イメージングシステムを用いて、学問、蛍光顕微鏡を大幅細胞の空間動態の理解を拡大している。これらの技術を使用して、過去20年間の細菌細胞の私たちの知識は、細菌細胞1内の構造やタンパク質、組織の高いレベルを明らかにし、はるかに詳細な図にも大きく進んでいる。 しかし、光学顕微鏡の従来の方法は、固有の解像度が使用される励起光の波長の約半分であることを意味し、回折限界である。したがって、さらに最も最適な従来の光学顕微鏡システムを用いて、最良の横方向の解像度が約220〜250ナノメートルであり、軸方向の分解能は約500nmである（総説についてはSchermelleh ら 2参照）。特に細菌の細胞生物学者は、これはまだ深刻なこれらの小さな細胞の空間的構成の理解を制限します。 DIAMにわずか1〜2程度であることETER、長さが1〜10μmの。タンパク質の動的空間挙動が、インビトロのデータに補完するように分析することができる生きた細胞で行うことができる高解像度技術も必要である。 過去10年間、いくつかの超解像蛍光イメージング技術が開発されている。超解像顕微鏡は、従来の光学顕微鏡を用いて得られる少なくとも2倍、横方向の解像度が、それによって、回折限界を克服するイメージング技術を説明しています。これらの技術は、見かけの解像度の実質の増加を作成するために放出される光の照明および/または分析を操作します。超解像技術の3つの主要な種類がまだあり- i）の放出の枯渇顕微鏡3（STED）を刺激し;そのような光活性化ローカライゼーション顕微鏡4,5（PALM）、確率的光学再構築顕微鏡法などの技術を含むⅱ）単一分子の局在顕微鏡、 <s&gt; 6（STORM）まで、直接STORM 7（dSTORM）、および個別の分子復帰8（GDSIM）と基底状態の欠乏;およびiii）構造化照明顕微鏡9-12（SIM）。単一分子の局在技術は、生物学的サンプル中のダウンnmの10〜40の間に、横方向の解像度で最大の増加を提供しています。単一分子局在化顕微鏡法の多くの実装では、サンプリングの深さは、エバネッセント波に制限され、STEDの最初の実装はまた、サンプリング深さが制限された。しかし、放出された光の軸方向位置を推測するために二つの目的を用いた最近のこのような適応光学系の使用のような進歩は、異なる焦点位置での点広がり関数における非点収差の利用、マルチプレーン検出とは、軸方向の両方における改善を見ているSTEDと単一分子の局在13,14の両方の分解能とサンプリングの深さ。 STED用のデータ収集レートと単一分子の局在化技術原因（ローカリゼーション技術アップ50,000）の最大解像度で取得する必要がある大量の画像に対しても比較的遅い。この遅いデータ収集は、多くの場合、非常に高価でカスタム変更することなく、生試料のイメージングに適していない。これら二つの技術は現在、最適（レビューのために2,15を参照）固定したサンプルに適していますが、多くの仕事は、この制限に対処するために行われています。 三次元構造化照明顕微鏡（3D-SIM）は、それぞれ約110および280nmの決議結果として両側面と軸方向の解像度を向上させ、広い視野技法である。サンプリングの深さは、全細胞の画像化を可能にする、カバースリップから30ミクロンまでである。光学顕微鏡実験（OMX）プラットフォーム上セダト、AGARD、およびGustaffssonによって開発された3D-SIMの変化が異なる15内に移動される既知のグリッドパターンを試料に照射することを含む各z平面9-11の位置。観察可能領域外周波数空間で作成された結果として生じるモアレパターンの縞を測定する。周波数空間からの情報は、可視超解像画像10,11を生成することは、計算、再構成されている。生の画像は、この技術を用いて取得することが可能な相対速度は、生細胞のイメージングを可能にする。しかし、それは秒の時間スケールで発生する生物学的プロセスのために、生の画像の取得率は依然として動的な変更をキャプチャするには遅すぎることに注意することが重要です。秒の捕捉率との時系列については、十分な回復時間なしで繰り返さ買収は、特に小さな細菌細胞のライブイメージングの間に、光毒性および光退色につながることができます。 これらの問題を克服するために、高速な3D-SIM（​​F3D-SIM）のための最近の進歩が開発されている。ここでは、私だったOMXブレイズ16として知られているものを説明しますこの技術は、以前のシステムで使用されたような物理的なグリッドを使用することなく、パターン化された照明は、後半に2011年に作成されますntroduced。光束と新しいシャッター技術干渉の使用は非常に急速な方法で、試料上のパターン化された光の生成を可能にする。既存のEMCCDカメラと比較した場合、画像取得の速度はさらに、特に、科学的な相補型金属酸化膜半導体（sCMOS）カメラの導入により増強された。これらの変更は、秒16以内に起こる細胞内の動的な変更の監視を可能にする、1ミクロン（512×512ピクセル、9のzスライス）のサンプリング深さのために、毎秒1フレームの可能な画像取得速度をもたらした。この方法を用いて細胞を生きて見かけ上のエクスポージャーの減少（励起）時間が延長された時間キャプチャするシリーズまたは捕捉率の増加のいずれかを可能にする。 ここでは、examinするF3D-SIM顕微鏡の適用を記述する電子構造と2細菌種の細胞内の細胞質分裂のZリングのダイナミックな動き：棒状のモデル生物の枯草菌と球形ヒト病原体黄色ブドウ球菌 。 FtsZは、細菌17,18における細胞分裂に重要な役割を果たしているチューブ状の細胞骨格タンパク質である。これは、分割装置17,18を形成する、少なくとも20の他の分割のタンパク質をリクルートする分割部位に局在し、細胞収縮19-23力を提供すると考えられている。この方法は、不均一のFtsZはビーズ状配置の両方の生物におけるZリングの周りに分布していることが明らかになった。クライオ電子断層撮影（ECT）24によって示唆されるように、従来の広視野蛍光顕微鏡、または不連続構造によって可視化されるように、Zリングは、セルの周囲に連続均一ベルトであるかどうかの長年の問題を解決することができる。私たちは、3D-SIMの能力は非常に小さな（1の空間的検査を改善する方法を示してミクロン径）S.のような丸い細胞3つの連続した垂直な平面（x、y、z）とに分割球菌 。これらの技術を用いてタイムラプス研究は、Z環の構造は、環内に、かなりのFtsZ分子が固定された足場24の内外に移動するよりも総組織変化と、動的であることを示している。

<table><tbody><tr><td>アガロースI(バイオテクノロジーグレード)</td><td>AMRESCO</td><td>0710-500G</td><td>2%アガロースパッドの構築に使用されます。マイクロ波を使用して、成長培地にアガロースを溶解します。</td></tr><tr><td>N-(3-トリエチルアンモニウムプロピル)-4-(6-(4-(ジエチルアミノ)フェニル)ヘキサトリエニル)ピリジニウムジブロミド(FM 4-64)</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Lipophylic染料は、細胞膜の染色に使用されます。</td></tr><tr><td>1.5 mlマイクロチューブ、ナチュラル</td><td>サイエンティフィックスペシャリティーズインク卒業</td><td>1210-00</td><td>ホモポリマーポリプロピレン製で、アガロースパッド上に置いて視覚化する前に細菌細胞を採取するために使用されます。</td></tr><tr><td>ルリアブロスベース、</td><td>ミラーBD</td><td>241420</td><td>メーカーの指示に従って調製。オートクレーブ後に2%アガロースを添加します。</td></tr><tr><td>BBL抗生物質アッセイブロス、抗生物質培地3</td><td>BD</td><td>210932</td><td>メーカーの指示に従って調製しました。</td></tr><tr><td>粘着フレーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ABGAB-0577</td><td>この会社ではジーンフレームとして知られています。2%アガロースパッド(寸法:15 x 16 mm)の調製に使用します。</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>111512-9</td><td>22×22 No.1 厚さ</td></tr><tr><td>35mm径 ペトリ皿、ガラスカバースリップ底付き</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD35-100</td><td>この会社ではFluoroDishとして知られています。料理:&オスラッシュ;35 mm、ガラス:&Oslash;23 mm、ガラスの厚さ:0.17 mm、非発熱性</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G95</td><td>%エタノールで10 mg / mlのストックを作ります。</td></tr><tr><td>リンコマイシン塩酸塩</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L6004-5MU</td><td>50%エタノールに25 mg / mlのストックを作ります。</td></tr><tr><td>エリスロマイシン</td><td>ベーリンガー マンハイム GmbH</td><td>12390120-14</td><td>95% エタノールで 10 mg/ml のストックを作ります。</td></tr><tr><td>複合軌道/線形振とうウォーターバス</td><td>グラント科学機器</td><td>OLS-200</td><td>培養に使用される振とう速度:215 rpm</td></tr><tr><td>UV可視分光光度計</td><td>島津</td><td>製作所 UV-1601</td><td>600nmの波長は、細菌培養の光学密度を測定するために使用されました。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>細菌培養物のペレットは、指数関数的に増殖する中期培養物を8,000rpmで30秒間スピンダウンすることによって得られました。</td></tr><tr><td>イソプロピル&β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)</td><td>シグマ</td><td>15502-10G</td><td>1 Mストックを準備し、使用前に滅菌をろ過します。</td></tr><tr><td>softWoRxソフトウェア</td><td>、Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td>、バージョン5.0</td><td></td></tr>、<tr><td>Imaris、データ分析ソフトウェア</td>、<td>Bitplane Scientific Software、Bitplane AG</td><td>バージョン7.0.0</td>、<td>Matlab XTensionsには、</td></tr><tr><td>Blazeモジュールを搭載したDeltaVision OMX 3D-SIMイメージングシステムが含まれていました。</td><td>Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td><td></td><td>の Blaze モジュールを OMX V3</td></tr><tr><td>正立蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss Axioplan 2</td><td></td><td></td></tr> に装着</tbody></table>

高速3d-構造化照明顕微鏡（f3d-sim）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のzリングの超解像イメージング

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

蛍光顕微鏡を用いて生物学的試料の画像化は、生試料の超解像を可能にする光の回折の解像度の障壁を克服するための新しい技術と実質的に進んでいる。誘導放出の枯渇（STED）、（例えばPALM、嵐、そしてGDSIMなどの技術を含む）単一分子の局在顕微鏡、および構造化照明顕微鏡（SIM） - 超解像技術の3つの主要な種類が現在ありません。 STEDおよび単一分子局在化技術は、解像度が最大の増加を示したが、これらは、画像取得の増加速度を提供するために遅れている。三次元のSIM（3D-SIM）は、単一分子の局在とSTEDの両方に比べて多くの利点を提供する広視野蛍光顕微鏡法である。解像度は、それぞれ、110および280nmの典型的な横方向および軸方向の解像度で、改善され、カバーガラスから30μm程度までのサンプリングの深さ、を可能にされている全細胞のイメージング。かなりの光毒性および光退色を低減しつつ、原画像の捕捉率を増加させる技術の最近の進歩（高速3D-SIM）は、秒単位で発生する生物学的プロセスの迅速な取り込みを可能にします。ここでは、画像への細胞が分析されるかを示すために蛍光標識された細胞質分裂のFtsZタンパク質およびこの技術が提供できるユニークな情報のタイプを有する細菌細胞をそのような方法の使用を記載している。

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

この手順の総合的な目的は、細菌の細胞分裂中におけるタンパク質FTSZの動的な変化を観察することです。これは、FTSZ-GFP融合タンパク質を発現しているBacillus subtilis細胞を、小型のアガロースパッドの表面に塗布することで達成されます。その後、パッドを反転させ、ガラスカバーガラス底のペトリ皿に転写します。第2のステップは、3D構造照明顕微鏡（3D SIM）イメージングシステムを用いて、細胞分裂中の細菌のタイムラプス画像を取得することです。次に、生データの品質を評価し、光退色により強度が30%以上低下した画像を除外します。最後のステップは、F-T-S-Z-G-F-Pタンパク質の蛍光強度分布の時間的変化を測定することにより、細胞分裂中のタンパク質局在の変化を定量的に分析することです。最終的に、高速3D SIMを用いて、細菌の細胞分裂におけるdioneタンパク質のダイナミクスを明らかにします。共焦点顕微鏡などの既存の技術に対するこの手法の主な利点は、生細胞内の細胞分裂で起こる変化について、三次元的な情報を得られることです。この方法は細菌の細胞質分裂に関する知見を提供しますが、哺乳類細胞などの、動的なタンパク質の変化を観察したい他の系にも応用可能です。私たちは、固定した細菌細胞の従来の3Dシミュレーション画像において、FDZタンパク質がZリング周囲に均一に分布していないことを確認し、最初にこのアイデアを得ました。私たちは、この分布がZリングの収縮中に起こる変化に関連しているかどうかをさらに詳しく調べたいと考えました。一般的に、この手法に不慣れな方は、オイルの屈折率をサンプルに合わせられないために苦労することが多く、それが画像の品質低下につながります。イメージング用に bacillus subtlest 細胞を調製するには、テキストプロトコルに詳しく記載されている通り、細胞を対数増殖期中期まで培養します。次に、薄いポリエステルシートを取り除いてから、接着フレームを標準的なガラス製顕微鏡スライドに貼り付けます。その後、フレームの露出した接着面を顕微鏡スライドの表面に押し当て、スライド上に正方形のウェルを形成します。後続のステップでカバーガラスが張り付くのを防ぐため、厚いポリエステルシートはフレームに付けたままにしておきます。次に、aro溶液を電子レンジで沸騰するまで加熱溶解し、溶解したaro 67 µLを接着フレームにピペットで分注します。直ちにaroの上にカバースリップを置いて表面を平らにし、室温で5〜10分間放置します。サンプルの回収を行う間、カバースリップを1〜2分間取り除きます。8,000 RPMで遠心分離した後、サンプルの1 mL分注液を回収し、上清を除去してペレットを200 µLの新鮮な培地で再懸濁します。濃縮したサンプルの2.5 µLを分注し、あらかじめ準備したarosパッドの上に滴下します。サンプルをarosパッドの平らな表面に均一に広げます。次に、ピンセットを用いて、arosパッドに触れないように顕微鏡スライドから接着フレームを取り除きます。顕微鏡スライドからarosパッドを、ガラスカバースリップ底の直径35 millimeterのペトリ皿に移します。高解像度イメージングを行うため、arosパッドを反転させ、細胞懸濁液がペトリ皿のカバースリップに接触するようにします。実験当日は、システムとレーザーを完全に安定させるため、イメージングの少なくとも1時間前にOMX 3D SIMイメージングシステムを起動してください。次に、マスターコントローラーワークステーションで、テキストプロトコルに記載されている各コンポーネントの電源を入れます。アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを起動します。データ保存用のファイルパスを適切なデータフォルダに設定します。次に、Softworkソフトウェアを起動します。メイン画面のライトパラメータセクションで、実験に必要なレーザーをオンにします。チャンネル選択からFITCカメラを有効にし、テキストプロトコルに記載されているパラメータを確認してください。対物レンズの先端にオイルを1滴滴下します。準備した細胞が入ったサンプル用ペトリ皿をステージのインセットに設置し、円形の加熱用蓋で覆います。オイルがサンプル用ペトリ皿の底に触れるまでステージを下げます。ディッシュをステージ上で15分間放置し、温度を平衡化させます。低露光設定を用いて、ナノポジショニングステージのコントロールでサンプルに焦点を合わせます。サンプルの焦点面の上方および下方に焦点を移動させ、光が均一に広がっているかを確認します。次に、0.5 micron刻みでステップ移動させ、画像スタックの上端と下端をマークします。その後、サンプルの中心に戻り、「Experiment」タブで「Get Thickness」ボタンをクリックして、サンプルの取得厚さを設定します。現在の露光量および光透過率の設定におけるサンプル画像の最大強度値を決定します。この値は画像ウィンドウの下に表示されます。タイムラプス撮影の場合、最大強度が1100から1400になるように露光量と光透過率を調整してください。背景レベル以上であること。画像については、エクスペリメントタブのタイムラプスセクションを有効にします。必要なフレームレートと、データファイル内の合計時間を設定してください。適切なファイル名を入力します。実行ボタンをクリックして、画像取得を開始します。タイムシリーズの最初のフレームにおける、画像取得開始時の最大輝度値を記録してください。最初のフレームの取得終了時に、この初回のフレームにおいてZackを通じた信号強度の低下が10%を超えていないことを確認します。時系列データの取得終了後、接尾辞にDVが付いた結果のRAW画像ファイルを開き、時系列の開始時から最終画像までの最大信号強度の低下を確認します。30%以上の光退色が生じているタイムポイントは、プロセスメニューから破棄し、SI再構成ウィンドウを起動します。すべてのパラメータに既存の設定を使用します。使用するチャネル固有のOTFボタンを有効にし、標準フィルターセットに設定します。使用するチャネル固有のKO anglesボタンを有効にし、標準フィルターセットに設定します。RAWファイルを入力ファイルスペースにドラッグ・アンド・ドロップします。「do it」をクリックしてください。Zリング周囲のFTSZの分布を調べ、3D強度プロットを作成します。次に、3D画像ファイルを開きます。個々のzスライスを表示するには、表示メニュータブにあるボリュームビューアーツールを使用します。関心領域をクロップするには、この3D画像のウィンドウ番号を入力ウィンドウに入力し、新しく未使用のウィンドウ番号を出力ウィンドウに入力してください。「領域選択」ボタンが有効になり、元の40 by 40 micronの視野から特定の関心のあるZリングをクロップできるようになります。回転タブで、希望する軸と回転角度を調整してください。「do it」ボタンをクリックします。ボリューム内をスクロールして、目的の視点であるZリングを表示させます。データインスペクターツールを使用して列・行の寸法を調整し、個々のZリングを中心とした新しい関心領域（ROI）を作成します。画像の中央をクリックして、この新しい関心領域（ROI）を配置します。テキスト画像データは、関心領域内の各ピクセルの蛍光強度を表示する自動生成テーブルです。3Dグラフボタンをクリックして、まず強度プロットを表示してください。あるいは、「save table data」ボタンをクリックしてテキスト形式の画像データをエクスポートすることもできます。ファイルメニューから、保存されたテキストファイル内の画像データを新しいスプレッドシートにコピーします。スプレッドシート内のすべてのセルを選択し、新しい3D曲面グラフを作成します。タイムラプスデータの3D強度プロットグラフを、出版用にフォーマットします。3D画像ファイルの各タイムポイントについて、これらの手順を繰り返します。従来の広視野蛍光顕微鏡で可視化すると、bacillus subtlesにおいてZリングは単一の横方向の蛍光バンドとして現れます。このバンド全体の蛍光強度は均一です。この局在パターンからは、ここにあるリング内でのFTSポリマーの構造的組織化や分布に関する知見はほとんど得られません。ここでは同じ細胞を FAST 3D sim 法を用いて観察しています。3D sim画像のZ軸を中心とした回転により、Zリングを三次元空間における真のリング構造として可視化することが可能になります。解像度の向上により、リング内におけるFTSZの不均一な分布を可視化できるようになりました。この手法で可視化したBacillusのZリングの追加例からは、Zリング周囲の蛍光強度が決して一定ではないことが示されています。さらに、蛍光強度が非常に低い領域やギャップが観察されます。これらの観察結果を定量化するために、Zリングの3D強度プロットを作成しました。この強度プロットにより、bacillus subtlestのZリングの異なる領域間で、蛍光量に最大4倍の変動があることが示されました。3D強度プロットにより、Zリング内で起こる動的な変化を解析するために、ギャップ部分がほぼ背景蛍光のベースラインレベルである的に読み取れることが示されています。時間の経過とともに、3Dシミュレーションのタイムラプスが実行されます。この動画では、bacillus subtleのZリング内のFTSZが絶えず変化している様子が示されており、各画像に対して生成された強度プロットで測定されています。このビデオを視聴することで、細菌細胞の培養と調製方法、3D Simを用いたイメージング方法、定量データを取得するための解析方法、そして最終的にプレゼンテーション品質の画像を作成する方法について十分に理解することができます。画像取得の間、細胞の状態を監視すること、また、取得中の蛍光タンパク質の発現レベルを監視することが非常に重要です。この技術の開発により、細菌細胞生物学分野の他の研究者が他の超解像顕微鏡法を利用し、異なる生物における他の細菌タンパク質を局在化させることが可能になりました。この手順に続いて、光活性化局在化顕微鏡法などの他の超解像顕微鏡法を用いることで、FDSタンパク質の経時的な動的変化を観察することが可能です。

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JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

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生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

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構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

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退色により、シアノ バクテリアプロクロロコッカスFtsZ リングの超解像イメージング

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。...

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。...

3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ高速3D-SIMを用いたBacillus subtilisの細胞質分裂におけるFtsZタンパク質の動態解析法。この超解像顕微鏡技術により、Zリングの立体構造とタンパク質分布の時間変化を可視化し、細菌細胞生物学研究に応用できます。

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

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