Name: 後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定するインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶマウスにおける脊髄シナプス前抑制の測定法。後根電位のインビボ記録により、感覚と運動信号の統合メカニズムを解明し、疼痛や脊髄損傷の研究に応用する。

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我々は、この方法の確立の際に有用な議論のためのマンフレッドHECKMANNに感謝します。さらに、我々はビデオを生成するサポートのための技術支援やフランク·シューベルトのためクラウディアソマーに感謝します。 01EO1002とイエナ大学病院の臨床研究のための学際センター（IZKF）：仕事は、連邦教育研究省（BMBF）、ドイツ、FKZによってサポートされていました。

以下のプロトコルに記載されている全ての実験手順は、チューリンゲン州当局（テゥーリンガーLandesamtエリーゼVerbraucherschutz、Reg.-Nr. 02-044/12）によって承認された。 1。実験に向けた準備<ol><li>吸引電極の作製<ol><li> 例えば 、標準のパッチ電極マイクロピペットプラー、標準ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用してマイクロピペットを引き出します。 </li><li>ブレーキダイヤモンドファイルを使用して（背側根の直径よりもわずかに大きい）0.5〜1ミリメートルの直径を傾けるための電極。 </li><li>熱ポリッシュは、それが標準的な実験トーチインチ吸引する際には、後根に害を与えないように先端が適切であろう。 </li><li>負圧を適用することができる介してシリンジに接続された電極ホルダにガラスフィラメントを取り付ける。 </li></ol></li><li>溶液の調製<ol><li>マウス用の注射麻酔：0.75ミリリットルケタミン10パーセント、0.24ミリリットルキシラジン2％Aを混ぜるND 5ミリリットル0.9％生理食塩水。溶液10μl/ gの体重（BW）は、腹腔内（ip）注射する。 </li><li>人工脳脊髄液（ACSF）：（単位：mm）再蒸留水に希釈し、次の塩：NaClの134;塩化カリウム3、KH 2 PO 4 1.25、硫酸マグネシウム4•H 2 O 2、 炭酸水素ナトリウム25、 塩化カルシウム2、D-グルコース10。 0.003％の最終濃度までH 2 O 2を追加する。常に新鮮に調製した溶液を使用してください。 </li></ol></li><li>録画設定します（ 図2）の調製<ol><li>データをデジタル化するためのPCインターフェースにアンプを接続します。 </li><li> PCのハードドライブ上の方形パルス刺激とデータ収集をトリガするために、PCベースのプログラムまたはアナログタイマを使用。 </li><li>刺激と記録用として標準的なガラス電極ホルダに接続塩素化silverwiresを使用してください。 </li><li>ステールのまわり、それぞれの刺激、記録と参照電極のための3つのマニピュレータを組み立てるマウスについてのotacticフレーム、全ての電極は、後で準備脊髄へのアクセス権を持つように。 </li><li>負圧を適用するリンゴであると電極ホルダにチューブや注射器を接続します。 </li></ol></li></ol> 2。記録手順のための動物実験や動物の準備のための一般的なコメント<ol><li>それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って、マウスを使用して、すべての実験を行う。動物の苦痛を最小化していることを確実にする、深い麻酔下で、すべての手術との録音を行う。 </li><li> （;上記のように調製した溶液を10μl/ G BWのそれぞれ125mgのケタミン及びキシラジン、のG BWあたり8mgの）ケタミン/キシラジンの腹腔内注射することによって動物を麻酔。長期記録時に必要な場合、追加の注射は腹腔内または筋肉にすることができる 注：0.05〜0.1の反復筋肉内注射を上部大腿部におけるケタミン/キシラジン溶液のmlを適切であることが証明されている最大3時間、深麻酔で動物を維持する。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。 </li><li>定位フレームに動物の頭部を固定し、実験中、動物の体温を制御するために、直腸プローブと反射的ループで加熱パッドを使用しています。定位フレーム中の脊髄の固定は必要ありません。 </li><li>準備を始める前に、マウスの足の指の間に瞬目反射および単収縮による麻酔の深さを確認してください。反射は廃止すべき。 </li><li>メスを用いて明確な運用のフィールドを取得するために腰椎の領域を下げる胸部上部レベルから脊髄上記の正中線に沿って皮膚を開きます。皮膚切開を行うためにハサミを使用しないでください。慎重に下にある組織から皮膚を失う。その後の工程の間に0.9％生理食塩水で湿らせた傷を保つ。 </li><li>小刀やはさみを使って胸椎レベルに腰椎から脊椎の両側に腱および結合組織を切断する。 </李&gt; <li>小さなニッパーを使って脊椎の周りの棘突起および結合組織の残りの部分を削除します。 </li><li>慎重に解剖顕微鏡下で腰椎レベル（L4/L5）から始まるニッパーで脊椎割れ。脊椎と脊髄の間の空間にニッパーの先端を突き出すと離れて骨片を持ち上げます。硬膜を害すると脊髄に圧力を避けるためにしないでください。どちらも、成功のために重要である。全体の手順の間、湿らせた脊髄に保管してください。半ば胸部のレベルに進みます。 </li></ol> 3。後根およびDRPの記録を分離します（図2） <ol><li>慎重に曲がった先端を細い針（30 G）を使用して硬膜を開きます。これから加湿のためのaCSFを使用してください。 </li><li>ゲージを使用して、可能な限り後根を分離し、可能な限り遠位として2隣接根を切る。活発な分離の間に根を引っ張ると、実験の成功に影響を与えます。 </li><li> DOに吸引電極を下に下げるRSALルーツ。液体は後根を吸引するのに役立ちますので、可能な限り、脊髄に限りのaCSFを追加します。 </li><li>シリンジを介して負圧を印加することによって一方のガラスピペット内に1後根の切断端を吸う。必要に応じて、細い針を使用し、電極開口部の前面に後根を移動します。 </li><li>後根は、吸引電極内の乾燥にある場合、慎重に吸引しながら、ピペットを十分のaCSFで満たされるまで、その先端にいくつかのaCSFを追加します。 </li><li>後根が吸い込まれた後、脊髄から電極先端を高めています。ピペットチップや脊髄短絡記録/刺激電極の間には &quot;水の橋」と注意してください。 </li><li>繰り返します同側隣接するルートのための3.3から3.6を繰り返します。 </li><li>後根にできるだけ近い参照電極を配置し、aCSFのを適用することで湿らせ、それを維持する。 </li><li>録画設定を確立することによって、1ルートがすでに刺激のために選択され、録音用です。二後根から記録が電流クランプモードで行われている間、電圧を段階的に増やします。一つは、DRPを表す遅く、長期的な上向きのたわみが続いている短い下方への撓みが発生することがあります。 </li><li> （ - 0.1ヘルツ、0.3ヘルツ、3 kHzの間のフィルタで30スイープ/後根少なくとも20）のレベルを最大上、いくつかのスイープを記録するための刺激電圧を調整します。 </li><li> DRPの時間依存合計に関する情報を取得するために3つの刺激（100ヘルツ）の短い列車を記録します。 </li><li>追加の対側記録に記録し、刺激部位を切り替える。 </li><li>動物を手順に耐えることを意図するものではない。まだ深麻酔下にある間断頭により最後の記録の後に動物を犠牲に（ケタミン/キシラジン、上記参照、ステップ2.2）。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>解析プログラムにデータを転送（ 例えばシグマプロット、イゴールプロ、またはMATLAB）。 </li><li>平均トレースFRを計算するOM、20〜30スイープ。 </li><li>さらに分析するため（ 図3）、（DRPのピーク振幅ベースラインからの）電圧振れの最大振幅をとる。 </li><li>その後のポテンシャルの時間依存合計の測定値を得るために3パルスと単一パルスの後に、DRPのピーク振幅の比を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+inhibitory+action+attributable+to+presynaptic+depolarization+produced+by+muscle+afferent+volleys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys.</a> J. Physiol. 159, 147-166 (1961).</li>
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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

in vivoでの神経活動やシナプス電位の細胞外および細胞内電気生理学的記録は、CNS神経機能と病態生理を調査中の最新技術である。脊髄統合は、運動機能などの四肢の動きやマルチモーダル感覚知覚するために重要である。シナプス前抑制は、感覚入力への適切な対応を確保すること、この計算プロセスにおける1重要なメカニズムである。のIa求心性線維上のGABA作動性シナプスは、パッドによる運動ニューロンの興奮を抑制する。 in vivoでの脊髄後根電位記録を直接無傷動物パッドを測定するための可能性を開く。この技術は、異常脊椎阻害は、疼痛、脊髄損傷、末梢神経損傷、又は炎症のような関連である、疾患状態に関連する研究のために特に関心があるかもしれない。遺伝的に改変されたマウスモデルの使用と組み合わせて、この技術は、INVEするための強力であることができる邪魔脊髄抑制の基礎となるstigateメカニズム。ここでこの方法は、単離された脊髄調製物を用いてマウスにおけるDRP記録の代替形態のいくつかの制限を克服する。だから、脊柱上のネットワークへの経路が保存され、また、脊髄および脊柱上神経活動を組み合わせた解析...

シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。これは、シナプス後膜電位および運動ニューロン1-3の興奮性を変更することなく、monosynaptically興奮運動ニューロンにおける興奮性シナプス後電位（EPSPS）を阻害する。感覚シナプス前繊維にGABA作動性AXO-軸索シナプスによって誘導された一次求心性脱分極（PAD）は、基本的なメカニズム4-7（もFigure1aを参照）である。これらのシナプスは、GABA Aと GABA B受容体（GABA A R及びGABA B R） ​​を含んでいる。 GABA A Rの活性は、ローカルイオン分布にPADを誘発クロライドコンダクタンスの増加をもたらす。この脱分極をブロック軸索終末に活動電位の伝播と減少したのCa 2 +流入と伝達物質放出の減少をもたらす彼らの強さを軽減します。 GABA B受容体の活性化はないなしトンPADに寄与せず、+流入は、それによってシナプス前抑制を増強するCa 2 +の減 ​​少をもたらす。 GABA A Rの活性化が短期阻害に関与しているように見える一方で、GABA B Rは、長期8-10変調に関与している。 PADとシナプス前抑制の大部分を占めるGABAに加えて、他の送信機システムはまた調節する可能性があり、この機構11,12に寄与する。 シナプス前抑制における病理学的変化は、欠陥のあるGABA作動性伝達17によって媒介運動過剰興奮性と末梢性炎症および神経障害性疼痛13,14、ならびに異常な中枢性疼痛処理15、脊髄損傷16、およびCNS疾患、例えば 、いくつかの疾患状態において重要であると思わ18。従って、シナプス前抑制を推定するin vivoでの脊髄レベルに関する実験病理学的状態を調査する価値がある</em&gt;。 PADは、脊髄におけるシナプス前抑制の直接的な尺度を提供するボリューム行わ電位を生じさせる。これらの電位は、後根電位（DRP）と呼ばれ、隣接する背側根7の刺激後に脊髄後根から測定することができる。 DRPの最初の測定値は、猫やカエル19で報告されており、集中的に、1970年代初頭3,4,20,21にエクルズ、シュミット、そして他の人が猫で研究した。ネコおよびラット22 23 DRP のインビボ記録は、広く使用されてきたが、マウスでの測定は、ほぼ独占的にex vivoで単離された脊髄調製物15,24に行われている。ここでは、完全な生物体におけるシナプス前抑制の直接測定を可能に生体内で麻酔したマウスでは、DRPを記録する方法を説明している。

<table><tbody><tr><td>ガラス管(内径1.16 mm)</td><td>Science Products(ホーフハイム、ドイツ)</td><td>GB200F-10</td><td>他のガラス管も適している可能性があります</td></tr><tr><td>超融着溶液(滅菌、0,9%NaCl)</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2%(キシラジン)</td><td>Bayer Animal Health GmbH(ドイツ、レバークーゼン)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>Medistar GmbH(アッシェベルク、ドイツ)</td><td>KETAMIN 10%</td><td></td></tr><tr><td>30 G マイクロニードル/ Sterican</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>S88 Dual Output Square</td><td>Pulse Grass Technologies (ワーウィック、米国)</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF Transformer Isolation Unit</td><td>Grass Technologies (米国ワーウィック)</td> <td>SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8</td><td>HEKA (Lambrecht, Deutschland)</td><td>LIH 8+8 + Patchmaster software</td><td></td></tr><tr><td>Universal amplifier</td><td>NPI (Tamm, Deutschland)</td><td>ELC-03X</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus (Tokyo, Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td>MPC-200/MPC-325</td><td>機械式マイクロマニピュレーターも可能</td></tr><tr><td>ホメオサーミックブランケットシステム</td><td>Stoelting(Wood Dale, USA)</td><td>50300V</td><td></td></tr><tr><td>Intra-/extracellular recording electrode holder</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, USA)</td><td>641227</td><td></td></tr></tbody></table>

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。基本的な生理学的なメカニズムは、GABA作動性AXO-軸索シナプス（一次求心性脱分極）が介在する一次求心性線維の脱分極である。一次求心性脱分極の強度は、後根（後根電位、DRP）で体積を行っ電位を記録することによって測定することができる。シナプス前抑制の病理学的変化は、特定の疼痛症状の異常な中央演算処理において、モータ過剰興奮のいくつかの疾患において重要である。ここでは、マウスにおいてインビボで DRPを記録する方法を記載している。麻酔した動物および吸引電極を用いて記録手順における脊髄後根の調製について説明する。この方法は、GABA作動性、DRPを測定し、それによって生きているマウスでは脊髄シナプス前抑制を推定することができます。トランスジェニックマウスモデルとの組み合わせで、DRP記録月SE疾患関連脊椎の病態生理学を研究するための強力なツールとしてRVEは、 インビボ記録は、 例えば、同時記録又は脊柱上のネットワークおよび末梢神経の刺激によるDRPの誘導の操作の可能性をex vivoで単離された脊髄調製物と比較していくつかの利点を有する。

典型的なDRPトレースを図3に示す。著名な刺激アーティファクトは通常は短い下方への撓みが続いている。その後、DRPを表す遅い、長期持続上向き偏向は、明確に区別される。録音の一部では、脊髄後根反射は、DRPの上に小さなスパイクとして表示されます。刺激電圧が過剰になると正常な野生型マウスでは、後根反射は最も頻繁に現れる。後根反射神経がこの準備に再現性よく誘発することはできませんので、それらを分析のために採取されておらず、注意が最低に刺激電圧を低減するために撮影していたが、さらに最大上強度。 DRPピーク振幅の解析のために、20〜30以降の掃引のトレースが（図3a）が使用される平均化。 DRPのピーク振幅は、従来の刺激アーチファクトのベースラインレベルと比較して計算することができる。 DRPの時間依存性の総和は、反復番目から分析することができるimulations（3刺激、100Hzで、 図3b）。ピーク振幅は、単一の刺激実験に応じて算出される。高い周波数での単一および3回刺激後の振幅の比は、PADの時間依存総和の推定値を与える...

GABA作動性シナプス前抑制は、モータと脊髄ネットワークでの感覚信号の統合のための重要な脊髄の強力な阻害のメカニズムです。基礎となる一次求心性の脱分極は、後根電位（DRP）の記録により測定することができる。ここでは、マウスにおけるDRP のインビボ記録する方法を実証する。

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

シナプス前抑制は、脊髄における最も強力な抑制機構の一つです。シナプス前抑制の病理学的変化は、いくつかの疾患パターンのメカニズムにおいて重要です。例えば、ニューロパチー性疼痛や炎症性疼痛、および異常な中枢性疼痛処理などが挙げられます。これは脊髄損傷や、運動過剰興奮を伴う中枢神経系疾患において重要です。したがって、これらの疾患の動物モデルを研究する場合、前シナプス抑制の強度を把握することは重要な情報となります。ここでは、マウスモデルにおいて前シナプス抑制を評価する方法を提示します。生体内でのシナプス前抑制は、感覚神経前終末線維へのGABA作動性軸索-軸索シナプスによって誘発される一次感覚神経の脱分極により媒介される。GABA$_A$受容体の活性化はクロライドコンダクタンス（塩化物イオン伝導度）の増加をもたらし、局所的なイオン濃度分布により、一次感覚神経の脱分極が引き起こされる。この脱分極が、軸索末端への活動電位の伝播を阻止してその強度を減退させ、その結果、カルシウム流入の減少と神経伝達物質放出の抑制が導かれる。単シナプス性に興奮性のニューロンにおける興奮性ポストシナプス電位は、ポストシナプス膜電位やニューロンの興奮性を変化させることなく抑制することが可能です。この一次的な脱分極の容量伝導電位は、脊髄におけるシナプス前抑制の直接的な指標となり、これらの電位は刺激後の脊髄後根から測定することができ、これを後根電位と呼びます。後根電位の測定法は確立されており、ネコ、ラット、カエルなどで広く用いられてきましたが、マウスにおいては、ほぼ例外なくex vivoの単離脊髄標本を用いて記録が行われてきました。本稿では、麻酔下にあるマウスのin vivoでこれらの後根電位を記録する方法について述べ、個体レベルでのシナプス前抑制の直接的な測定を可能にします。マウスのin vivoでのDRP記録には、以下の機器が必要です。標準的な手術器具、刺激電極、記録電極、および参照電極をそれぞれ配置するための手術用実体顕微鏡。さらに、刺激および記録を行う際のマウスの体温を制御するためのマウス固定フレームおよび加温プレート、または刺激装置が必要です。S/N比を向上させるために、標準的なアンプとデータ収集システムが必要です。DRPの記録には、カスタムメイドのセクション電極が必要であり、その作製には標準的なピペットプラーを用いて従来のガラス管を延伸させます。ダイヤモンドファイルを用いて電極の先端を削り、先端の開口部を広げます。標準的なラボ用トーチで先端を研磨し、表面を滑らかにします。調製を開始する前に、ケタミンを腹腔内（IP）投与して動物を麻酔し、マウスの頭部を脳定位固定装置で固定します。次に、マウスの後肢の足底（PO）をつまみ、麻酔深度を確認します。足底の逃避反射が見られなくなった時点で処置を開始し

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。...

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

出典:Shannonhouse, J., et al.In vivo 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロン集団のカルシウムイメージング。J. Vis. Exp. （2023年).このビデオは、トランスジェニックマウスの後根神経節(DRG)のニューロン活動を監視するためのin...

マウスの無傷の背根神経節におけるニューロン群のin vivoカルシウムイメージング

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

ラットにおける神経活動の阻害とその電気生理学を用いた検出

インビボでの神経伝導特性の測定は、神経筋疾患の種々の動物モデルを特徴づける強力なツールを例示する。ここでは、麻酔したマウスの坐骨神経に対する電気生理学的分析を実施することのできる、簡単で信頼性の高いプロトコルを提示する。...

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

若いマウスで脊髄の斜めスライスを準備する方法を示します。この調製により、腹根の刺激が可能になります。...

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

神経伝導測定神経変性のマウス ・ モデルを評価するために有用なツールだけど、よく後肢で坐骨神経を刺激するためにのみ適用されます。ここでは、複合筋活動電位...

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

このプロトコルは、同時のトランス脊髄直流刺激を用いたラット腰椎モトニューロンの生体内細胞内記録について説明する。この方法により、膜の特性を測定し、脊髄のアノーダルまたは陰極分極化の前後にモトニューロンのリズミカルな発火を記録することができます。...

生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

本プロトコルは、体細胞および内臓刺激に対する腰椎-6 DRGニューロンのアンサンブルの応答を測定するためのin...

インビボ体細胞および内臓刺激に対する背根神経節ニューロンの応答のカルシウムイメージング

この研究では、麻酔をかけたマウスでT-DRGを曝露するための外科的操作を示し、 in vivo...

末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

学ぶマウスにおける脊髄シナプス前抑制の測定法。後根電位のインビボ記録により、感覚と運動信号の統合メカニズムを解明し、疼痛や脊髄損傷の研究に応用する。

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する

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