後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する

シナプス前抑制は、脊髄における最も強力な抑制機構の一つです。シナプス前抑制の病理学的変化は、いくつかの疾患パターンのメカニズムにおいて重要です。例えば、ニューロパチー性疼痛や炎症性疼痛、および異常な中枢性疼痛処理などが挙げられます。

これは脊髄損傷や、運動過剰興奮を伴う中枢神経系疾患において重要です。したがって、これらの疾患の動物モデルを研究する場合、前シナプス抑制の強度を把握することは重要な情報となります。ここでは、マウスモデルにおいて前シナプス抑制を評価する方法を提示します。

生体内でのシナプス前抑制は、感覚神経前終末線維へのGABA作動性軸索-軸索シナプスによって誘発される一次感覚神経の脱分極により媒介される。GABA$_A$受容体の活性化はクロライドコンダクタンス（塩化物イオン伝導度）の増加をもたらし、局所的なイオン濃度分布により、一次感覚神経の脱分極が引き起こされる。この脱分極が、軸索末端への活動電位の伝播を阻止してその強度を減退させ、その結果、カルシウム流入の減少と神経伝達物質放出の抑制が導かれる。

単シナプス性に興奮性のニューロンにおける興奮性ポストシナプス電位は、ポストシナプス膜電位やニューロンの興奮性を変化させることなく抑制することが可能です。この一次的な脱分極の容量伝導電位は、脊髄におけるシナプス前抑制の直接的な指標となり、これらの電位は刺激後の脊髄後根から測定することができ、これを後根電位と呼びます。後根電位の測定法は確立されており、ネコ、ラット、カエルなどで広く用いられてきましたが、マウスにおいては、ほぼ例外なくex vivoの単離脊髄標本を用いて記録が行われてきました。本稿では、麻酔下にあるマウスのin vivoでこれらの後根電位を記録する方法について述べ、個体レベルでのシナプス前抑制の直接的な測定を可能にします。

マウスのin vivoでのDRP記録には、以下の機器が必要です。標準的な手術器具、刺激電極、記録電極、および参照電極をそれぞれ配置するための手術用実体顕微鏡。さらに、刺激および記録を行う際のマウスの体温を制御するためのマウス固定フレームおよび加温プレート、または刺激装置が必要です。

S/N比を向上させるために、標準的なアンプとデータ収集システムが必要です。DRPの記録には、カスタムメイドのセクション電極が必要であり、その作製には標準的なピペットプラーを用いて従来のガラス管を延伸させます。

ダイヤモンドファイルを用いて電極の先端を削り、先端の開口部を広げます。標準的なラボ用トーチで先端を研磨し、表面を滑らかにします。調製を開始する前に、ケタミンを腹腔内（IP）投与して動物を麻酔し、マウスの頭部を脳定位固定装置で固定します。

次に、マウスの後肢の足底（PO）をつまみ、麻酔深度を確認します。足底の逃避反射が見られなくなった時点で処置を開始してください。また、処置中も繰り返し麻酔深度を確認する必要があります。必要に応じて、後肢の大腿四頭筋にケタミンを繰り返し投与してください。

麻酔を維持し、直腸プローブを用いて動物の体温をモニタリングします。後索の準備のため、背側正中線に沿って皮膚を切開します。

皮膚を下の組織から剥がし、椎骨を周囲の結合組織から分離させます。脊髄の両側に2箇所切開を加え、メスで組織を押し広げて切開部を広げます。次に、小型のボーンニッパーを使用して棘突起を除去します。

腰椎レベルから開始します。術野の乾燥を防ぐため、胸椎の中央レベルまで進みます。傷口の周囲に小さなガーゼ片を配置し、0.9% sodium chlorideで湿らせます。

次に、腰髄領域から脊髄の調製を開始します。隣接する2つの椎骨の間の隙間に、ボーンニップルの先端を慎重に押し込みます。脊髄に加わる圧力を可能な限り軽減するように細心の注意を払ってください。

脊髄の胸髄レベルを人工脳脊髄液で湿らせます。以降のすべてのステップにおいて、この操作を繰り返し行います。30ゲージの針を用いて、慎重にデュロメーターを開きます。

次に、脊髄から隣接する2本の同側根を緩めて分離します。その後、根を可能な限り遠位で切断します。処置中に。

根を過度に引っ張ると、最終的にDRPの正常な記録を妨げることになるため注意してください。基準電極を脊髄の近くに配置した後、セクション電極の1つの先端を、ある背根の近位端の至近距離まで移動させます。その後、その背根を吸引電極の先端開口部の上に配置します。

その後、電極に接続したシリンジを用いて短時間陰圧をかけることで、背根を電極内に吸い込みます。次に、溶液が電極内の背根と塩化銀線の両方を囲むまで、低レベルの連続的な陰圧をかけながら、電極内にA CSFを満たします。続いて、液橋によって電極が短絡しないよう、電極の先端を脊髄から離します。

もう一方の同側隣接根についても同様の手順を繰り返します。両方の電極を配置したら、一方の経路を刺激し、もう一方から記録することでDRPの記録を開始し、刺激電圧を至適最大レベルまで上げます。背根電位の典型的な記録波形は、左パネルに示す通りです。

短い刺激アーチファクトに続き、短い正方向への偏向と、持続的な負方向への偏向が現れます。この最後の偏向が、実際の背根電位です。その振幅は、刺激記録の直前に記録されたベースラインを基準として算出できます。

呼吸運動や心電図（EKG）アーチファクトに由来する1対の根からの複数のトレースが、記録されたDRPを妨害する可能性があります。記録が正常に完了した後、刺激部位と記録部位を入れ替えて2回目の記録を行うことが可能です。提示された記録方法は以下の通りです。

in vivoでの根電位測定により、遺伝子組み換えマウスと組み合わせることで、特に生体内の動物において一次求心性線維や抗分極の評価が可能になります。これは、脊髄抑制の根底にあるメカニズムを調査するための強力なツールとなり得ます。脊髄統合は、運動機能およびマルチモーダルな感覚知覚にとって極めて重要です。

この手法は、疼痛、脊髄損傷、末梢神経損傷、および炎症に関する研究において有用です。in vivo で DRP を記録することで、脊髄上の活動と足底（pad）の相互作用を解析することが可能になります。これは、マウスの DRP 測定に通常用いられる単離脊髄標本では不可能なことです。

原理的に、記録中に脊髄への薬剤投与を行うことは可能です。追加のピペットを用いて局所投与することで、局所的な薬剤濃度の制御を強化し、迅速に行うことができます。