マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

次の実験の全体的な目標は、単純なマイクロ流体ベースのアッセイを使用して、さまざまな細胞タイプの変形能力を調査することです。これは、ポリジメチルスボキサンまたはPDMSマイクロ流体デバイスを作製して、ミクロンスケールの一連の細胞通過の時間スケールをプローブすることによって達成されます 収縮圧力駆動の流れは、その後、マイクロ流体チャネルを介して細胞を駆動するために使用され、個々の細胞の変形と時間依存的な緩和をアッセイすることができます。次に、自動画像解析プログラムを実行して、ビデオを処理し、通過時間データのヒストグラムを取得します。

その結果、細胞の種類が異なれば、一連の狭窄を通過する時間に基づいて細胞変形能力に違いが見られることが示されています。原子間力顕微鏡やマイクロピペット吸引などの既存の技術に対するこの技術の主な利点は、マイクロ流体デバイスが高スループット容量で正常に動作できることです。一方、他のマイクロ流体デバイスを使用して、細胞の変形性を測定することもできます。

私たちは、細胞が肺毛細血管床などの生理学的状況で一般的な形状である連続的な狭窄を通過するようにデバイスを設計しています。まず、コンストリジョンアレイチャネルの幅を平均セル直径の約30〜50%に、チャネル高さをセル直径の50%以上に選択して、マイクロ流体デバイスを設計します。入力ポートにフィルターを含めて、破片を取り除き、セルクラスターを分解します。

実験を開始する前に、リソグラフィーマイクロマシニングの標準的な技術を使用してデバイスマスターを製作します。プロファイラー(表面形状測定機)を使用して、パターン特徴の高さを確認します。次に、圧縮空気のタンクと一連のエアレギュレーターおよびフィッティングを使用して、圧力駆動の流れの空気源を修理します。

まず、給気タンクと手動レギュレーターを設置します。次に、手動レギュレーターに沿って電子制御圧力レギュレーターをセットアップします。LabVIEWで記述した簡単なコードを使用して、目的の圧力を入力します。

電空コンバータは、内部フィードバックループを使用して、マイクロ流体デバイス全体の指定された圧力に一致するようにバルブ出口圧力を調整します。標準的なフローサイトメーターチューブから細胞懸濁液チャンバーを組み立て、チューブに圧力密シールを作成する機械加工されたキャップを組み立てることにより、細胞懸濁液の流れを駆動するための加圧チャンバーを設定します。圧力チャンバーキャップには、圧縮空気タンクに接続する入口と、加圧チャンバーから装置にセルが流れる出口の2つのオリフィスが含まれています。

次に、毎秒100フレーム以上の取得速度を持つカメラを取り付けた倒立顕微鏡をセットアップします。狭窄アレイを流れる細胞の画像を撮影するには、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSでストック界面活性剤溶液を調製します。これは、細胞培地溶液に少量の界面活性剤を添加することで、PDMS壁への細胞接着を最小限に抑えるのに役立ちます。マイクロ流体チャネルを備えたPDMSブロックを作製するには、10gのPDMSベースに1gの硬化剤を加えて十分に混合します。

混合物をデバイスに注ぎます。閉じ込められた気泡が消えるまで、または約10〜20分間、真空を適用したベルジャーでドガをマスターします。この時間が経過すると、AIR PDMS インターフェイスに気泡が残っている場合がありますが、これは正常です。

これらは通常、ベーキング中に消えます。次に、Degasデバイスが冷却された後、Degasデバイスを摂氏65度で4時間焼きます。マイクロ流体デバイスをマスターモールドから取り外します。

まず、デバイスの片隅をそっと持ち上げます。持ち上げるのではなく、ゆっくりと穏やかな剥離 PD DMSブロックは、PDMSとマスターの両方へのストレスを軽減します カミソリの刃でPDMSブロックから個々のマイクロ流体デバイスを切り取り、マスターからデバイスを取り外します PDMSデバイスにパンチ穴を開けて、チューブとマイクロチャネル間のアクセス用の接続ポートを作成します。チャネル側からデバイスの外部側まで、生検パンチを使用して穴を開けます。

PDMSデバイスをイソプロパノールですすいで、ほこりを取り除き、PDMSの塊を溜めます。スクイーズボトルから純粋なイソプロパノールの安定した流れを穴に向けることにより、パンチ穴に破片がないことを確認してください。ろ過された空気でブロードライします。

ガラス基板をメタノールですすいで清掃します。次に、ろ過した空気でブロードライし、摂氏200度のホットプレートに5〜10分間置いて、プラズマ処理の前にガラスが完全に清潔で乾燥していることを確認します。テキストプロトコルに詳述されているように、顕微鏡でマイクロ流体デバイスを検査します。

チャネルが折りたたまれたり壊れたりしていないこと、および低電力対物レンズを使用して入口と出口の両方の穴がデバイスのチャネルに直接接続されていることを確認します。細胞懸濁液をフローサイトメーターチューブに入れ、圧力キャップに接続してからチューブをマイクロ流体デバイスに接続し、圧力を約14〜21キロパスカルに調整し、細胞懸濁液がチューブの先端から出てくるまで洗い流します。次に、デバイスを平らな面に置き、チューブをデバイスのインレットに挿入します。

PDMSデバイスの下側に接着されたガラスカバースリップは壊れやすいです。細胞懸濁液を含むチューブの先端をデバイスインレットに挿入します。次に、チューブの一部を出口ポートに挿入し、顕微鏡ステージの側面にテープで留められた空のFalconチューブなど、廃棄物収集用の空のチューブに配線します。

圧力を約28キロパスカルまで、または細胞がチャネルを流れるまでゆっくりと上げます。複数のチャンネルが視野内にあり、画面の下部に対して垂直になるようにデバイスを配置します。データ分析を開始するには、マスタースクリプトの m ファイルを開き、プログラムを実行します。

表示されるWindowsエクスプローラーウィンドウから、分析する最初のビデオを選択します。選択したビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。長方形のトリミングウィンドウを選択するようにユーザーに促す図が表示されます。

最初のビデオでは、左から右にすべてのチャンネルを囲み、チャンネル配列の最初の電球のすぐ上のチャンネルと交差するウィンドウを選択します。上部と下部で、トリミングされた画像からくびれ領域を選択します。このアルゴリズムは、各ビデオの最初の 50 フレームのセルのセグメンテーションを表示します。

左上の画像をよく監視して、アルゴリズムがセルを正確に特定しているかどうかを判断します。ライズされた画像は、ソースビデオに重ねられます。識別されたセルの位置を示すには、Windows エクスプローラー ウィンドウから次に処理するビデオを選択します。

アルゴリズムが繰り返されます。選択したビデオごとに、[キャンセル] を選択します。すべての所望のビデオがWindowsエクスプローラウィンドウを介して追加され、ビデオリストが完全であることを機能に指示すると、HL60および好中球型HL60細胞のトランジット時間の代表的な結果は、単一のセルが一連の狭窄トランジットを通過するためのタイムスケールを示す。

時間は、一連の7つの狭窄の7マイクロメートルの狭窄ごとに個々の細胞の集団について測定されます。28 Kilopascals HLの駆動圧力で、60細胞は最初の狭窄を中央値9.3ミリ秒で一時的に閉塞してから、その後の狭窄を介してパッケージングします。対照的に、好中球型HL 60細胞は、パッケージング前に最初の狭窄をわずか4.3ミリ秒で閉塞します。

最初の狭窄を通過すると、細胞は残りの狭窄を2から7までより速く通過し、HL 60細胞の通過時間の中央値はHL60細胞で4.0ミリ秒、好中球タイプの細胞で3.3ミリ秒です。細胞集団間の通過時間を比較することで、細胞の情報提供能力の違いを明らかにすることができます。このビデオを見れば、シンプルなマイクロ流体アッセイを使用してさまざまな細胞タイプの変形能力を測定する方法について十分に理解できるはずです。

ここでは、圧力駆動の流れを使用してマイクロ流体チャネルを介して細胞を駆動し、個々の細胞の変形と緩和をアッセイすることができます。