Name: マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぼう、マイクロ流体デバイスを用いた細胞変形能測定法。PDMS製デバイスで微小縮流部を通過する細胞の通過時間を計測し、自動画像解析でヒストグラムを作成する。高スループットで細胞バイオメカニクスを評価できる革新的アプローチです。

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著者らはこの技術の初期のバージョンでは建設的な入力のためにロイドウンを承認したいと思い、圧力キャップを製造する際に彼の助けのための圧力キャップのデザインのヒント博士ジェレミーアグレスティ、博士東平チー。私たちは、テストのための細胞サンプルのさまざまなを提供するための、M Teitell及びP. Gunaratneの研究室に感謝しています。私たちは、この作業を支援するための国立科学財団（CAREER賞DBI-1254185）、UCLAジョンソン総合がんセンター、UCLAの臨床およびトランスレーショナル科学研究所に感謝しています。

1マイクロ流体デバイス設計 NOTE：入口ポート、セルフィルタ、狭窄アレイ、及び出口ポート（ 図1）：デバイスの設計は、4つの基本的な機能領域を有している。全体的な設計は、寸法の微調整を、細胞型の広い配列に適用することができる。プライマリおよび不死化細胞の選択のために有効なデバイスパラメータと一緒にいくつかの基本的な設計上の推奨事項は、ここで提供される。 <ol><li>平均気泡径の約30〜50％であることがくびれアレイチャネルの幅（ 図1B）を選択し;この有意な細胞変形が、最小の目詰まりの狭窄と細胞のサイズ比をもたらす。以前にテストされていない細胞型を考えると、最適な幅を見つけるために〜30〜50％の細胞直径を収縮幅の範囲を設計することが賢明である。マイクロ流体デバイスの多くのタイプと同様に、120以上のデバイスのマスターモールドは、罪にパターニングすることができる異なるデバイス設計の配列を可能にするGLE 4インチシリコンウェハは、単一の製造プロセスで製造される。 </li><li>細胞直径の少なくとも50％であることが流路高さを選択し;これは、セルが2次元的に閉じ込められるようにします。デバイス全体：接合時のチャネルの崩壊を防止するために、チャネルのアスペクト比1:10（幅、高さ）以上であることを確認してください。このアスペクト比を超えていなければならないチャンネルでは、崩壊を防ぐために支柱を追加します。細胞の流れを妨げないための少なくとも2倍の細胞の直径である距離の空間支柱。 </li><li>破片を除去し、細胞クラスター（ 図1B）を脱凝集する入口ポートにフィルタを含む。ポストを隔てる距離は、一つのセルの直径にほぼ等しくなるように、フィルタのポストのサイズと間隔を調整する。 注：フィーチャーサイズの下限はリソグラフィマスクが印刷される解像度によって設定される。すべての機能は解像度の範囲内であることを確認してくださいマスク供給者によって指定されたolution制限。 </li></ol> 2。サプライと準備注：いずれかの実験を開始する前に、次の項目が用意されなければならない。全体のセットアップの概略図を図1に示す。 <ol><li>リソグラフィ微細加工14,15のための標準的な技術を使用してデバイス·マスタを作製する。プロフィルを用いてパターンの機能の高さを確認してください。 注：マスターを容易にクリーンルーム施設で製造することができるが、いくつかの研究室は、半クリーン環境16,17における使用のための安価なリソグラフィ方法を開発した。 </li><li>圧縮空気と空気レギュレータおよび付属品（ 図1A）の配列のタンクを使用して、圧力駆動流のための空気源を準備します。 <ol><li>空気供給タンクと手動調整器を設定します。 注：空気中に5％の組成はCO 2は 、典型的な細胞培養incubatoと同様の環境を維持しますrは、他のガス混合物を使用することもできる。 </li><li>インライン手動レギュレータと電子制御式圧力調整器を設定します。 2未満キロパスカルの圧力変動で、調整し、チャネル間で安定した圧力降下を維持するために、電空変換器を使用してください。入力に所望の圧力をLabVIEWで書かれた簡単なコード（補足情報）を使用します。 注：電空変換器は、マイクロ流体デバイス間で所定の圧力に一致するようにバルブ出口圧力を調整するために内部帰還ループを使用しています。 </li><li>細胞懸濁液の流れを駆動するために加圧室を設定する。チューブ標準的なフローサイトメーターとチューブの圧力気密シールを作成し、機械加工されたキャップの外に細胞懸濁液チャンバーを組み立てます。 注：細胞が装置内に加圧室から流出それを通して圧縮空気タンクに接続し、入口、および出口（Figur：圧力室キャップは、2つのオリフィスを含んでいるE 2）。 </li></ol></li><li>くびれアレイを流れる細胞の画像を捕捉する秒当たり少なくとも100フレームの取得速度を有するカメラを装着した倒立顕微鏡を設定する。ビデオキャプチャカードとコンピュータとカメラをインターフェイス。 </li><li>細胞培地溶液にF127を少量添加するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で/ wのプルロニックF-127の10％wストック界面活性剤溶液を調製PDMSの壁への細胞接着を最小限にするために役立つ。 F127を溶解させ、37℃で穏やかにF127溶液を、ボルテックスし、熱を調製した。使用前に、室温で0.2μmのシリンジフィルターとストアに溶液を通過させる。以上の24時間持続する泡を生成しますボルテックスおよびフィルタリングなど事前に界面活性剤溶液を調製します。 </li></ol> 3マイクロ流体デバイスの製造<ol><li>マイクロ流体チャネルを有するPDMSブロックを製作。 <ol><li>ミックスPDMS徹底的に1:10 taの比（w / w）のベースに硬化剤。 </li><li>デバイスのマスター（ステップ2.1）上の混合物を注ぐ。真空を適用しながらベルジャー内ドガ閉じ込められた気泡が消えるまで、または約10〜20分。 注：この後、まだ正常な空気-PDMS界面で気泡があるかもしれない。これらは通常、焼成時に消費します。これは、チャネルに隣接する残存気泡がないことを確実にするために最も重要である。 </li><li> 4時間65℃で、脱気したデバイスを焼く。崩壊チャンネルを防止するために、更なるチャンネルの崩壊に対してより耐性が高い弾性率を有するデバイスのためのPDMSを架橋するために、一晩デバイスを焼く。しかし、ベーキング拡張ノートも、PDMSを脆化さとホール（ステップ3.3）を打ち抜く際にクラックが発生する場合があります。 </li></ol></li><li>マスターモールドからマイクロ流体デバイスを削除します。かみそりの刃でPDMSブロックのうちの個別のマイクロ流体デバイスをカットし、マストからデバイスを削除えー。優しくデバイスの一角をリフトオフすることから始めます。遅いと穏やかな剥離が、まっすぐにPDMSブロックを持ち上げるとは対照的に、PDMSおよびマスターの両方のストレスを軽減します。 </li><li>チューブとマイクロチャネル間のアクセスのための接続ポートを作成するために、PDMSデバイスに穴をパンチ。生検パンチを使用して穴を作成し、デバイスの外側に至るチャンネル側からパンチ。 注：0.75ミリメートル内径穴を作成し、そのインターフェイスを完全エーテルエーテルケトンとエーテルケトン（PEEK）、チューブ（外径= 32,1 &quot;または0.79ミリメートル）またはポリエチレンチューブ（PE-20、外径= 0.043&quot;または1.09ミリメートルと生検パンチ）。浅いチャネル18を備えたデバイスに穴を視覚化するためにリングライトを使用してください。生検パンチがシャープであることを確認してください。繰り返し使用した後に刃先が鈍くや生検パンチは廃棄、交換する必要があります。 </li><li> PDMSのほこりや提出チャンクを除去するためにイソプロパノール（HPLCグレード）でPDMSデバイスをすすぐ。ことを確認してくださいパンチ穴は貫通穴スクイーズボトルから純粋なイソプロパノールの安定した流れを向けることによってデブリの明確である。ろ過された空気で乾燥ブロー。洗浄後、チャンネルの場所PDMSブロックは、デバイスの清浄度を維持するためのクリーンなペトリ皿に表向き。ボンディングまで、この形で、店のデバイスが必要な場合。 </li><li>メタノール（HPLCグレード）を洗浄することにより、ガラス基板を清掃し、濾過空気でブロー乾燥し、ガラスは、プラズマ処理の前に完全に清潔で乾燥していることを確認するために5〜10分間、200℃のホットプレート上に置きます。 注：ガラス基板は、各チャネルの底部を形成する。 10Xまたは20Xの目的は、並列に複数のチャネルを画像化するために理想的であるので、典型的にはガラススライドは、十分である。高解像度イメージングのために、カバースリップ（＃1.5厚さ）にデバイスを接着する。 </li><li>ガラス基板にPDMSデバイスを接着。 <ol><li>酸素プラズマは、チャネルPDMSブロックの側面とガラススライドの1側面を扱う。 注：Wハンドヘルド排出部番目、1分の処理時間を使用するが、各酸素プラズマ装置のための処理時間を最適化する。 </li><li>処理直後のガラスの処理面の上にPDMSのチャンネル側に配置します。 </li><li>結合を促進するために〜10秒間軽い圧力と一緒に持ってください。結合強度を改善するために、少なくとも15分間、高温（60〜80℃）で、装置全体焼く。 </li></ol></li></ol> 4。くびれチャンネルを通して細胞を変形させる<ol><li>顕微鏡下でマイクロ流体デバイスを調べます。チャンネルが崩壊したり、壊れていないことを確認し、両方の入口と出口の穴が低消費電力目標（10X）を使用して、デバイスのチャネルに直接接続すること。かみそりの刃でPDMSの表面を採点することによって欠陥デバイスを指定し、実験のために利用していない。 </li><li>細胞培養試料を調製するアッセイされる。標準的な条件を用いて培養細胞。 <ol><li> Fまたは、例えば、37℃で5％CO 2インキュベーター中で1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液および10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640培地中で培養するHL-60細胞。 </li><li>接着細胞の場合は、新鮮な増殖培地中のトリプシン処理および再懸濁することにより、それらを収穫。標準のトリプシン処理プロトコルを使用します。例えば、25cm 2の培養面積を有するフラスコに〜0.5ミリリットルのトリプシンを追加して、〜30ミリリットル新鮮な培地を再懸濁。以前19,20に記載されているように1×10 5細胞/ mlあたり5μMの最終濃度で、全トランスレチノイン（ATRA）による好中球系細胞へのHL-60細胞を分化する。 </li><li>遠心3分間300×gで細胞を慎重に0.1％（v / v）のF-127を含む新鮮な培養培地中で適切な最終密度に再懸濁した細胞上清を吸引除去する。 </li></ol></li><li>コー​​ルターカウンター、血球計を用いて細胞を数えるか、フローサイトメーター。 1×10 6×10 5個の密度に細胞懸濁液を調整<s&gt; 6細胞/ mlまで。サスペンション密度が設定されると、約0.1％v / vのF-127サプリメント。 注：細胞密度および界面活性剤濃度は、特定の細胞系に応じて変更する必要があり、 表1は、異なる細胞タイプの細胞およびF-127の以前に使用された濃度の記録を提供する。 </li><li>チューブフローサイトメーターで細胞懸濁液を置き、圧力キャップに接続します。細胞懸濁液は、チューブの先端から出てくるまでは、マイクロ流体デバイスにチューブを接続する前に、約14〜21キロパスカルの圧力とフラッシュを調整します。これはチューブと、デバイス内の気泡を最小限に抑えるのに役立ちます。 </li><li>デバイスの入口に細胞懸濁液を含むチューブの先端を挿入します。デバイスは、カバースリップに接着されている場合は、配管を接続する前に、そのような顕微鏡ステージなどの平らな固体表面上に置か;カバーガラスは壊れやすく、それ以外の場合は破損する可能性があります。 </li><li>チューブのintの部分を挿入します廃棄物収集のための空のチューブに出口や経路をOなどの顕微鏡ステージの側面にテープで留め、空のファルコンチューブなど。実験間のデバイスの全体の流体抵抗値の一貫性を保つために、入口と出口のチューブが各実験の同じ直径とほぼ同じ長さであることを確認してください。 </li><li>静かに約28キロパスカルの圧力を立ち上げるか、細胞がチャネルを通って流れるまで。複数のチャネルが視野にあり、画面の下部に垂直であるように、デバイスの位置を決めます。カメラは、データサイズによって制限されている場合は、独立したデータポイントの十分な数を生成するために、複数の動画を取得する。所望のデータ出力のために必要に応じてフレームレートを調整します。毎秒300フレーム（fps）での高速イメージングを使用して、細胞形状の変化をキャプチャするには、細胞の通過時間を測定するために、およそ100コマのフレームレートを使用する。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>ファイルマストを開きer_script.m（ダウンロード補足ファイル）、プログラムを実行します。 </li><li>表示されるWindowsエクスプローラのウィンドウから分析すべき最初のビデオを選択します。選択されたビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。 注：図は、それは最初のビデオのための長方形のトリミングウィンドウを選択するようにユーザに促す表示されます。 </li><li>左から右へのすべてのチャネルを包含し、ちょうど上部と下部（ 図3）でのチャンネルの配列の最初の電球の上のチャネルと交差するウィンドウを選択します。 </li><li>トリミングされた画像からくびれ領域を選択します。選択されたすべてのビデオのための上部と下部のウィンドウ境界の間の固定ピクセル距離を維持するために特別な注意を払ってください。 注：トップウィンドウの端が最上位のくびれを指定し、下部のウィンドウの端を一番下のくびれ（ 図4）を指定します。中間くびれは、このユーザー入力から近似される。次に、アルゴリズムは、sが表示され各ビデオの最初の50フレームのための細胞のegmentation（ 図5）。 </li><li>アルゴリズムは正確に細胞を配置しているかどうかを判断するために密接に左上の画像（ 図5A）を監視する。値化画像が識別されたセルの位置を示すためにソースビデオに重畳される。 注：異なるウィンドウ（ 図5B-5D）をコード診断のためであり、特定の画像処理後のビデオフレームを実証する。 </li><li> Windowsエクスプローラのウィンドウから次に処理するビデオを選択します。 注：このアルゴリズムは、選択された各ビデオのためのステップ5.2〜5.5を繰り返します。 </li><li> [キャンセル]を選択し、一度、すべての目的のビデオは、ビデオリストが完成し、関数に指示するWindowsエクスプローラのウィンドウを経由して追加されました。 注：このアルゴリズムは、ユーザーの介入なしに残りの操作を実行します。これは、処理されたビデオとコンピュータのPEの数に応じて約1〜2時間かかりますrformance。完了すると、アルゴリズムは、通過時間データのヒストグラムが生成されますし、MATLAB .MATファイルおよびMicrosoft Excelの.xlsファイルとしてディレクトリ内のデータを保存します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは利害関係はありません。

ここでは、圧力駆動流を使用してくびれたマイクロ流体チャネルを通して通過する細胞の変形を分析するための総合的な実験手順を提供する。 MATLABスクリプトは、自動データ処理（補足資料）を可能にし、コードの更新バージョン（維持されている<a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ）。より広義に、ここに提示技術は、細胞骨格の影響、核硬化剤24,23、ならびに癌細胞タイプ4,5の変形能をアッセイすることを含む、多くの細胞ベースのマイクロ流体アッセイに適合させることができる。画像の細胞内変形をより高解像度の顕微鏡検査と一緒になって、この方法は、細胞の機械的特性および生理学的および病理学的状態で発生する変化を研究するための強力なアプローチを提供します。 自動セル処理アルゴリズム <p class=「jove_contentは &quot;&gt;獲得したムービーは、...

細胞形状の変化は、多くの生物学的状況において重要である。例えば、赤血球および白血球は、独自の1直径よりも小さい毛細血管を変形させる。転移では、癌細胞は、セカンダリサイト2でシードする狭い間質ギャップだけでなく、曲がりくねった血管系とリンパのネットワークを介して変形させる必要があります。個別のセルの物理的挙動を調査するために、マイクロ流体デバイスは、狭い隙間3を通って移動し、受動的にミクロンスケールのくびれ3-9を通じて変形させる能力を含む、細胞挙動の範囲を研究するためにカスタマイズすることができる理想的なプラットフォームを提示します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスは、光学顕微鏡を用いて可視化し、基本的な画像処理ツールを用いて分析されるべき細胞の変形を可能にする、光学的に透明である。また、くびれのアレイを正確に同時に複数の細胞の分析を可能にする、定義することができ多くの既存の技術10,11を超えるスループット。 ここでは、「セルフォーマ」PDMSマイクロ流体デバイスを用いて細胞変形能をプロービングするための詳細な実験プロトコルを提示する。デバイスが設計され、順次くびれを通して細胞は継代するように。このジオメトリは、肺毛細血管床12のような生理学的文脈で一般的です。細胞変形能を測定するために、通過時間は容易に単収縮4,6を介して通過する個別の細胞に必要な時間として測定される便利なメトリックを提供する。細胞通過中のくびれチャネルにわたる圧力降下を一定に保つために、圧力駆動流を使用する。私たちのプロトコルは、細胞がくびれ一連の変形させるまでの時間を測定するためのデバイス設計および製造、圧力駆動流によるデバイス動作、細胞の調製およびイメージングだけでなく、画像処理の詳細な手順が含まれています。私たちは、デバイス設計と補助ファイルなどの視覚データ処理コードの両方。データの代表的なサンプルとして、継代くびれの数の関数として収縮一連のセル通過時間を示している。トランジットへの細胞のためのタイムスケールの分析は、マイクロ流体デバイスの狭いくびれ細胞型4,5,13の多様な変形能の違いを明らかにすることができるけれども。ここで実証したデバイスは、一意にミクロンスケールのくびれ一連の細胞輸送を調査。この設計は、細胞が循環中に体験し、また、そのような緩和時間などの細胞の追加の物理的特性をプロービング可能に曲がりくねった経路をエミュレートします。

<table><tbody><tr><td>プルロニックF-127ブロック共重合体界面活性剤&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>8409400</td><td>BASFによって製造され、シグマ</td></tr><tr><td>PDMSベースおよび架橋剤</td>を通じても利用可能 <td>エセックス・ブラウネル</td><td>DC-184-1.1</td><td>一般に呼ばれる製品 シルガード184エラストマー</td></tr><tr><td>酸素プラズマ放電ユニット</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D治療薬</td>生<td></td></tr><tr><td>検パンチ、ハリスユニコア(0.75 mm)</td><td>テッド・ペラ株式会社</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>フィンガータイトフェルール、1/32 "</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>フィンガータイトIIIフィッティング、10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブ、外径= 1/32 "または0.79 mm</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン(PE-20)チューブ、0.043 "または1.09 mm</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>圧力調整器</td><td>AirgasまたはPraxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリウレタンチューブ、5/32インチOD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Push-to-connect継手</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>電圧対圧力(E / P) 電空コンバータ</td><td>Omega</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16ビット、250 kS / S、80アナログ入力 多機能DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>アナログコネクタブロック-ネジ留め式端子</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>LabView システム設計ソフトウェア</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB ソフトウェア</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>MATLAB R2012a</td><td>コードには、Image Processing Toolbox</td></tr><tr><td>シールド ケーブル</td>が必要 <td>National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体技術は、cell変形能の探査

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

ここでは、詳細設計、製作、及び効率的な方法で個別の多数の細胞の変形能を評価するためのマイクロ流体デバイスの使用。典型的には、約10 2細胞についてのデータは、1時間の実験内で取得することができる。自動画像解析プログラムは、数時間以内に完了することが処理を可能にする、画像データを効率的に後の実験分析を可能にする。細胞は、それによってアッセイされるべき個体の細胞の初期変形及び時間依存性弛緩を可能にする、ミクロンスケールのくびれ一連の変形しなければならないという点で、私たちのデバイス形状が独特である。人間の前骨髄球性白血病（HL-60）細胞へのこの方法の適用が実証されている。圧力駆動流を用いたミクロンスケールのくびれを通って変形するようにセルを駆動する、私たちは人間の前骨髄球（HL-60）細胞が瞬間的に、その後の収縮によって、より迅速に継代する前に、9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐことを観察くびれあたり4.0ミリ秒の中央値は走行時間を有するイオン。これとは対照的に、オールトランスレチノイン酸処理（好中球型）HL-60細胞は、3.3ミリ秒の中央値は走行時間とその後のくびれを通して継代前にだけ4.3ミリの最初のくびれを塞ぐ。この方法は、細胞の粘弾性的性質への洞察を提供し、最終的には、この動作の分子の起源を明らかにすることができます。

異なる細胞型、ヒト骨髄性白血病細胞（HL-60）、分化した好中球細胞、マウスリンパ球細胞、およびヒト卵巣癌細胞系（OVCAR8、HEYA8）の変形性を調査するために「セルフォーマ &#39;マイクロ流体技術を用いて評価される。 図6に示すように、HL-60および好中球型HL-60細胞の通過時間のための代表的な結果は、くびれの一連通過する単一の細胞のための時間スケールを示す。トランジット時間は、個別の細胞集団で測定する28キロパスカル（ 図6）の駆動圧で7くびれの系列の各7μmの収縮。 図6に示すように、HL-60細胞は一時的に、その後のくびれを通して継代前に9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐ。対照的に、好中球型HL-60細胞は、以前にのみ4.3ミリ秒の最初の狭窄を塞ぐ継代。原子間力顕微鏡21とマイクロピペット吸引22によって決定されたHL-60細胞の短い通過時間は、それらの還元弾性及び粘性モジュラスと一致している。これらの結...

私たちは、ミクロンスケールのくびれのシーケンスを通過する細胞のためのタイムスケールを測定するためのマイクロ流体ベースのアッセイを実証する。

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

本実験の全般的な目的は、単純なマイクロ流体ベースのアッセイを用いて、異なる細胞種の変形能を調査することである。これは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスを作製し、ミクロンスケールの絞り構造の連続体を細胞が通過する際の時間スケールを調べることで達成される。次に、圧力駆動流を用いて細胞をマイクロ流路に送り込むことで、個々の細胞の変形および時間依存的な緩和を解析することが可能となる。その後、自動画像解析プログラムを実行してビデオを処理し、通過時間のデータのヒストグラムを取得する。結果から、一連の狭窄部を通過する所要時間に基づき、細胞種によって細胞変形能に差があることが示されました。原子間力顕微鏡やマイクロピペット吸引法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、マイクロ流体デバイスを用いることで高いスループットでの運用が可能になる点です。なお、細胞変形能の評価には、他のマイクロ流体デバイスも利用可能です。細胞が連続的な収縮部を通過するようにデバイスを設計します。この形状は、肺毛細血管床などの生理学的状況で一般的に見られます。まず、収縮部アレイチャネルの幅を平均的な細胞径の約30〜50%に、チャネルの高さを細胞径の少なくとも50%に設定して、マイクロ流体デバイスを設計します。また、デブリの除去および細胞凝集塊の分散を目的として、入口ポートにフィルターを組み込んでください。実験を開始する前に、リソグラフィー微細加工の標準的な手法を用いてデバイスマスターを作製します。プロフィロメーターを使用して、パターンの形状の高さを確認してください。次に、圧縮空気タンクと一連のエアレギュレーターおよび継手を用いて、圧力駆動流用の空気源を準備します。まず、空気供給タンクと手動レギュレーターを設置します。次に、手動レギュレーターと直列に電子制御式圧力レギュレーターを設置します。LabVIEWで記述された簡単なコードを使用して、目的の圧力を入力してください。電空コンバータは内部フィードバックループを使用して、バルブの出口圧力を調整し、マイクロ流体デバイス全体で指定された圧力に一致させます。標準的なフローサイトメーターチューブと、チューブに気密シールを作成する機械加工済みキャップを用いて細胞懸濁液チャンバーを組み立て、細胞懸濁液の流れを駆動させるための加圧チャンバーを設置します。圧力チャンバーのキャップには2つのオリフィスがあり、一方は圧縮空気タンクに接続する入口であり、もう一方は加圧チャンバーからデバイスへ細胞が流れる出口となっています。次に、1秒間に少なくとも100フレームの取得速度を持つカメラを装着した倒立顕微鏡をセットアップします。狭窄アレイを流れる細胞の画像をキャプチャするため、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて界面活性剤のストック溶液を調製します。細胞培地溶液に少量の界面活性剤を加えることで、PDMS壁への細胞接着を最小限に抑えることができます。マイクロ流体チャネルを備えたPDMSブロックを作製するには、10 gのPDMSベースに1 gの硬化剤を加え、十分に混合します。混合液をデバイスに注ぎます。ベルジャー内で真空引きを行い、内部に閉じ込められた気泡が消失するまで、または約10～20分間脱気します。この操作後、空気とPDMSの界面に気泡が残っている場合がありますが、これは正常な現象です。これらは通常、焼成中に消失します。その後、デバイスが冷却された状態で、脱気デバイスを65 °Cで4時間焼成します。マスターモールドからマイクロ流体デバイスを取り出します。まず、デバイスの隅をそっと持ち上げます。PDMSブロックを垂直に引き上げるのではなく、ゆっくりと優しく剥がすことで、PDMSとマスターの両方への負荷を軽減できます。カミソリを用いてPDMSブロックから個々のマイクロ流体デバイスを切り出し、マスターからデバイスを取り除きます。チューブとマイクロチャネルを接続するためのアクセスポートを作成するため、PDMSデバイスに穴を開けます。バイオプシーパンチを使用して、チャネル側からデバイスの外側に向かって穴を開けます。PDMSデバイスをイソプロパノールで洗浄し、ほこりやPDMSの塊を除去します。スクイズボトルから純粋なイソプロパノールを穴に勢いよく流し込み、パンチした穴にゴミが残っていないことを確認してください。フィルターを通した空気でブロードライしてください。ガラス基板をメタノールで洗浄します。その後、ろ過空気でブロー乾燥させ、200 °Cのホットプレート上に5〜10分間置いて、プラズマ処理の前にガラスが完全に洗浄され乾燥していることを確認します。テキストプロトコルに詳述されている通り、顕微鏡下でマイクロ流体デバイスを検査します。低倍率の対物レンズを使用して、チャネルが潰れたり破断したりしていないこと、および入口と出口の両方の穴がデバイスのチャネルに直接接続されていることを確認します。細胞懸濁液をフローサイトメーターチューブに入れ、マイクロ流体デバイスにチューブを接続する前にプレッシャーキャップに接続します。圧力を約14〜21 kilopascalsに調整し、細胞懸濁液がチューブの先端から出てくるまでフラッシングします。次に、デバイスを平らな面に置き、デバイスの入口にチューブを挿入します。PDMSデバイスの底面に接合されているガラスカバーガラスは非常に脆いため、注意してください。細胞懸濁液を含むチューブの先端をデバイスの入口に挿入します。次に、出口ポートにチューブを挿入し、顕微鏡ステージの側面にテープで固定した空のFalconチューブなどの廃棄物回収用チューブへと導きます。圧力を約28 kilopascalsまで、または細胞がチャネル内を流れるまで緩やかに上昇させます。複数のチャネルが視野に入り、かつ画面の下端に対して垂直になるようにデバイスを配置します。データ解析を開始するには、マスタースクリプトのmファイルを展開し、プログラムを実行してください。表示されるWindowsエクスプローラーウィンドウから、解析する最初のビデオを選択します。選択したビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。すると、矩形のクロッピングウィンドウを選択するよう促す図が表示されます。最初のビデオでは、左から右まで全てのチャネルを含むウィンドウを選択し、チャネル列の最初のバルブの直上でチャネルと交差するように設定します。上下については、クロップされた画像から収縮領域を選択してください。アルゴリズムは、各ビデオの最初の50フレームにおける細胞のセグメンテーションを表示します。アルゴリズムが細胞を正確に特定しているか、左上の画像を注意深く観察してください。処理済みの画像がソースビデオに重ねて表示されます。特定された細胞の位置を確認するため、Windowsエクスプローラーのウィンドウから次に処理するビデオを選択してください。アルゴリズムが繰り返されます。選択された各ビデオについて、「キャンセル」を選択してください。Windowsエクスプローラーのウィンドウを介して目的のビデオがすべて追加されたら、ビデオリストが完了したことを関数に指示します。HL 60および好中球型HL 60細胞の通過時間の代表的な結果は、単一細胞が一連の狭窄部を通過するまでのタイムスケールを示しています。7 µmの収縮部が7つ連続して配置された経路において、個々の細胞集団が各収縮部を通過する時間を測定します。28 kPaの駆動圧において、HL 60細胞は後続の収縮部へと移動する前に、最初の収縮部を中央値で9.3 msの間一時的に閉塞させます。対照的に、好中球分化HL 60細胞が最初の収縮部を閉塞させる時間は、移動前までわずか4.3 msでした。最初の狭窄部を通過すると、細胞は2番目から7番目までの残りの狭窄部をより速く通過し、通過時間の中央値はHL 60細胞で4.0 milliseconds、好中球型細胞で3.3 millisecondsでした。細胞集団間で通過時間を比較することで、細胞の変形能の違いを明らかにできます。このビデオを視聴することで、シンプルなマイクロ流体アッセイを用いて異なる細胞種の変形能を測定する方法について十分に理解できるはずです。ここでは、圧力駆動流を用いて細胞をマイクロ流路に流し、個々の細胞の変形と緩和を解析します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。...

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。...

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

新しいイメージングプロトコルは、カスタムモーター駆動の機械式アクチュエータを使用して開発され、生細胞の機械的ひずみに対するリアルタイムの応答の測定を可能にしました。メカノバイオロジーに関連して、このシステムは最大20%のひずみを適用でき、共焦点顕微鏡または原子間力顕微鏡によるほぼリアルタイムのイメージングを可能にします。...

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。...

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

この研究は、蛍光タンパク質マイクロパターンの可視化された変位に基づいて単一細胞収縮力の単純化されたハンズオフ定量化のために、マイクロウェルフォーマットで蛍光標識エラストマー収縮性表面(FLECS)技術を利用するための柔軟なプロトコルを提示する。...

マイクロパターンエラストマーを使用したシングルセル収縮性の簡素化されたハイスループット分析

ここでは、音響流体マイクロデバイスに基づいて細胞または核の圧縮率を測定するための高速で非破壊的なシステムを構築するためのプロトコルが提示されます。上皮間葉転換または電離放射線照射後の腫瘍細胞の機械的特性の変化を調べ、科学的研究および臨床診療におけるこの方法の適用の見通しを実証した。...

音響流体マイクロデバイスに基づく細胞・核の圧縮率測定

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。...

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

ここでは、振幅変調電極形成アプローチを使用したヒト赤血球の場合の機械的疲労試験のプロトコルを示します。この一般的なアプローチは、周期的変形からの懸濁液中の生物学的細胞の形態学的および生体力学的特性の系統的変化を測定するために使用することができる。...

生体細胞の機械的疲労を評価するための振幅変調電極形成

学ぼう、マイクロ流体デバイスを用いた細胞変形能測定法。PDMS製デバイスで微小縮流部を通過する細胞の通過時間を計測し、自動画像解析でヒストグラムを作成する。高スループットで細胞バイオメカニクスを評価できる革新的アプローチです。

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

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