4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

この手順の全体的な目標は、エンドソームを3次元空間で経時的または4次元で正確に画像化することです。これは、最初にヘビの筋肉を解剖し、イメージング皿に組織を配置することによって達成されます。2番目のステップは、エンドソーム形成を刺激するために、重要な染料で組織を染色することです。

次に、調製物を1つ以上の神経筋接合部について4次元で画像化します。最後のステップは、マクロエンドソームの挙動を特徴付けるための慎重なデータ解析です。最終的に、シナプス前空間内のエンドソームの存在と経時的な動きは、4次元蛍光イメージングによって実証できます。

この技術の主な利点は、ヘビの腹筋が厚さが1本だけであることであり、これにより標準的なエピ蛍光顕微鏡を使用して高品質の画像を生成することができます。爬虫類の組織は低温に保つ必要があるため、より長い時間生理学的に保たれ、細菌汚染が少なくなります。リソソームバイタル色素染色のために、染料は冷たい爬虫類リンガー溶液に1〜5, 000溶解されます。

最終濃度を0.2マイクロモルにするには、染料を組織に加え、摂氏4度で15分間インキュベートします。15分後、すべてのFM 1 43染色のために、ティッシュをコールドリンガーで数回洗浄します。染色する前に、サンプルを磁気ピン付きのイメージングディッシュに事前にマウントします。

このビデオでは、塩化カリウム刺激を使用したFM 1 43染色のみを示します。7マイクロモルの最終濃度を得るために高塩化カリウムリンガーで1〜500に希釈した染料を組織に添加し、次いで組織を摂氏4度で最大30〜60秒間インキュベートする。その後、すすぎごとに約1分間、コールドリンガーで3回すばやく洗浄しました。

すべての組織は、染色して冷たいリンガー溶液で洗浄した後、できるだけ早く画像化する必要があります。倒立顕微鏡を使用する場合は、底部に薄い丸いカバースリップが含まれているイメージングチャンバーを使用してください。通常、イメージングチャンバーの底部は直径25mmの薄いステンレス製です。

中央にある厚さ1番のガラスカバースリップで、イメージングの準備を構成します。磁気ピンを使用して、筋肉がイメージングディッシュ内でできるだけ中央に配置され、できるだけ平らになるように向きを変えます。調製物を少量のリンガー溶液で覆います。

皿をステージの中央にできるだけ近づけて取り付けます。可能な限り最高の3D解像度を得るために、適切な対物レンズを選択してください。このデモンストレーションのすべての実験には、63 x 水対物レンズが使用されます。

この手順を開始するには、スライドブック5.0でイメージングウィンドウを開きます。ここには、いくつかのメニューがタブに含まれています。2番目のタブZを使用して63 x水目標を選択し、Zスタック間隔を設定します。

この例では、1.5ミクロンのZステップがライブイメージングに使用されています。タイムラプスのフレームレートを選択します。最適なレートとは、移動の相互作用や融合イベントなど、時間の経過に伴う変化をスムーズに解決するのに十分なレートです。

たとえば、10 個のタイム ポイントが 32 番目の間隔で、合計時間間隔が 5 分であるとします。次に、関心のある焦点の上部に手動でフォーカスされた端末をライブで表示しながら、被写界深度の合計を選択し、その少し上に移動します。[トップ設定] を選択します。

すべての焦点が合わなくなるまで、サンプルにゆっくりと焦点を合わせます。ここでも、表示される平面の数と合計移動量の値は、キャプチャウィンドウで選択した被写界深度を示します。選択したばかりのパラメータを転送するには、使用した上部と下部の位置のラジオボタンを選択します 画像キャプチャの場合は、画像取得を開始します。

特定の調製物について、すべてのライブイメージングを完了します。デジタルストレージは通常問題にならない間、すべての生データファイルを保持します。処理時間は、高速なパーソナルコンピュータやワークステーションでも重要です。

このため、画像を関心領域に切り抜くと、関心領域全体が全体的に切り抜かれたウィンドウに表示されるようになります。コースDでは、適切なソフトウェアと正しい点像分布関数を使用して画像スタックを行い、解像度が向上し、デコンボリューションアルゴリズムによってアーティファクトが生成されていないことを確認します。補間アルゴリズムを使用して Z 軸を拡張します。

見かけの解像度では、実際の1.5ミクロンの画像面の分離から見かけの0.25ミクロンの分離への6倍の拡大が示唆されています。コントラストの明るさ、ノイズフィルタリング、写真の退色、およびその他の一般的な画像処理調整を実行します。必要に応じて。

画像操作の基準では、ほとんどの科学作業では、スタック内と異なる時点の両方で、すべての画像に同じ補正を適用することが適切であると規定されています。特定の調整の結果は、すべての画像で評価する必要があります。さまざまなフィルタリングと画像強調の手法を試してみてください。

たとえば、レロスとフィルタリングは、背景の上の小さな構造のコントラストを上げるのに役立ちます。ランニング ウィンドウの中央にあるピクセルの明るさは向上し、周辺領域の明るさは低下します。一部のフィルタリング方法は、組み合わせてうまく機能しないことに注意してください。

時間の経過とともに製剤に大幅な動きがある場合は、ドリフト補正を適用します。このような動きは、活動電位とシナプス電位を抑制するために薬物が追加されていても、生きている筋肉では一般的です。ピクセルレジストレーションアルゴリズムは、タイムラプス画像を整列させ、そのような動きを減らすことができますが、通常は完全に排除することはできません。

この研究では、ヘビの神経筋終末の4Dライブイメージングを使用して、マクロエンドソームまたは私が原形質膜に向かって移動し、すぐに消えるかどうかを決定し、一部のエンドソームが細胞にアクセスするためにその数が減少することを示唆しています。データは、60 秒のフレーム間隔で 6 つの時点に 3D ボリューム ビューとして表示されます。1つのブトンのZ深さを説明するために、赤い破線で示されたY軸から離れて移動し、5点目と6点の間で消失する前にいくつかのフレームにわたって移動していること、消失に必要な時間がフレーム間隔よりも短かったことは、消失直前のエキソサイトーシスと一致することが観察できます。

MEはバトンの原形質膜に位置しているようです。次に、同じ生データセットを低倍率のムービーとして表示します。このシーケンスは、Y軸を中心とした24の3D回転ステップの開始時に一時的に一時停止し、赤い矢印で示されているもうすぐ消える私に注意を引き付けます。

MEが見えると、ボタンの端が消え、すべての視点で戻らないことに注意してください。XY解像度に比べてZ軸の解像度が低いため、MEの形状は、見る視点に応じて長くなったり短くなったりします。電子顕微鏡による研究により、モーター終末のエンドソームは光の回折限界付近でサイズが小さいことが示されています。

したがって、これらのエンドソームの融合は、光レベルでの密接な空間的関連性と完全に区別することはできません。この研究では、Meesは緑色で示されるFM1 43で標識され、酸性エンドソームまたはAEはリソソームで標識されました。4D映画の1つの時点からのデータで赤で示されたバイタル色素は、3つの方向の3Dボリュームビューとして表示されます。

トップパネル1から3は、XY平面の上からの従来のビューを示しています。中央のパネル 4 から 6 は、XY 平面に垂直で、大きな赤い矢印の方向にあるビューを示しています。下部のパネル 7 から 9 は、大きな青い矢印の方向に上の両方のビューに対して相互に垂直なビューを示しています。

me は緑色の矢印でマークされ、2 つの AE は赤色の矢印でマークされます。黄色に見える両方の色で蛍光を発する構造は、4つのD画像記録で時々観察されました。この例では、両方の色素を含むエンドソームは、パネル3、6、および9で黄色の矢印でマークされています。

赤と緑の重なりは、3つの直交投影法すべてで等しく完全であり、推定上の融合em me aeを示しています。このムービーは、同じデータセットが Y 軸を中心に 1 秒あたり 1 フレーム回転するように設定されていることを示しています。推定融合MEAEは、すべての観点から黄色のままです。

デジタルデコンボリューションは、3D画像と4D画像の解像度を向上させるのに便利なツールです。ここでは、生データと委譲されたデータの比較を示します。FM1 43による刺激中に染色された典型的なヘビ神経終末の1つについて、一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば30〜60分で行うことができます。

この手順に続いて、マクロエンドソームとシナプス前マーカーとの共局在などの追加の質問に答えるために、免疫組織化学などの他の方法を実行することができます。