Name: 幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶ脊髄切断法を用いたゼブラフィッシュ幼生の神経再生メカニズム。傷害後2日で感覚回復、3日でC字運動が観察され、免疫蛍光顕微鏡で神経前駆細胞応答を評価できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、畜産用のユタ大学のゼブラフィッシュ施設にお世話になっている。 RIDは、NIH R56NS053897によってサポートされ、LKBはハワードヒューズマックイントゥ·グラッドイニシアティブでサポートされている博士号を取得する前の研修生だった。

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って上昇して飼育した。実験は、ユタ大学の機関動物実験委員会によって承認された。 外科プレートの1。準備<ol><li>製造者の指示に従って、60ミリメートルペトリ皿とシルガード184シリコーンエラストマーキットを使用した手術プレートを作成します。ハーフフル超えない料理を記入し、重合させることができます。ストアは、室温でカバーした。 </li></ol>マイクロピペットの2。準備<ol><li>加熱およびマイクロインジェクションの針を作るために同じ設定を使用してマイクロピペットプラーで薄肉ホウケイ酸キャピラリーチューブを引っ張ってマイクロピペットを製作。 </li><li>解剖顕微鏡下では、ピンセットで直径約200μmのマイクロピペットの先端をオフにスナップします。 </li><li> 25℃で第二面取りが続く35°に最初にmicrogrinderとベベル壊れエッジ。先端が鋭く、SMOであることを確認してくださいOTH。ストアは、粘土を少量にペトリ皿に傾斜したマイクロピペットを終えた。 </li></ol>ゼブラフィッシュ幼生の3。準備<ol><li>手術前7日間は、男性と女性のゼブラフィッシュの合わせタンクを設置しました。 </li><li>ライトは最大収率を確保するために点灯3時間後、翌朝の胚を収集します。 28.5℃で、E3の25ミリリットル中knu3、ソート受精胚100/100 mmプレート：などのTg（EGFP elevl3）トランスジェニックレポーターラインを使用している場合28.5℃で、E3の25ミリリットル中の野生型を使用している場合は、ソート受精胚100分の25 mmプレート</li><li>リポーターラインを使用している場合は、48 HPFの蛍光式の胚を選別。識別された胚は28.5℃で、E3の25ミリリットルで100分の25 mmプレートの密度で成熟することができます</li><li>幼虫は5 DPFである場合には、E2 + 10 mg / Lの硫酸ゲンタマイシン（GS）+トリカインでシルガードを覆うことにより、手術プレートを準備します。 <ol><li> 100ミリメートルペトリDISに25ミリリットルのE2 + GSを追加することで、回復の料理を準備しますH。 </li><li>一緒に3綿棒をテーピングでメスを準備します。これは、3つの溝を有する三角形のツールを形成する。 </li><li>溝の1にそれをテープで綿棒に準備されたマイクロピペットをマウントします。 </li></ol></li><li> 1ミリリットル注射器や綿棒に取り付ける前に27 G針を使用して、E2 + GSで透明になるまでフラッシュ、マイクロピペットを再利用する場合。 </li></ol> 4。手術<ol><li>トリカインとの時間（25 FISH）で幼虫の1プレートを麻酔。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚が十分に麻酔する。それは、メスが接触した場合に、それ以外の場合はけいれんし、魚が完全に手術前に麻酔をかけることが重要です。手術は、解剖顕微鏡下で行われる。 </li><li>手術プレートに幼虫を移します。 <ol><li>それはメスを持つ手に、その背中に最も近いとの側にあるように、最大​​倍率の下では、一度に1幼虫を回転させる。 </li><li>それらはシルガードに載るように位置が、鉗子幼虫の幅にわたって傾斜し。 </li><li>鉗子のアームの1に対するガラスメスをブレー​​ス、必ず脊索の腹側縁部を越えて切らないようなので、肛門毛穴のレベルで幼虫の背側面にカット。脊髄を切断するメスをねじります。 </li><li>残りの幼虫を繰り返します。 注意：幼虫出血した場​​合、それは手術から回復しません。すぐに手術プレートから幼虫を削除し、トリカインの過剰摂取を経由して、それを安楽死させる。 </li></ol></li><li>幼虫のバッチの手術が完了すると、転送が回復板に動物が負傷した。これは麻酔のクリアをサポートすることです。 <ol><li>注意：転送のため負傷した幼虫を収集する際、彼らが最初に頭や尾を収集していることを確認してください。幼虫を折り曲げて損傷部位を圧迫することはありません。 注：手術のために使用するすべてのデバイスは、マイクロピペットを含め、再利用することができます。 </li></ol></li></ol> 5。復旧<ol><li> TR25/plateの密度で、25ミリリットルE2 + GSが充填された100mmプレートに回収プレートからansfer負傷幼虫。 28.5℃のインキュベーターで回復することができます。 </li><li>病気や死んだ動物を除去し、日々のプレートを確認してください。 Coleps（淡水原虫）がメディアに表示されるまで、メディアを変更しないでください。メディアを変更する場合は、新しいプレートに魚を転送しない。代わりに、可能な限り多くのメディアを削除し、新しいメディアと同じプレートをあふれさせる。 Colepsの人口を減らすために、必要に応じて繰り返します。 </li><li>粉末状の稚魚食品の少量を毎日食べます。 注意：ライブ食品（ 例えば 、ゾウリムシやワムシ）は、彼らが運動を回復した後まで負傷した幼虫に供給することができません。それ以外の場合は、ライブ食べ物は損傷部位を植民地化し、幼虫を殺すでしょう。 </li></ol>

<ol><li>Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem%2Fprogenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li>
<li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li>
<li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li>
<li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li>
<li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li>
<li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li>
<li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li>
<li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li>
<li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressor+activity+of+Headless%2FTcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

当初はこの手法を学習するとき、我々は、単一のセッションにはもう50〜100以上の離断をしようとしてお勧めします。このテクニックをマスターした後、我々は時間当たり300胚まで横断することができます。しかし、スループットのレベルは、毎週の練習の数ヶ月を必要とします。また、レポーター線と練習および不完全脊髄切断の発生率が1％未満になるまで完全に離断を検証することをお勧めします。 大人のゼブラフィッシュにおける脊髄切断は、損傷後の軸索再生および神経発生を研究するための十分に確立された、堅牢な手法である。幼虫の生物にこの分析を移動させることにより、我々は、 インビボでの回復を検討することができる。さらに、我々はまた、 例えば 、再生過程でTcf7l1a 12を種々の遺伝子の役割を調べるために大人のゼブラフィッシュでは使用できない遺伝的なツールを利用することができる。 もともとD負傷した動物は2解像度により損傷部位への尾に触れる応答を示し、軸索は5解像度によって損...

人間の脊髄への大きな外傷は、しばしば軸索を再成長や神経新生1,2を再開することができないことに、永続的な麻痺や損傷のレベル以下の感覚の損失をもたらす。哺乳類とは対照的に、しかし、サンショウウオやゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）を含むanamniotesでも、完全な脊髄切断の3,4の後に強固な回復を示している。 大人のゼブラフィッシュは、脊髄損傷の5-7次の回復過程を研究するための十分に確立されたモデルである。完全な脊髄切断後、感覚や機関車の機能の再構築は、損傷後8 6週間で成人のゼブラフィッシュで観察される。 インビボでの再生過程を調べるために、我々は、透明な幼虫のゼブラフィッシュ9になった。 ここでは、5日後に受精（DPF）幼虫ゼブラフィッシュUSIの脊髄を横断するための方法を提示バットから変更小刀などの面取りマイクロインジェクションピペットを、、Ng ら。10この方法は、高スループット、低死亡率、および再現性をサポートしています。練習すれば300幼虫/ HRは横に切開することができ、3600以上の動物を含む離断の6ヶ月間にわたって、0.72％±98.75パーセントは、7日間、損傷後（DPI）まで生存した。我々のデータは、同様に、感覚と運動の急速な回復を示しています。1 dpiで、負傷した魚にすべての動きだけ胸びれ運動によって駆動される。しかし、幼虫は、2解像度によって離断にタッチ尾針タングステンに反応する3解像度によるC曲げ運動を再確立し、5解像度11で捕食水泳を表示し始める。アセチル化チューブリンに対する抗体染色を用いて、我々は、軸索は1 dpiで損傷部位には存在しないことを確認したが、5解像度によって損傷部位を横断している。我々は、このプロトコルは、損傷後の脊髄における軸索再生および神経発生の研究のための貴重な技術を提供すると確信しています。 </p&gt;

<table><tbody><tr><td>60 mmペトリ皿</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>100 mmペトリ皿</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>PDMS、Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸キャピラリーチューブ:OD 1.00 mm、ID 0.78 mm</td><td>ワーナーインスツルメンツ株式会社</td><td>64-0778</td><td></td></tr><tr><td>フォーセプス</td><td>ファイン・サイエンティフィック・ツールズ・インク</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ6454</td><td></td></tr><tr><td>マイクログラインダー</td><td>成重</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td>アムレスコ</td><td>0304-5G</td>を<td>水10mg / mlに溶解し、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Acros Organics</td><td>118000100</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター、木材、6インチ</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>27 G ニードル</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>フライ食品</td><td>Argent Labs</td><td>F-ARGE-PTL-CN</td><td>ストア -20 >C</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>モデルP-97</td><td>ボックスフィラメントFB330B</td></tr><tr><td colspan =" 4">20x E2(1 L);><RT</td></tr><tr><td>17.5 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>0.75 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>2.90 g CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>4.90 g MgSO4&middot;7H2O</td><td>Merck</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>0.41 g KH2PO4</sub</td><td>>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>0.12 g Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">500x NaCO3 (10 ml);</強い>新鮮なものを作り、余分な</td></tr><tr><td>0.35 gのNaCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td colspan =" 4">1x E2(1 L)を捨てます。</ストロング> RT</td></tr><tr><td>50 ml 20x E2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml フレッシュ 500x NaCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

哺乳類は軸索損傷のレベル以下の再成長だけでなく、脊髄神経発生を再開することができないことが不足しているため、脊髄損傷後の感覚と運動の回復に失敗します。しかし、脊髄の完全な切断後の感覚と機能回復の両方ゼブラフィッシュゼブラフィッシュの展示を含むいくつかのanamniotes。大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって感覚と運動の回復を、脊髄損傷後の再生を研究するための確立されたモデル生物である。透明幼虫ゼブラフィッシュで利用可能な再生過程のin vivo解析だけでなく、大人ではアクセスできません遺伝的なツールを活用するために、我々は脊髄切断後の再生を研究するため、幼虫のゼブラフィッシュを使用しています。ここでは、再現性と検証可能幼虫脊髄を離断するための方法を示しています。切断後、我々のデータは2日後損傷（DPI）から始まる感覚の回復を示しており、ウィット5解像度による自由遊泳の3解像度および再開によって検出可能なH C - 曲げ運動。したがって、私たちは、脊髄損傷後の回復の研究のための大人のゼブラフィッシュのコンパニオンツールとして幼虫のゼブラフィッシュを提案する。

損傷部位の周囲の組織損傷の重症度を低減するために、マイクロピペットを適切に面取りが重要である。 図1（a）は正しくベベル先端を示している。広すぎる先端（ 図1B）を使用することで（ 図1C）が狭すぎる先端ながら、原因背側大動脈のニッキング可能性の増大に高い死亡者が発生する傾向がある肌オフ一目ではなく、組織を切断する傾向がある。 この手法を実施するために、そのようなTgの（elevl3：eGFPの）などのレポーターラインを使用することが有利で ​​ある。：1 dpiでゼブラフィッシュ脊髄を可視化するknu3 図2Aは、ライブのTg（eGFPをelevl3）の完全離断脊髄を示す図2Bは、3dpiで同じ生きた魚を示して2Cおよび2Dは ​​固定TG（db...

脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

本手順の全体的な目的は、生存率を最大限に高めつつ、比較的ハイスループットで再現性の高い手法を用いて、ゼブラフィッシュ幼魚の脊髄を完全に切断することです。まず、適切な遺伝子型の成魚を交配させ、必要に応じてスクリーニングを行います。次に、受精後5日目まで胚を育成させます。次に、面取りされたマイクロインジェクションピペットを用いて横断切断を行います。最後に、損傷した魚を抗生物質処理済みの培地で実験終了まで回復させます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、損傷に対する神経前駆細胞の反応を示します。BeckerラボやFetcherラボが先駆的に開発した既存の手法と比較した本手法の主な利点は、解析に用いる個体数を増やせること、回復時間が短縮されること、および成体ゼブラフィッシュでは通常利用できない遺伝学的ツールを使用できることです。この手法は、損傷に対する神経前駆細胞の応答など、再生分野における重要な疑問の解決に寄与します。まず、60 mmのペトリ皿とSylgard 180 4シリコンエラストマーキットを用いて、手術用プレートを作成し、準備を開始します。製造元の指示に従い、ディッシュの半分以下まで液体を満たし、重合させます。その後、ディッシュに蓋をして室温で保存します。次に、解剖顕微鏡下でマイクロインジェクション針を作成した時と同じ設定を用い、マイクロピペットプラーで薄壁ホウケイ酸ガラスキャピラリー管を加熱・延伸して、マイクロピペットを作製します。ピンセットを使用して、マイクロピペットの先端を直径約200 µmになるまで折り取ります。その後、マイクログラインダーを用いて、まず35度で破断面を面取りし、研磨音が止まったところで、さらに25度で2回目の面取りを行います。解剖顕微鏡下で、先端が鋭く滑らかであることを確認します。先端が広すぎると、背側大動脈を傷つける可能性が高まり、致死率が上昇する傾向があります。一方で、先端が狭すぎると、組織を切断せずに皮膚を滑ってしまう傾向があります。正しくベベル加工したマイクロピペットは、手術の7日前に少量の粘土を敷いたペトリ皿に入れて保存してください。雄と雌のspr. Fishの交配タンクを設置します。点灯から3時間後の翌朝に、受精卵を回収します。これにより、最大限の収量を確保します。ジェノタイプが混在するトランスジェニックリポーター系統を使用する場合は、1プレートあたり100個の胚を配置し、28.5 °Cでインキュベートします。リポーター系統を使用している場合は、受精後48時間で胚の蛍光発現をスクリーニングしてください。蛍光胚を28.5 °Cで、幼生になるか受精後5日目まで成熟させます。セルガードをE2、10 mg/Lのゲンタマイシン硫酸塩、およびトリカで覆い、手術用プレートを準備します。さらに、100 mmのペトリ皿に25 mLのE2とゲンタマイシン硫酸塩を加え、回復用ディッシュを準備します。次のステップでは、3本のスワブをテープで留めてスカルペルハンドルを作成します。これにより、3つの溝を持つ三角形のツールが形成されます。次に、準備したマイクロピペットをスワブの溝の1つにテープで固定してマウントし、スカルペルを完成させます。マイクロピペットは、使用するまで脇に置いておきます。一度に25匹の幼魚を1プレート分ずつ麻酔にかけることから手術を開始します。Tricaを使用する場合、魚が接触反応を示さなくなった時点で十分に麻酔がかかったことになります。幼魚を手術用プレートに移し、そのプレートを実体顕微鏡の下に置きます。最大倍率で、幼虫1匹を、背中側がメスを持つ手に最も近くなるように横向きに回転させます。ピンセットをセルガードの上に置きます。幼虫の幅に対して角度をつけ、ガラスメスをピンセットの片方の腕に当てて固定します。幼虫の肛門孔の高さで、背外側面に切開を入れます。このとき、脊髄の腹側端より深く切らないように注意してください。その後、メスをひねって脊髄を切断します。必要な回転角度は通常90度よりずっと小さくなります。残りの幼魚に対しても脊髄切断を繰り返します。一連の幼魚への手術が完了したら、後方ピペットとピペットポンプを使用して、損傷した個体を回復プレートに移動させます。麻酔を解除するため、移送時は必ず幼魚の頭部または尾部から先に回収してください。麻酔が切れた後は、幼魚を曲げて損傷部位に負荷をかけないようにしてください。回復プレートから、25 mLのE2培地とゲンタマイシン硫酸塩を満たした100 mmプレートに、1枚あたり25匹の密度で損傷した幼魚を移送します。その後、傷が治るまで28.5 °Cのインキュベーターに入れます。プレートを毎日点検し、病気になった個体や死んだ個体を除去してください。淡水原生動物のコープ（coops）が培地に見えるまで、培地を交換しないでください。培地を交換する際は、魚を新しいプレートに移さないでください。代わりに、可能な限り多くの培地を除去し、同じプレートに新しい培地を充填してください。必要に応じて培地交換を繰り返し、コープスの個体数を減少させます。粉末状の稚魚用餌を少量、毎日幼魚に与えます。ここでは、脊髄を完全に切断した1日目のゼブラフィッシュを示しています。損傷後、すべてのニューロンでGFPが発現しており、黄色い矢印で損傷部位を示しています。ここでは、脊髄を完全に切断したゼブラフィッシュの損傷後3日目の様子を示しています。この固定されたUCD標識ゼブラフィッシュは、脊髄が完全に切断された状態であることを示しています。黄色い矢印が再び損傷部位を示しています。対照的に、脊髄の腹側縁に沿った神経標識の連続領域が確認できます。損傷から3日後に固定されたこのゼブラフィッシュは、不完全断裂であることを示しています。この手法に習熟すれば、1時間あたり300匹の幼虫を処理することが可能です。

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。...

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュの成体の神経新生と再生の細胞的および分子的メカニズムを明らかにするために、ゼブラフィッシュの成体終脳に機械的損傷を引き起こす侵襲的手術と、その後の免疫組織化学またはin...

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。...

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

脊髄損傷後の機能回復が可能な成体ゼブラフィッシュは、神経再生の先天的なメカニズムを解明するための最高のモデルシステムです。ここでは、脊髄再生の機能的読み出しとしての水泳持久力および水泳行動アッセイについて説明する。...

成体ゼブラフィッシュの水泳持久力と水泳行動の評価

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

アフリカツメガエル・ラエビス・...

アフリカツメガエル・ ラエビス ・オタマジャクシの脊髄切除

このプロトコルは、成体ゼブラフィッシュにおけるいくつかの尾側筋腫の深刻な損傷を誘発するための凍結損傷モデルについて説明しています。この方法は、非哺乳類脊椎動物の重度の組織喪失後の骨格筋再生を研究するための新しいアプローチを提供します。...

ゼブラフィッシュ成体における尾柄の骨格筋再生研究のための凍結損傷モデル

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

学ぶ脊髄切断法を用いたゼブラフィッシュ幼生の神経再生メカニズム。傷害後2日で感覚回復、3日でC字運動が観察され、免疫蛍光顕微鏡で神経前駆細胞応答を評価できます。

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

さらに動画を探す