幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

本手順の全体的な目的は、生存率を最大限に高めつつ、比較的ハイスループットで再現性の高い手法を用いて、ゼブラフィッシュ幼魚の脊髄を完全に切断することです。まず、適切な遺伝子型の成魚を交配させ、必要に応じてスクリーニングを行います。次に、受精後5日目まで胚を育成させます。

次に、面取りされたマイクロインジェクションピペットを用いて横断切断を行います。最後に、損傷した魚を抗生物質処理済みの培地で実験終了まで回復させます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、損傷に対する神経前駆細胞の反応を示します。

BeckerラボやFetcherラボが先駆的に開発した既存の手法と比較した本手法の主な利点は、解析に用いる個体数を増やせること、回復時間が短縮されること、および成体ゼブラフィッシュでは通常利用できない遺伝学的ツールを使用できることです。この手法は、損傷に対する神経前駆細胞の応答など、再生分野における重要な疑問の解決に寄与します。まず、60 mmのペトリ皿とSylgard 180 4シリコンエラストマーキットを用いて、手術用プレートを作成し、準備を開始します。

製造元の指示に従い、ディッシュの半分以下まで液体を満たし、重合させます。その後、ディッシュに蓋をして室温で保存します。

次に、解剖顕微鏡下でマイクロインジェクション針を作成した時と同じ設定を用い、マイクロピペットプラーで薄壁ホウケイ酸ガラスキャピラリー管を加熱・延伸して、マイクロピペットを作製します。ピンセットを使用して、マイクロピペットの先端を直径約200 µmになるまで折り取ります。その後、マイクログラインダーを用いて、まず35度で破断面を面取りし、研磨音が止まったところで、さらに25度で2回目の面取りを行います。

解剖顕微鏡下で、先端が鋭く滑らかであることを確認します。先端が広すぎると、背側大動脈を傷つける可能性が高まり、致死率が上昇する傾向があります。一方で、先端が狭すぎると、組織を切断せずに皮膚を滑ってしまう傾向があります。正しくベベル加工したマイクロピペットは、手術の7日前に少量の粘土を敷いたペトリ皿に入れて保存してください。

雄と雌のspr. Fishの交配タンクを設置します。点灯から3時間後の翌朝に、受精卵を回収します。これにより、最大限の収量を確保します。

ジェノタイプが混在するトランスジェニックリポーター系統を使用する場合は、1プレートあたり100個の胚を配置し、28.5 °Cでインキュベートします。リポーター系統を使用している場合は、受精後48時間で胚の蛍光発現をスクリーニングしてください。

蛍光胚を28.5 °Cで、幼生になるか受精後5日目まで成熟させます。セルガードをE2、10 mg/Lのゲンタマイシン硫酸塩、およびトリカで覆い、手術用プレートを準備します。さらに、100 mmのペトリ皿に25 mLのE2とゲンタマイシン硫酸塩を加え、回復用ディッシュを準備します。

次のステップでは、3本のスワブをテープで留めてスカルペルハンドルを作成します。これにより、3つの溝を持つ三角形のツールが形成されます。次に、準備したマイクロピペットをスワブの溝の1つにテープで固定してマウントし、スカルペルを完成させます。マイクロピペットは、使用するまで脇に置いておきます。

一度に25匹の幼魚を1プレート分ずつ麻酔にかけることから手術を開始します。Tricaを使用する場合、魚が接触反応を示さなくなった時点で十分に麻酔がかかったことになります。幼魚を手術用プレートに移し、そのプレートを実体顕微鏡の下に置きます。

最大倍率で、幼虫1匹を、背中側がメスを持つ手に最も近くなるように横向きに回転させます。ピンセットをセルガードの上に置きます。幼虫の幅に対して角度をつけ、ガラスメスをピンセットの片方の腕に当てて固定します。

幼虫の肛門孔の高さで、背外側面に切開を入れます。このとき、脊髄の腹側端より深く切らないように注意してください。その後、メスをひねって脊髄を切断します。

必要な回転角度は通常90度よりずっと小さくなります。残りの幼魚に対しても脊髄切断を繰り返します。一連の幼魚への手術が完了したら、後方ピペットとピペットポンプを使用して、損傷した個体を回復プレートに移動させます。

麻酔を解除するため、移送時は必ず幼魚の頭部または尾部から先に回収してください。麻酔が切れた後は、幼魚を曲げて損傷部位に負荷をかけないようにしてください。回復プレートから、25 mLのE2培地とゲンタマイシン硫酸塩を満たした100 mmプレートに、1枚あたり25匹の密度で損傷した幼魚を移送します。

その後、傷が治るまで28.5 °Cのインキュベーターに入れます。プレートを毎日点検し、病気になった個体や死んだ個体を除去してください。

淡水原生動物のコープ（coops）が培地に見えるまで、培地を交換しないでください。培地を交換する際は、魚を新しいプレートに移さないでください。代わりに、可能な限り多くの培地を除去し、同じプレートに新しい培地を充填してください。

必要に応じて培地交換を繰り返し、コープスの個体数を減少させます。粉末状の稚魚用餌を少量、毎日幼魚に与えます。ここでは、脊髄を完全に切断した1日目のゼブラフィッシュを示しています。

損傷後、すべてのニューロンでGFPが発現しており、黄色い矢印で損傷部位を示しています。ここでは、脊髄を完全に切断したゼブラフィッシュの損傷後3日目の様子を示しています。この固定されたUCD標識ゼブラフィッシュは、脊髄が完全に切断された状態であることを示しています。

黄色い矢印が再び損傷部位を示しています。対照的に、脊髄の腹側縁に沿った神経標識の連続領域が確認できます。損傷から3日後に固定されたこのゼブラフィッシュは、不完全断裂であることを示しています。

この手法に習熟すれば、1時間あたり300匹の幼虫を処理することが可能です。