Name: 貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ 微小膠細胞によるシナプス成分の貪食を可視化・定量化する方法。網膜神経節細胞の前シナプス入力を蛍光標識し、共焦点顕微鏡で解析することで、CNSの免疫細胞と神経細胞間の相互作用を評価できます。

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、、、NRSA（DPS F32-NS-066698）;作業はスミスファミリー財団（BS）、ダナ財団（BS）、ジョン·メルク奨学金プログラム（BS）、NINDS（BS RO1-NS-07100801）からの補助金によって支えられてナンシー·ルーリーマーク財団（DPS）、NIH（P30-HD-18655; MRDDRCイメージングコア）。

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<li>Noda, M., Suzumura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweepers+in+the+CNS%3A+Microglial+Migration+and+Phagocytosis+in+the+Alzheimer+Disease+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Sweepers in the CNS: Microglial Migration and Phagocytosis in the Alzheimer Disease Pathogenesis.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2012).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

正確に食作用を測定するために、飲み込ま材料がリソソーム分解が発生した後、研究者はそれを視覚化することができるようにラベル付けされなければならない。さらに、高解像度イメージングは​​、セル全体の体積を可視化し、その内容を定量化する研究を可能にするソフトウェアを使用し、続いて、必要とされる。このプロトコルでは、高解像度の共焦点顕微鏡および三次元再構成と組み合わさ飲み込ま物質を標識するAlexa色素にコンジュゲートCTBを用いて食細胞媒介性の貪食を測定するための信頼性の高い定量的な方法を記載している。この方法論は正常に発達中のマウスの脳（retinogeniculateシステム）7におけるシナプスリモデリングを受けているシナプス前入力のミクログリア媒介、貪食を分析するために私たちの研究室で使用されてきた。また、未定義異なる発達経年飲み込みの微妙な変化を区別することができる高感度の技術であることが証明されているR非病理学的状態および野生型およびノックアウトマウスの間。わずかな調整で、このプロトコルは、タイムラプス撮影により生体組織に貪食を研究するために適合させることができる。また、このプロトコルは、疾患における食細胞 - ...

<html>シナプス回路は、動物の生涯を通じて改造。発達中の脳では、シナプスを過剰に形成し、シナプスのサブセットを選択的に除去し、8月10日のまま、それらのシナプスの維持·強化を伴うシナプス刈り込みを受けなければならない。このプロセスは、成体の神経系の正確な接続の特性を達成するために必要である。成人において、シナプスは、特に学習および記憶の文脈において、プラスチック製とすることができる。この可塑性の構造的な相関を、樹状突起およびシナプス前終末11-13の添加および/ ​​または除去を含むと考えられている。健康的な神経系のこれらの役割に加えて、シナプスのリモデリングにも神経系疾患/傷害12,14,15に関与している。例えば、脊髄損傷後、切断された軸索は、その後、改造や機能回復の16〜19を実現するために新たなシナプスを形成する必要があります。 NTは&quot;&gt;シナプス可塑性の重要な側面として浮上して、食作用または削除3,5,20宛てシナプスの飲み込みのプロセスです。我々は最近、健康で、出生後のマウス脳7におけるシナプス刈り込みのコンテキストで、この現象を示した。具体的に、ミクログリア、常駐CNS免疫細胞と食細胞は、ピーク時や発達シナプス刈り込み、視床の出生後の背側外側膝状核（DLGN）の領域において、シナプス前の入力を巻き込むことが示された。この飲み込みの遺伝的または薬理学的遮断シナプス接続の持続的な赤字となりました。 このプロトコルでは、シナプス前の入力の食細胞媒介貪食を測定するための信頼性の高い、高度に定量的な分析を説明します。この記事の目的のために、このアッセイは、網膜内に存在することが網膜神経節細胞（RGC）を含む、現像retinogeniculateシステムの文脈で提示されるDLGN（ 図1A）、プロジェクトシナプス前入力。開始するには、リソソーム分解耐性順行性標識戦略はDLGNにおけるRGC特異的シナプス前入力（ 図1）7,21 を可視化するために使用される、説明する。この説明に続いて、画像化および定量3（3D）次元表面ボリュームレンダリングと組み合わせた共焦点顕微鏡を用いて貪食を測定するための詳細な方法論は説明する。この方法論は、固定組織標本に基づいているだけでなく、ライブイメージング研究での使用に適合されてもよい。アッセイは、健康な、出生後retinogeniculateシステムの文脈で検証されてきたが重要なことには、一方が他方の脳全体および疾患時の食細胞 - ニューロン相互作用、ならびに他の器官系における食細胞の機能を評価するために同じ手法を適用することができる。

<table><tbody><tr><td>ヒートパッド</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヒートパッド用温水源</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>DSC Optical</td><td>Zeiss Opmi -6 手術用顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>凍結ステージ付きスライド式ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>ライカ</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>蛍光解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ800落射蛍光アタッチメント</td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox スピニングディスク共焦点</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;l ハミルトン ガス タイト シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>80030</td><td>色染料/トレーサーごとに異なるシリンジを使用する</td></tr><tr><td>ハミルトン針</td><td>ハミルトン</td><td>7803-05、仕様: 鈍い、1.5 インチ</td><td></td></tr> <tr><td>アレクサ結合コレラ毒素 &ベータ; サブユニット (CTB)</td><td>Invitrogen</td><td>488: C22841</td><td>滅菌生理食塩水、80 & マイクロで再構成します。L(488)、100&マイクロ;L(594)、20&マイクロ;l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>ネオマイシンおよびポリミキシンB硫酸塩およびバシトラシン亜鉛眼科用軟膏USP(抗生物質軟膏)</td><td>Bausch&Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>30.5 G 針</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>春はさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>綿先端アプリケーター</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PBSで16%から4%を希釈します。パラホルマルデハイは有毒であり、ヒュームフードで使用し、個人用保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>解剖ツール&ndash;はさみ、鉗子、へら</td><td>小はさみ:ファインサイエンスツール</td><td>小さなはさみ:14370-22</td><td></td></tr><tr><td>大きなはさみ:Roboz</td><td>大きなはさみ:RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 鉗子:Fine Science Tools</td><td>#55 鉗子:11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>へら:Ted Pella, Inc.</td><td>へら: 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td>PBS で 30% スクロースを作る (重量/vol)</td></tr><tr><td>OCT コンパウンド</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>重量を量る</td><td>USA Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル プレート</td><td>BD Biosciences 353047</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>Sigma</td><td>S6566-500G</td><td>0.2 M リン酸ナトリウム (PB-A) を ddH2O に、0.2 M リン酸二塩基性ナトリウム (PB-B) を ddH2O に調製します。0.1 M PBを作るには、19 mLのPB-Aと81 mLのPB-Bを組み合わせ、ddH2O</td></tr><tr><td>リン酸二塩基酸ナトリウムを</td>200 mlまで充填します。<td>シグマ</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、22 X 50 mm、No.1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>帯電顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

貪食アッセイ：cns食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

食作用は、細胞がその周囲の細胞外環境での材料（全体の細胞、細胞の一部、破片など）を飲み込み、その後、一般的にリソソーム分解を介して、この材料を消化する過程である。ミクログリアは、食細胞機能健康な脳（ 例えば、シナプスの開発に神経変性疾患（アルツハイマー病、例えば 、βアミロイドクリアランス）から条件の広い範囲に記載されている中枢神経系（CNS）の免疫細胞である常駐剪定）1-6。以下のプロトコルを開発し、マウスのretinogeniculateシステム7におけるシナプス前入力のミクログリア媒介貪食を可視化し、定量化するために開発された貪食アッセイである。このアッセイは、この特定の文脈においてミクログリア機能を評価するために使用されたが、同様のアプローチは、脳（ 例えば、星状細胞）、および身体の残りの部分で他の食細胞を評価するために使用され得る（ 例えば 、末梢マクロファージ）だけでなく、シナプスのリモデリングが起こる他のコンテキスト（ 例えば 、脳損傷/疾患）。

最近では、発展途上retinogeniculateシステムにおけるシナプス前入力のミクログリア媒介貪食（ 図1）7 を可視化し、定量化するために、この貪食アッセイを使用していました。 CX3CR1-EGFPヘテロ接合体マウスからRGCを順行それぞれ、左右の目にCTB-594およびCTB-647で追跡した。このトレースに続いて、DLGN内EGFP陽性ミクログリアを画像化した。これらの画像は、その後のボリューム測定のために表面レンダリングであった。 この技術を使用して、我々はDLGN内発育シナプスリモデリング（P5）のピーク期間の間に、シナプス前入力は、ミクログリア（ 図6）に包まれていることを見出した。改造が大量に（P9）がほぼ完了したときに、わずか4日間後に、飲み込ま入力の量が劇的に減少する。また、貪食や剪定は、古典的補体カスケードに属するタンパク質が欠損したマウスで破壊される（ 図6）、ならびにニューロン発火の操作を下記（データは示さず...

小膠細胞は、それらの細胞外環境に材料を貪食又は巻き込むための高い能力を有する中枢神経系（CNS）の居住者の免疫細胞である。ここでは、シナプスのコンポーネントのミクログリア媒介貪食を可視化し、測定するために広く適用可能で信頼性が高く、高度に定量的なアッセイが記載されている。

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

本手順の全体的な目的は、ミクログリアによるシナプス前入力の取り込みを可視化し、定量化することです。まず、蛍光前向性トレーサーを眼球に注入し、外側膝状体における網膜神経節細胞のシナプス前入力を標識します。次に、脳を摘出し、固定および平衡化を行います。次に、脳を切片化します。最後のステップは、撮像および解析のために脳切片をカバーガラスに封入することです。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて、ミクログリアによるシナプス前入力の取り込みを評価します。この手法は、食細胞がシナプス回路の可塑性と再構築にどのように寄与するかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は健康な脳におけるシナプス回路の再構築に関する知見を提供できるだけでなく、神経系疾患におけるシナプス回路の再構築など、他の系にも適用可能です。手順のデモンストレーションは、技術者のChris HellerとStevens研究室の大学院生であるEmily Lamanが行います。まず、プレキシガラス製の導入チャンバー内で、4%ISO fluorineを用いてマウスを麻酔します。1〜3分後、尾をつまんで適切な麻酔深度に達しているかを確認してください。その後、マウスを実体顕微鏡下で横向きに置き、鼻先に3〜4%ISO fluorineを供給するノーズコーンを装着します。強膜を露出させるため、小型のスプリングシザーを用いて眼瞼を開き、皮膚を後方に引きます。新生児の場合、眼窩の隅に垂直な別の切開が必要なことがあります。眼瞼の隅には血管があるため、切開時には注意してください。滅菌済みの30.5ゲージ針を使用して、強膜が始まる眼の側面に小さな穴を開けます。針先（ベベル）が眼内に入る程度の深さまで挿入し、水晶体を傷つけないように注意してください。硝子体を穴から流出させ、滅菌済みのカットチップアプリケーターを用いて液体を吸収させます。硝子体が孔から流れ出なくなった後、前方追跡用トレーサーをあらかじめ充填したハミルトンシリンジに接続した鈍端針を、ゆっくりと孔に挿入します。その後、染料を眼内にゆっくりと注入します。前方追跡には、通常、Alexa 594、647、または488を結合させたコレラトキシンBサブユニットが使用されます。R GC 入力を遅らせます。針を穴に数秒間挿入したままにし、その後ゆっくりと抜きます。綿棒を使用して過剰な液体を吸収し、染料が漏れ出すのを防ぎます。その後、少量の抗生物質軟膏を眼に塗布します。眼球を外科的に開いた場合は、注射後に眼瞼をそっと合わせて元の位置に戻します。マウスが麻酔から回復し始めるまで、ヒートランプの下またはヒートパッドの上に置いてください。マウスを清潔なホームケージに戻し、完全に覚醒したことを確認してからコロニーに戻します。注入から約24時間後、マウスを安楽死させ、脳を摘出します。翌日、4% PFAを満たしたFalconチューブに入れ、4°Cで一晩固定します。まず、脳とPFAを空のウェーボートに注ぎ、その後、スパチュラを用いて脳をPBSで満たした別のウェーボートに移し、PBSで3回すすぎます。さらに2回PBSで洗浄した後、30% sucrose溶液で満たしたFalconチューブに移します。脳がチューブの底に沈むまで、4 °Cのsucrose溶液中に保持します。その後、カミソリで脳の不要な部分を取り除きます。脳をアルミホイルに載せ、ドライアイスで凍結させます。その間にミクロトームのステージを冷却し、24ウェルプレートの各ウェルに0.1 molar PPを0.5 mLずつ満たして、凍結させた脳を凍結ステージに固定できるように準備します。少量のOCTをステージ上に塗布します。OCTが凍り始めたら、そこに脳を置きます。切断する側の脳の面が上を向くようにしてください。次に、脳とOCTを非常に細かく砕いたドライアイスで覆います。ドライアイスを脳の上に約30秒間置いておきます。その後、大きな絵筆を使用してドライアイスを取り除きます。スライスを 40 micron の厚さで切片作成し始めます。次に、湿らせた小さな絵筆を用いて、関心領域を含む切片をブレードから取り除き、0.1 molar pb を含む 24 ウェルプレートに移します。切片の回収後、蛍光解剖顕微鏡下で前方のグレードラベルを可視化し、関心領域を含む切片を選択してスライドガラスに封入します。まず、充電した顕微鏡スライド上に0.1 molar PBを少量滴下します。次に、組織切片をPBのプールへと移します。その後、絵筆を用いて組織の向きを整え、広げます。キムワイプを使用してXSPBを吸い取り、切片まで吸い取らないように注意します。完全に自然乾燥させます。その後、各切片に封入剤を少量滴下し、最後にカバーガラスで封入します。スライドの端をマニキュアで密封します。後述のイメージングセッションまで、スライドを-20°Cで保存してください。以下は、前方方向へのトレーシング戦略の概略図です。左眼および右眼のRGC入力を、それぞれCTB 6 47およびCTB 5 94を用いて追跡します。続いて、ミクログリアによる入力の貪食を評価します。ここでは、左眼および右眼の入力を逆行性に追跡した、生後5日目のマウスDLGNの代表的な低倍率画像を示します。これは左右の目の入力の境界領域から採取されたミクログリアです。ミクログリアの体積外にあるすべてのCTB蛍光を差し引くことで、取り込まれたRGC入力が明らかになり、ミクログリアと取り込まれたRGC入力のサーフェスレンダリングがここに示されています。以下は、P5、P9、およびP30マウスにおける表面レンダリングされた代表的なミクログリアです。DLGNにおけるRGC入力の engulfment（取り込み）は、高齢期と比較して、プルーニングのピーク時に有意に増加します。補体受容体3欠損マウスのミクログリアは、野生型のリターメートと比較して、RGC入力を有意に少なく取り込みます。この手法は、適切に行えば72時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ニューロンの統合的なラベル付けおよびミクログリアとシナプスの相互作用の評価方法について、十分に理解できるはずです。

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神経科学

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出典:Funes, S., et.al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-Cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. (ヒトミクログリア様細胞: 誘導多能性幹細胞からの分化およびヒトシナプトソームを使用した In Vitro 生細胞食作用アッセイ).J. Vis. Exp.

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フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

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