貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、ミクログリアによるシナプス前入力の飲み込みを視覚化し、定量化することです。これは、最初に蛍光性前グレードトレーサーを眼に注入して、外側の遺伝子核の網膜神経節細胞のシナプス前入力を標識することによって達成されます。2番目のステップは、脳を解剖し、固定し、平衡化することです。

次に、脳を切片にします。最後のステップは、イメージングと分析のために脳のセクションをカバーリップに取り付けることです。最終的に、共焦点顕微鏡法は、ミクログリアによるシナプス前入力の飲み込みを評価するために使用されます。

この方法は、食作用土壌がシナプス回路の可塑性やリモデリングにどのように寄与するかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は、健康な脳におけるシナプス回路リモデリングの知見を得ることができますが、神経系疾患におけるシナプス回路リモデリングなど、他のシステムにも応用することができます。この手順を実演するのは、技術者のクリス・ヘラーと、スティーブンス研究所の大学院生であるエミリー・レーマンです。

この手順は、プレキシガラス誘導チャンバーでマウスに4%ISOフッ素を麻酔することから始めます。1〜3分後、尻尾をつまんで適切なレベルの麻酔が達成されることを確認します。次に、マウスを実体顕微鏡の下に横向きに置き、鼻孔に3〜4%ISOフッ素を供給するノーズコーンを置きます。

強膜を露出させるには、小さなスプリングハサミを使用してまぶたを開き、皮膚を引き戻します。新生児の場合、目の隅に別の垂直なカットが必要な場合があります。まぶたの角を切るときは血管があるので注意が必要です。

滅菌済みの30.5ゲージ針を使用して、強膜が始まる目の側面にある小さな穴に穴を開けます。レンズを傷つけないように、針を斜めが目に入るように十分に挿入して注意してください。硝子体が穴から流れ出るのを待ち、滅菌されたカットと先端のアプリケーターを使用して液体を吸収します。

硝子体が穴から流れ出るのを止めたら、前方グレードのトレースが事前にロードされたハミルトンシリンジに取り付けられた鈍い端の針をゆっくりと挿入します。穴に染料を入れ、ゆっくりと染料を目に注入します。通常、Alexa 5 94、6 47、または4 88に結合したコレラ毒素βサブユニットは、前グレードに使用されます。

レイトトレースR GC入力針を穴に数秒間置いたままにしてから、ゆっくりと取り外します。綿の先端のアプリケーターを使用して、余分な水分を吸収し、染料が漏れるのを防ぎます。次に、少量の抗生物質軟膏を目に塗ります。

目が外科的に開かれた場合。注射後、まぶたを一緒にゆっくりと再配置します。.マウスが麻酔から回復し始めるまで、マウスをヒートランプまたはヒートパッドの上に置いておきます。

マウスを清潔なホームケージに戻し、完全に目覚めていることを確認してからコロニーに戻す前に監視します。注射から約24時間後、マウスを犠牲にし、脳を解剖します。翌日、摂氏4度で一晩4%PFAを充填したファルコンチューブに脳を固定します。

最初に脳とPFAを空のホエイボートに注ぎ、PBSで脳を3回すすぎます次に、へらを使用して脳をPBSで満たされた別のホエイボートに移します。脳をPBSでさらに2回洗浄してから、30%スクロース溶液で満たされたファルコンチューブに移します。チューブの底に沈むまで、摂氏4度のショ糖に入れたままにします。

その後、カミソリの刃で脳の不要な部分を取り除きます。ドライアイスの上でアルミホイルの上で脳を凍らせます。その間に、ミクロトームステージを凍結し、24ウェルプレートの各ウェルに半ミリリットルの0.1モルPPを充填して、凍結した脳を凍結ステージに取り付けます。

ステージに少量のOCTを塗布します。OCTが凍結し始めたら、脳をその中に置きます。切断する脳の側面が上を向いている必要があります。

次に、非常に細かく砕いたドライアイスで脳とOCTを覆います。ドライアイスを脳に約30秒間置いておきます。次に、大きなペイントブラシを使用してドライアイスを取り除きます。

40ミクロンの厚さでスライスの切片化を開始します。次に、小さな湿ったペイントブラシを使用して、関心領域を含む切片をブレードから取り除き、0.1モルpbを含む24ウェルプレートに移します。切片が収集されたら、蛍光解剖顕微鏡で前部グレードの標識を視覚化し、関心のある領域を含む切片を選択して、切片をスライドにマウントします。

まず、0.1モルPBの小さなプールを荷電顕微鏡に適用します。次にスライドさせ、組織切片をpbのプールに移します。次に、絵筆を使用してティッシュの向きを付け、広げます。

Kim ワイプを使用して XSPB を吸い取り、切片から吸い上げないように注意してください。完全に風乾させます。次に、各セクションに封入剤を少量滴下し、端の上部にカバースリップを取り付けます。

スライドの端をマニキュアで密封します。スライドは、イメージングセッションが表示されるまで摂氏マイナス20度で保管します。これは、前方グレードのトレース戦略の概略図です。

左目と右目のRGC入力は、それぞれCTB 6 47とCTB 5 94でトレースされます。その後、ミクログリアを介した入力の飲み込みが評価されます。これは、出生後5日目のマウスDLGNの代表的な低倍率画像で、左右の眼の入力を段階的にトレースした後のものです。

これは、左目と右目の入力の境界領域からサンプリングされたミクログリアです。ミクログリアボリュームの外側にあるすべてのCTB蛍光が差し引かれ、飲み込まれたRGC入力と、ミクログリアと飲み込まれた表面レンダリングが明らかになりました。ここにはRGC入力が示されています。

これは、P five、P nine、およびP 30マウスの代表的な表面レンダリングされたミクログリアです。RGC入力のDLGN包絡は、DLGNのピーク刈り込み中に、それより古い年齢と比較して大幅に増加します。補体受容体3を欠損したマウス由来のミクログリアは、野生型の同腹仔と比較してRGC入力が大幅に少なくなります。

この手法は、適切に実行すれば72時間で実行できます。このビデオを見れば、ニューロンの標識をインターグレードする方法や、ミクログリアのシナプス相互作用を評価する方法について十分に理解できるはずです。