Name: 齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぼう、齧歯類の中枢神経系における生体光遺伝学的刺激法。レーザー装置とファイバー光学系を用いて、覚醒自由運動下で神経活動をリアルタイムに制御し、行動と神経回路の機能的関係を解明する手法です。

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これらの研究は、NIHから受け取った助成金によって資金提供されました（MH082876、DA023988。

<ol><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147, 1446-1457 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatry%27s+age+of+enlightenment%3A+optogenetics+and+the+discovery+of+novel+targets+for+the+treatment+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatry+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders.</a> J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+dissection+of+neural+circuits+underlying+emotional+valence+and+motivated+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors.</a> Brain Res. 1511, 73-92 (2013).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li>
<li>Sparta, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+identification+of+striatal+projection+neuron+subtypes+during+in+vivo+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings.</a> Brain Res. 1511, 21-32 (2013).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nat Methods. 9, 159-172 (2012).</li>
<li>Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+principles+underlying+optical+stimulation+of+a+channelrhodopsin-2+positive+pyramidal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron.</a> J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).</li>
<li>Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li>
<li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463, 98-102 (2010).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> J Vis Exp. , e50004(2012).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 154-165 (2010).</li>
<li>Goshen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+retrieval+strategies+for+remote+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of retrieval strategies for remote memories.</a> Cell. 147, 678-689 (2011).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li>
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著者には報告すべき利益相反はありません。

現在記載されたレーザセットアップとテザリング戦略は齧歯類行動試験の広い範囲と互換性があります。確かに、行動試験の様々な少数を示すために、次の、または付随する、in vivoでの感情、行動のタスクを含む光遺伝学的刺激、行動の調節、学習および記憶パラダイム、睡眠、覚醒、そして食欲のタスクを使用されている（（ニー·チョン） らを参照してください。包括的な見直しのための6）。光遺伝学は、伝統的な行動試験は、複数の日の研究で行われている方法は、今5「オフ」対「オン」光の明確なエポックの間に、被験者内、動作が比較される単一のセッションに凝縮することができます変更されました。注目すべきは、出入り口を含む行動の装置は、閉じた区画または他の障害物が係留繊維の通過に適応するように修正されなければならないことがある。 記載されテザリング戦略許可のSi単一のレーザから複数のマウスのmultaneous刺激。ハイスループット光遺伝学的行動試験は、従って、複数のレーザ及び試験装置を使用して達成することができる。同時に刺激することができる動物の数は、しかしながら、各ファイバ先端に達成できる最大の光パワーによって制限される。ファイバ先端での最大出力は、レーザの1）開始パワーに依存する。 2）カップリング効率及び3）ビーム分割数。 200μmのコア、0.22 NAファイバパッチコードを使用する場合〜80％ ​​の結合効率を有すると（ 図4Cに示されるように）4、ビーム分割、ファイバ先端の平均電力最大100mWの青色レーザ5~10ミリワットの間の範囲であり得る（ロータリージョイントから伝送損失が&lt;15％であることが期待NB）。オプシンは、光に対する感受性が異なるので、光出力密度（mWのように、ファイバ先端に光出力を測定することは、オプシンの活性化のために十分な光パワーを決定するために必須である活性化のために必要な11個/ mm 2）。例えば、安定した階段関数オプシン（SSFO）は、光子アキュムレータとして作用するので、活性化のための非常に小さな光パワー密度（&lt;8μW/ mm 2以上） を必要とする8。活動電位を誘発するための光の1ミリワット/ mm 2で最小を必要とする伝統的なチャネルロドプシン（ChR2を）とこれを比較2。 表1は 、現在最も一般的なオプシンをアクティブにするために必要な知られている最低限の光放射照度のクイックリファレンスとして提供されている使用しています。最後に、人はその光散乱を考慮し、より多くの光パワーをより深く脳構造3のために必要とされるように、脳組織を通って移動するように吸収しなければならない。便利なオンラインリソースがで入手できます<a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a>に取ることによって脳組織を通じて様々な深さでの光強度を計算し、そのファイバ先端にファイバコアサイズ、開口数、使用する光の波長、および出発光パワーを占めている。これらの計算の基礎となる理論的な原則の優れた概要については、Foutz らを参照してください。 （2012）12。実験設計にこれらの原理および計算を適用する方法の例としては、（2007年）3。Aravanisらに実証さタイら。（2012）13される。実験の開始前に、これらの計算を実行することはオプシンの活性化のための適切な光放射照度を確保することが重要である。これらの考察を考慮すると、十分な出力を確保するために高出力レーザを購入することが有利である。 100-200ミリワットの間の電力出力を有するレーザは、小さなコア繊維、複数の繊維を分割、結合効率の悪さを補償するのに一般に十分であり、送信は7を失う。高出力レーザーを使用する場合は、しかし、注意は、神経の損傷または熱と光会合を避けるように注意しなければならない長期化および/ ​​または高出力光照明7で発生する可能性があるDアーティファクト。 in vivo実験のための安全な範囲は、75ミリワット/ mmの2までである。14 考慮すべき多くの要因があるとして購入するレーザーの種類を決定することは複雑な問題であることができる。例えば、ダイレクトダイオードレーザは、ダイオード励起固体（DPSS）レーザが何よりも安定的で反復パルス出力を提供し、ラボ環境で時間をかけて、より信頼性が高い。しかし、場合によっては、ダイレクトダイオードレーザは、指令電圧が、レーザの制御電子回路によってダイオードに送られる一定のバイアス電流を0 Vである場合であっても、より低い光パワーを放出する、〜0.1mWでよい。この「自発的な」放出は、同じレーザからレーザ放射の場合よりも広いスペクトルを持っているので、特にレーザーとカプラとの間の狭いバンドパス（または「クリーンアップ」）フィルタ（部品リストを参照）をインストールすることによって低減することができる。このフィルタは、意志レイジング時〜50％の電力出力を低減し、それに応じ、より高いパワーのレーザーを購入する。それは黄色のDPSSレーザーは非常に敏感であり、動作が不安定になることができ、迅速にパルス発生器によって変調された場合には、寿命が減少していることに留意すべきである。黄色のレーザーパワーの調整は、TTL +モードでレーザーを動作させながら、ビーム経路（1.7節 ）に配置された外部の濃度フィルタホイールを介して行われるべきである。また、緑の532 nmのDPSSレーザーを購入することはhalorhodopsinsとarchaerhodopsins両方を活性化することができる費用対効果の高い代替手段です。 ファイバの開口数（NA）は、レーザアセンブリのセットアップのための繊維成分を設計し、購入する際に考慮することが重要である。光ファイバのNAは、光ファイバの先端に受け入れ、放出することができる光の角度を決定する。高NAファイバは、低NAファイバに交配された場合、重大な損失がその界面で発生するので、それは一貫してのWiすることが重要です<html>シングルセットアップ内番目の繊維NA（またはNAは、光路に沿って上昇することを確実にするため）。脳組織は高度に散乱し、レーザ光源からの結合された光が「アンダーフィル」高NA繊維になる傾向があるので、照射されているので、脳組織の体積に対する繊維NAの効果は、それほど重要ではない。 0.22および0.37のNAを有するが、光ファイバは、一般的に使用される。同様に、より小さなコアファイバの大きなコアからの結合はまた、常に動物のインプラントにレーザ光源から進行したときに増加または同等のコア径を使用してください、大きな損失になります。一般的なノートでは、ファイバ端部は、常に使用しない塵埃及び粒子の蓄積を防止するためにキャップされたときにすべきである。それは、最大の光出力を確保するために、そして毎日の実験を開始する前に、「ダミーインプラント &#39;を介して光出力をテストするために（70％イソプロピルアルコールがうまく動作します）定期的にクリーンなファイバ端部とコネクタに良いアイデアです。 &quot;&gt;行動試験中は、ステップは、ウイルス感染、外来タンパク質の発現、可視光、および動物の行動上の可能な組織加熱効果及びアーチファクトの影響を制御するために取られることが不可欠であるため、適切な対照群の動物からなるべき同一の光刺激パラメータを受信する対照ウイルス（ 例えば、GFP、のeYFP、mCherryを）で形質導入実験検証解析のために使用される行動データなどの重要な最終ステップは、関心領域内の適切なオプシンおよび光ファイバ配置に完全に依存している具体的には、動物に全く免疫組織化学的信号が検出されない場合、又は信号又は繊維の配置は、関心領域内にない場合、その動物のためのその後の行動データは、実験から除去されるべきである。さらに、それはの光出力をテストすることが不可欠であるファイバ先端外科的移植前とオプシンの活性化のために十分な光パワーを確保するために、もう一度、死後の両方。アニマで重度の光損失が実験（&gt; 30％）9の後にファイバを通って発生したLSは、その動物のためのデータは、除去のために考慮されるべきである。除去のための基準は先験的に確立されるべきである。最後に、1は、標的とされる脳の構造と神経細胞のサブタイプに依存し、神経発火を調節するのに必要なパルス周波数を、考慮しなければなりません。公開された光遺伝学的光刺激パラメータは、しかしながら、神経発火を調節する能力は、独立して、インビボまたは脳切片電気生理学的記録によって確認されるべきであり、複数のニューロンのサブタイプが存在する。 一つは、レーザーの使用、レーザー設定アップの変形例熟達になるように、異なる波長の組み合わせは、単一の動物の複数の繊維に繋留またはコンビナトリアル光遺伝学8に対して同じ光ファイバを下に送達することができる。多波長刺激は、赤方偏移の急速な発展与えますます重要になるEDのchannelrhodopsins 8、ブルーシフト過分極オプシン15のエンジニアリング、双安定階段関数オプシン8,16,17、および個別の活性化スペクトル11とオプシンの一般的な拡大リストを使用。光遺伝学的ツールボックスのこの拡張は、複雑な行動の状態を支配する中で自分の役割を決定するための脳領域内および間の両方で、複数の神経サブタイプの前例のない制御を可能にします。

光遺伝学は、正常および疾患関連行動の状態を駆動する神経回路素子のために、検索にシステムレベルの神経科学に革命をもたらしました。 1は 、機能的に哺乳動物細胞で発現することができ、感光性微生物オプシンという発見は、高い空間的、時間的精度2と神経活動の前例のない制御を得るために光を使用するためのプラットフォームを提供しました。神経活動の操作に伝統的な電気生理学的または薬理学的アプローチとは異なり、光遺伝学は、不均一な集団内および生理学的に関連のタイムスケールでの（識別遺伝的または空間投影に基づいて）特定の細胞型の制御を可能にする。神経光インタフェースのその後の導入は、動物3を振る舞うに光を送達するための実用的なツールを提供した。これは、因果的にテストするために、目を覚まし挙動するのげっ歯類で定義された神経回路のリアルタイムの変調を可能にした神経学的および精神疾患4-6に関連する行動状態のガバナンスにおけるこれらの神経回路の役割。光遺伝学は、従って、動物モデルにおける脳活動および行動または生理学的措置の間の機能的関係を調査することに興味の任意の実験室への導入のための強力なツールを表す。 光遺伝学的実験の成功デザインと完了します（ 図1を参照）さまざまなステップおよび考慮事項が含まれます。現在のプロトコルの目標は、目を覚まし挙動するのげっ歯類で光遺伝学的刺激を実行するために必要な理論と実践的な知識、と一緒に、ツールとコンポーネントを持つ個人を提供することです。現在、微生物のオプシンチャネルを活性化するために使用される2つの主要な波長範囲があります。青のスペクトルで（一般的に473 nm）であり、黄緑色のスペクトル（一般的に532または591ナノメートル）。レーザーや発光ダイオード（LED）の両方がdの光源として使用することができる脳組織への光の特定の波長をeliver。 インビボでのげっ歯類の刺激に必要なコアの小さなファイバに結合させる際に、LEDによって放射された非コヒーレント光は、しかしながら、光困難の効果的な伝送を行う。適切なレーザアセンブリの決定することは極めて重要な最初のステップであり、実験室での光遺伝学の使用目的に依存します。シングル予め結合レーザーおよびデュアルレーザーシステム（ 図2を参照）：現在のプロトコルは、組み立ておよび使用の容易さが異なる2つの基本的な構成について説明します。メーカーによって事前に結合されている単一のレーザーシステムは、基本的にすぐに行く必要ありませんセットアップに少しで到着時にですが、最小限のエンドユーザーによるカスタマイズの欠点を持っている。デュアルレーザーシステムは、同じファイバダウンつの異なる波長の送達を可能にする。異なる波長の阻害/ distincを活性化するために使用することができる、これは、組合せ光遺伝学の出現によりますます重要になる空間的に共局在しているトン細胞型。これは、光電流は、それぞれ7,8、青色光と黄色光によって開始され、終了され、双安定階段関数オプシンで使用するためにも不可欠である。必要に応じてユーザーがビーム経路から（ 例えば、外部シャッター、ビームフィルタ、インラインパワーメーター）コンポーネントを追加または削除することができますように、デュアルレーザーシステムもカスタマイズ可能です。光遺伝学は、実験室で使用される継続的なツールであることを行っている場合には、その汎用性のために、デュアルレーザーセットアップを推奨します。レーザの結合は、しかしながら、課題を提示することができるので、迅速、簡単、かつ信頼性のある連結機構は、このプロトコルで提供される。このプロトコルは、光学部品のアセンブリについて詳細に説明し、200μmのコアと0.22の開口数（NA）とステップインデックスマルチモードファイバ用に最適化されたパッチ·コードおよびコンポーネントを利用し、注意してください。異なるコアサイズは、NAはしかし、すべてのコンポーネントは、理想的にはコアの面で一致する必要があり、購入することができますサイズおよびNAは、ファイバの接続点での光損失を回避する。また、ファイバの接続で、光がより大きなコアサイズに小さくから渡すことができます。および/または低NAから高NAファイバに付加的な損失なし。 テザリング戦略は、ハイスループット行動試験のために複数のマウスの同時刺激を可能に提供される。提供されるプロトコルは、行動試験のために、慢性の移植可能な繊維の使用を想定して、急性刺激プロトコルのために修飾することができる。同カニューレの薬剤と同じ場所に、光ファイバの先端を送達するために使用することができるので、急性移植繊維は、薬理学的操作で光遺伝学的刺激を組み合わせるために有利である。それは繊維の繰り返し挿入および除去に伴う組織損傷を減少させ、繊維の一貫した配置するための面で精度を高めるように慢性的に注入した繊維の使用は、しかし、非常に多数の日の行動試験のために推奨される組織照明3。ここで説明テザリングの設定と組み合わせると、動作が複数の日渡って確実に記録することができます。繊維移植後確かに、信頼性の高い光透過率が報告されているか月9慢性刺激および行動試験パラダイムは、理論的には、数日から数週間にわたって行うことができるようになっている。ハードウェアコンポーネントに関する追加の注意事項は、社内で行うことができ、費用対効果的な代替と製品を含む、個々のニーズに合う最高の製品におけるリーダーの選択を可能にするためのプロトコルに追加されました。セットアップと実装時に便利です重要なヒントも提供される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. レーザーセットアップ</td></tr><tr><td>100 mW 473nm または 488nm ダイオードレーザーシステム , <2% 安定性 (数量: 1)</td><td>オミクロン</td><td>Luxx/Phoxx 473/488-100</td><td>オプションのアクセサリーにはリモコンが含まれています
キースイッチおよびLED表示</td></tr><tr><td>100 mW 594nm DPSSレーザーが付いている箱(量:1)</td><td>Colbolt</td><td>0594-04-01-0100-300</td><td>04-01シリーズ黄色レーザー; 後方反射に敏感
ファイバーから</td></tr><tr><td>200 mW 532 nm DPSS レーザー; 5% 出力安定性 (数量: 1)</td><td>Shanghai Lasers</td><td>GL532T3-200</td><td>黄色 DPSS レーザーに代わる費用対効果の高い代替品
ハロロドプシンの活性化と
archaerhodopsins</td></tr><tr><td>非接触型レーザー - マルチモードファイバーカプラー (数量: 1)</td> <td>OZ Optics</td><td>HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td><td>デュアルレーザーセットアップ用;仕様:33 mm
外径400 - 700 nm;FCレセプタクル、f=20mmレンズ
ポストマウントレーザーヘッドアダプター付き#11</td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、12 "x 18" x 1/2 "、1/4" -20スレッド(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1213</td>デュアル<td>レーザーシステム用</td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、10 "x 12" x 1/2" 1/4 "-20スレッド(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td>シングル<td>レーザーシステム用</td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、4 "x 6" x 1/2 "、 1/4 インチ -20 スレッド (数量: 2)</td> <td>Thorlabs</td><td>MB4</td><td>青色レーザー用; デュアルレーザーシステム</td></tr><tr><td>コンパクト高さ可変クランプ、1/4 インチ -20 タップ (数量: 4)</td> <td>Thorlabs</td><td>CL3</td><td></td></tr><tr><td>3/4 インチ ステンレス ポスト (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>TR075</td><td></td></tr><tr><td>1 インチ ステンレス ポスト (数量: 4)</td> <td>Thorlabs</td><td>TR1</td><td></td></tr><tr><td>ポスト ホルダー スプリング式六角ロック付きつまみネジ(数量:2)</td><td>Thorlabs</td><td>PH1</td><td></td></tr><tr><td>台座ベースアダプター(数量:3)</td><td>Thorlabs</td><td>BE1</td><td></td></tr><tr><td>小型クランプフォーク(数量:3)</td><td>Thorlabs</td><td>CF1253</td><td></td></tr><tr><td>1インチ光学系用キネマティックマウント、可視レーザー品質ミラー付き(数量:3)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100-E02</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルフィルター密度ホイール(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-2M</td><td></td></tr><tr><td>1インチ ロングパス ダイクロイック ミラー 50% (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td></td></tr><tr><td>1インチ 光学系用キネマティック マウント (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>ダイクロイック ミラー用</td></tr><tr><td>スタンド付き 20 ピース六角レンチ キット (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>TC2</td><td></td></tr><tr><td>1/4"-20 キャップ スクリューとハードウェア キット (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2</td><td></td></tr><tr><td>取り付けベース 1インチ x 2.3インチ x 3/8インチ (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC から FC/PC L-ブラケット 嵌合スリーブ (数量: 2)</td> <td>Thorlabs</td><td>ADAFCB1</td><td>デュアル FC/PC L ブラケットも利用可能</td></tr><tr><td>ブレッドボード リフティング ハンドル (数量: 3)</td> <td>Thorlabs</td><td>BBH1</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash;1 "バンドパスフィルター、CWL = 450 &plusmn;2 nm、FWHM = 10 &plusmn;2 nm (数量: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>FB450-10</td><td>自発的にダイオードレーザーと併用
emit</td></tr><tr><td colspan="4">2.レーザーカップリング</td></tr><tr><td>!レーザー保護メガネ(数量:各波長のユーザーごとに1つ)</td><td>いろいろ</td><td></td><td>!適切に確認するために、レーザープロバイダーに相談してください
最大限に提供されるアイウェアの選択
購入したレーザー</td></tr><tr><td>光ファイバーケーブルテスターの光減衰(数量:1)</td><td>Eclipse</td><td>902-186N</td><td></td></tr><tr><td>ワンステップファイバーコネクタクリーナー(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td>FBC1</td><td></td></tr><tr><td>カプラーパッチコード(0.75メートル)(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0.75 m 200 &mu;mコア、0.22 NA、FC / PCコネクタマルチモードファイバー。デュアルレーザーシステム用</td></tr><tr><td>カプラーパッチコード(0.5メートル)(数量:1)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>0.5 m 200 &mu;mコア、0.22 NA、FC / PCコネクタ、マルチモード。シングルレーザーシステム</td></tr><tr><td>用 Doric mini cube (数量: 2)</td><td>DORIC</td><td>DMC_1x2_FC-2FC</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトパワーおよびエネルギーメーターコンソール (数量: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>デジタル 4" LCD</td></tr><tr><td>C シリーズスリムパワーセンサー 5 - 500 mW (数量: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>複数の検出器タイプが利用可能です。
ベンダー</td></tr><tr><td colspan="4">3. In vivo 光遺伝学的刺激</td></tr><tr><td>マルチモードファイバースプリッター (数量: 2)</td><td>FONT Canada</td><td></td><td>大型コア光ファイバー 1 x 2 スプリッター、50/50 比、FC コネクタ、堅牢。長さ、コアサイズ、開口数は注文時に指定できます。費用 対 効果
より小さなコアサイズが利用可能</td></tr><tr><td>任意波形関数発生器(2チャンネル) (数量:1)</td><td>Rigol</td><td>DG1022</td><td>一度に最大2つのレーザーを制御可能</td></tr><tr><td>光ファイバーロータリージョイント(整流子) (数量:6 - 8)</td><td>DORIC*</td><td>FRJ_1X1_FC-FC</td><td>*ThorlabsおよびPrizmatix</td></tr><tr><td>アニマルパッチコード(10mmフェルール、FC/PCコネクタ付きカスタムモノ光ファイバーカニューレ)(数量:8)</td><td>DORIC</td><td>MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td><td>長さ、コアサイズ、開口数
注文時に指定してください。あるいは、これら
社内でカスタムメイドにすることができます(
スパルタ et al. 2012)9.</td></tr><tr><td>PFPセラミックススプリットスリーブ、内径2.5mm、長さ11.40mm(25個入り)(数量:1)</td><td>精密繊維製品</td><td>SM-CS1140S1</td><td>埋め込み型光ファイバーの取り付けに使用
動物に光を届ける繊維パッチコードに
フラットクリーブ(FC)エンド</td></tr><tr><td>&Oslashのクリアダストキャップ。2.5 mm フェルール (25/pkg) (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>CAPF</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC および FC/APC 嵌合スリーブ用金属キャップ (数量: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>CAPF1</td><td></td></tr><tr><td>厚ジャケットパッチコード (カスタムオーダー) (数量: 4)</td> <td>Thorlabs</td><td></td><td>200 &mu;mコア、0.22 NA、FC / PCコネクタマルチモードファイバー。長さ、コアサイズ、開口数をご注文時に指定可能</td></tr></tbody></table>

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

覚醒し、自由に動く動物の定義された神経回路を細胞型の特異性、空間精度、高い時間分解能で探す能力は、複雑な行動状態を支配する神経回路のシステムレベルの探索において、神経科学者にとって長い間求められていたツールでした。オプトジェネティクスは、神経科学の分野に革命をもたらしている最先端のツールであり、神経シグナル伝達イベントと行動との関係に関する因果関係の検証を可能にする最初の体系的なアプローチの1つです。光学的アプローチと遺伝的アプローチを組み合わせることで、哺乳類細胞における光感受性イオンチャネル(オプシン)の発現を通じて、神経シグナル伝達を双方向に制御することができます。現在のプロトコルでは、覚醒して自由に動くげっ歯類の脳深部構造のオプシン発現細胞に特定の波長の光を照射し、神経回路を調節することを説明しています。実験的考察としての光透過の理論的原理は、in vivo光遺伝学的刺激の実施の文脈で議論されています。このプロトコルでは、単純なレーザー構成と複雑なレーザー構成の設計と構築を詳しく説明し、ハイスループットの行動試験のために複数の動物を同時に刺激するためのテザリング戦略について説明しています。

in vivoでの光遺伝学的刺激を用いて得られた行動の結果は、動物モデルを使用し、標的とされる神経回路に完全に依存しており、変調パラメータ。チロシンヒドロキシラーゼの現在例証目的のために、腹側被蓋領域におけるドーパミンニューロン、またはVTA、::のためのCreマウスは、安定した階段関数オプシン（SSFO）8で形質導入された、またはコントロールウイルス（のeYFP）、および繊維インプラントは、慢性的であった。注入された。 THの使用::のCreトランスジェニックマウスは、オプシンの発現がVTAにおけるTH +細胞（ドーパミン）に制限されます。 図7に複数のマウスの同時刺激のための現在のレーザのセットアップを使用して得られた代表的な行動の結果を示す。ここで、マウスは、テザーであり（ 図4Cのように3匹のマウス/レーザー）別個のレーザを用い、同時に刺激され、運動行動を1時間記録した。 VTAにおけるドーパミンニューロンの反復刺激は、以下のような結果に刺激の期間を通じて持続した非常に活発な表現型。運動行動に変化のeYFPマウスにおいて見られなかった（ ビデオ1を参照）。行動試験の後に、免疫組織化学を目視で確認したVTAドーパミンニューロンおよび繊維配置（ 図7参照）の正確なウイルスの標的化を確認するために行った。 <img alt="図1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> in vivoでの光遺伝学的刺激のための、図1。実験の手順。設計およびin vivo光遺伝学的刺激に実行する際に関係する4つの一般的なステップがあります。このプロトコルは、具体的に行動する齧歯類におけるレーザ光源からの脳深部構造への光の送達に関連する手順について詳細に説明し、1）レーザーシステムアセンブリと光結合を含む。 C 2）テザリング戦略ハイスループット行動試験のための光源に複数の動物をonnecting、3）光配信のためのターゲティング戦略を確認するためのガイドラインを提供 - データ解釈のために不可欠であるステップを。注：このプロトコルはテザリングの目的のために慢性の移植可能な繊維に排他的ではないが、それは推奨され、行動試験で光遺伝学的刺激を組み合わせた場合に想定。ウン＆Arenkiel、2012年18およびスパルタらの両方を参照してください。2012年9慢性光ファイバの内製と移植のために。実線=このプロトコルでカバーステップ。 <img alt="図2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> インビボでの光遺伝学的刺激に用い、図2レーザーシステム（A） のin vivo刺激のための単一のレーザシステム。このレーザーがphある<html> ysically製造業者によって予め結合ほとんどのエンドユーザのセットアップを必要とする。（B）デュアルレーザシステム。二つのレーザは非接触様式カプラにそれぞれのビーム経路を操縦するように作用するミラーを使用することにより、単一のファイバに結合されている。これは、最も汎用性の高いセットアップ必要な光学構成要素を削除または追加することができるようであるが、効率的なレーザの結合の点で課題の多くを示す。（C）デュアルレーザシステムの概略図を（B）に示されるレーザおよびミラーの配置を示す対応するレーザ光のビーム経路（矢印）で示さ。ここで、ダイクロイックミラー &quot;D&quot;を介して連結器「C」へと取り付けられたカプラパッチコードに黄色の波長を透過する光の青の波長を偏向するために使用される。 B =青色レーザー。 C =非接触様式カプラ。 D =ダイクロイックミラーと、 FW =フィルタホイール。 M =ミラー。 Yは黄色のレーザーを=。= &quot;_空白&quot;を取得&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> 非物理的なカップリングプロトコルで使用される図3（A）ケーブルテスター下：。直接パッチコードに接続されたケーブルテスター。インサートは、ケーブルにテスターの接続点を示している（B）パッチコードは、プロトコルを通じて言及アウターからインナーまで：フラットクリーブ（FC）端部に取り付けられた白いジルコニア割スリーブ付きマルチモードファイバスプリッタ、黒ジャケット動物パッチコードを、 （また、「カプラーコード」と呼ばれる）の厚さのジャケット付きパッチコード。厚いジャケット付きパッチコードは、特別な保護のためのポリ塩化ビニル（PVC）チューブで被覆されている。これらのケーブルは、業界標準の色コードは、異なる種類の繊維、オレンジ=マルチモードファイバとの間で区別するために使用される。動物のパッチコードです<html>シンナー行動試験中に、動物の移動のための柔軟性を可能にするためにジャケット。そのダストキャップは、ケーブルが使用されていないとき、FC / PCが終了した上に置かれることに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> （A）単一の動物、（B）2匹の動物のin vivo光遺伝学的刺激のための図4テザリング戦略。 。（C）3または4匹の動物の可能な構成が上記に示したものに限定されるものではない-複数の構成は、市販またはカスタムオーダーにより利用可能ですアダプタ、ファイバスプリッタ、及び分岐パッチコードのユニークな組み合わせによって可能である。注：パッチコードとファイバスプリッタ両端FC / PCコネクタを含む（一端のみが示されている）。ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> 図5。スプリットスリーブを使用して、移植可能な光ファイバへのパッチコードの正しいと間違った（赤のx）を接続。 （左パネル）、スプリットスリーブジルコニアAは、埋め込 ​​み型光ファイバ（ここでは図示動物に貼付されていない）のフェルールにパッチコードを接続するために使用される。矢印は、パッチコードや植込み型光ファイバとの接続点を指している。接続スリーブの分割により可視化されるようにギャップが、パッチコード及び植込み型光ファイバとの間に存在する（右パネル）と比較してください。不適切な接続（右下）で発生する可能性の光漏れに注意してください。 U上のボトムインサートPPER左側のパネルには、使用される個々の構成要素を示す。ドリス式植込み型光ファイバーカニューラ、白ジルコニアスプリットスリーブ、黒ジャケット、動物のパッチコードのフラットクリーブ（FC）終了（ 図3Bに示されている完全なパッチコード）：トップからの挿入の下へ。すべてのパネルでは、接続スリーブは、パッチコードのFC端部と同一平面ではないことに注意してください。ままに〜0.5cmのオーバーハング動物に取り付けられた移植可能な光ファイバに接続するための。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> 図6.サイド（左）と前頭パッチコードに接続されている移植された光ファイバとマウスの（右）ビュー。パッチコードtの適切な接続を視覚化するために接続スリーブ上のスプリットを使用してください移植された光ファイバのフェルールoを接続ポイントは、赤い破線のボックスで強調表示し、また、上のインサートに描かれている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> 7.代表的な結果を図。 （左） の生体内光遺伝学的刺激の行動読み出し。記載のレーザセットアップとテザリングプロトコルを使用して得ることができる動作の例。自発運動は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）で腹側被蓋領域（VTA）の光遺伝学的刺激中に記録された:: Creマウス（N = 7から8 /グループ）のいずれか階段関数オプシン（AAV5-DIO-SSFO-のeYFPで形質導入）またはコントロールウイルス（AAV5-DIO-のeYFP）VTAで。 3匹のマウスの群は、同時に1につながれた図4Cに示されており、447または473 nmの光の5秒のパルスで刺激としてレーザーは一回15分毎に配信。光遺伝学的刺激は運動活性を増加したことにより、双方向反復測定ANOVAは、重要なグループ×時間の相互作用（F 3,39 = 15.27、P &lt;0.0001）と時間の有意な主効果（F 3,39 = 4.67、P = 0.007）を明らかにしたSSFOマウスにおいてのみ（= 0からt相対ボンフェローニ事後P &lt;0.0001、 - 15時間ビンを）のeYFPマウスと比較して運動活性の全体的な増加（グループの主要な効果が得られる：F 1,39 = 10.69、P = 0.0061;ボンフェローニ事後P &lt;T = 15で0.01 - 30とp &lt;0.001、T = 30日 - 45とt = 45から​​60）。ファイバースペック：200μmのコア、0.22 NA。前テザリングにファイバ先端で放出5mWの光パワーを有するウイルス注射部位から0.6mmの-光放射照度= 6 - 0.1のファイバ先端の距離に対応する66ミリワット/ mm 2で、。エラーバーは平均の標準誤差を表す。のeYFPSSFO 対 ：** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001;時間効果：ウイルスおよび光ファイバの配置の#### P &lt;0.0001（右）組織学的確認。ライカTCS SP5走査型レーザ顕微鏡で取得した共焦点蛍光画像を繊維配置（点線）、およびインビボでの光遺伝学的刺激後のマウスの腹側被蓋領域におけるウイルス媒介発現（緑色）を可視化した。ドーパミンニューロン（TH +）が青色で見られている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 生体光遺伝学的刺激で ビデオ1：Creマウス:: THでSSFOを使用してVTAの刺激中多動<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellsペーシング= &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5">表1.光放射照度は、一般的に使用されるオプシンを活性化するのに必要な。 </td></tr><tr><td rowspan="2">オプシンバリアント</td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2">パワー密度（個/ mm 2） </td><td></td><td rowspan="2">プロパティ</td></tr><tr><td>オン/オフ速度論</td></tr><tr><td colspan="5">光励起：速効性のchannelrhodopsins </td></tr><tr><td> ChR2を2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mWの</td><td> 1.21 / 12ミリ秒</td><td> 40ヘルツまでの火災</td></tr><tr><td>ケタ19 </td><td> 490 </td><td> 5ミリワット</td><td> 0.86 / 8.5ミリ秒</td><td> 200ヘルツまでの火災</td></tr><tr><td> CHIEF 20 </td><td> 450 </td><td> 1.65 mWの</td><td> 1.62 / 12ミリ秒</td><td> ChR2をの非脱感作フォーム</td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540から630 </td><td> 8 MW（540nmの） </td><td> 54で5/34秒0nm </td><td rowspan="2">赤方偏移</td></tr><tr><td> 3.2 MW（630nmの） </td><td> 630nmのの67ミリ秒（上） </td></tr><tr><td colspan="5">光励起：遅効チャネルロドプシン</td></tr><tr><td>安定したステップ関数オプシン（SFO）8 </td><td> 590分の470 </td><td> 8μW（470nmの） </td><td> 20ミリ秒/ 29分</td><td>新しいSFOの変異体;長く開いた状態。 470nmのことでオープンした、590 nmのにより閉鎖</td></tr><tr><td colspan="4">光阻害</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560から630 </td><td rowspan="2"> 3から5ミリワット</td><td rowspan="2"> 2.5ミリ秒/ &lt;10ミリ秒</td><td>一定の光で30分間22持続阻害* </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11、23 </td><td> 520から560 </td><td> 1から5ミリワット</td><td> 2 / &lt;10ミリ秒</td><td> eNpHR3.0 &lt;より大きい光電流とのより敏感/ TD&gt; </tr><tr><td colspan="5">この表はあくまで目安として提供されている。神経変調のために必要な特定の光放射照度は、独立して確認する必要があります。 </td></tr><tr><td colspan="5">実験的検証はオプシン、ターゲット戦略、および光刺激パラメータは、意図的に5における神経発火を調整することを確認することが重要です。 </td></tr><tr><td colspan="5">出力密度（mWの本/ mm 2）は 、脳組織の所定の領域に照射される光のパワーを参照し、ファイバ先端から出射される光パワーを意味するものではない。 </td></tr><tr><td colspan="5"> *常に特に長時間の光刺激で、可能な限り低い光強度を使用しています。 </td></tr></tbody></table> 表1.光放射照度は、一般的に使用されるオプシンを活性化するのに必要な。 略語 AAV =アデノ随伴ウイルス DPSS =ダイオード励起固体<br/&gt;のeYFP =強化された黄色蛍光タンパク質 FC / PC =フラットクリーブ/物理的な接触 GFP =緑色の蛍光タンパク質 PBS =リン酸緩衝生理食塩水 PVC =ポリ塩化ビニル MW =ミリワット NAは開口数= SSFO =安定した階段関数オプシン TH =チロシンヒドロキシラーゼ TTL =トランジスタ - トランジスタロジック V =電圧 VTA =腹側被蓋領域

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in vivo光遺伝学的刺激を実施するための完全なプロトコルを提供します。

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

本手順の総合的な目的は、覚醒し自由に動き回る動物において、げっ歯類の中枢神経系に対するin vivo光遺伝学的刺激を正常に実施することです。まず、光遺伝学的刺激を行うための適切なレーザーシステムを構築し、設定します。次に、行動試験に対応した光ファイバーを設置し、インプラントされた光ファイバーを通じて、オプシンを発現している目的の脳領域にレーザー光を照射します。次に、動物を光遺伝学的刺激のためのレーザーシステムに係留し、行動テスト装置に配置します。最後に、動物が行動タスクを遂行している間に、実験者が設定した光刺激パラメータを用いてニューロンを活性化または抑制します。最終的に、in vivoでの光遺伝学的刺激を用いることで、覚醒し行動している動物において特定のニューロン集団または神経回路をリアルタイムで制御し、関心のある特定の行動におけるそれらの機能的な役割を決定します。本手法の既存の手法に対する主な利点は、覚醒し行動している動物において、遺伝的および空間的に定義されたニューロン集団をリアルタイムで制御できることであり、神経活動パターンを複雑な行動状態に結びつけるために必要な時間分解能を備えている点にあります。本プロトコルではクラス3Bレーザーを使用するため、適切なトレーニングを受け、安全ガイドラインに従う必要があります。レーザー操作時は常に保護メガネを着用してください。特に対光軸調整の手順はリスクが高いため注意が必要です。テキストプロトコルに従ってレーザー装置をセットアップした後、まずレーザー背面のスイッチを電流（current）用の「cur」および定常照明用のトランジスタ・トランジスタ・ロジック（TTL）モードの「TTL」に設定し、内部ブルーレーザーの非接触型レーザーカップリングを行います。ドライバー前面の電源ノブがゼロに設定されていることを確認してください。次に、まずドライバーの電源を入れ、続いてレーザーキーを回してレーザーをオンにします。目の安全を確保するため、パワーノブをゆっくりと調整し、約1 mWのレーザー光が放出されるようにします。その後、レーザーをウォームアップさせるために10〜15分間待ちます。次に、ファイバー optic ケーブルテスターをカプラパッチコードの自由端に直接接続し、ケーブルテスターの電源を入れます。その後、赤色のビームがダイクロイックミラーの中心に向かって真っ直ぐに戻るように、カプラの角度を調整します。ケーブルテスターから放出される赤色光のビーム経路は、レーザーに結合させるために入射レーザー光が辿る必要がある正確な経路となります。コースアライメントを行うには、キネマティックミラーの側方および水平ノブを使用して、レーザー光をカプラーへと誘導します。この時点で、カプラーに取り付けられたパッチコードから青色光が放出されていなくても問題ありません。次に、ダイクロイックミラーとカプラーの間のダイクロイックミラーの直前に、半透明の紙を1枚置きます。レーザーとケーブルテスターにより、この用紙の同じ側にそれぞれ青色と赤色のドットが表示されます。1枚目のステアリングミラーの側面および水平方向のノブを慎重に回して微調整し、赤色ドットの中心を青色ドットに合わせます。用紙をカプラーの直前まで戻し、2枚目のダイクロイックミラーのノブを調整して、レーザービームを赤色ビームに合わせます。青色および赤色のビームの中心が正確に一致するまで、2枚のミラーを微調整し続けます。Coline、カプラーコードからケーブルテスターを取り外してください。これで、カプラーパッチコードの端からレーザー光が入射されるようになります。結合効率を決定するには、光パワーメータを使用して、カプラーに入る光パワーとファイバー端から放出される光パワーを比較します。ダイクロイックミラーの位置を維持したまま、結合効率が80%を超えていれば非常に良好であるとみなされます。外側のイエローレーザーには2つのステアリングミラーを使用し、単一のマウスを刺激するための光ファイバーをセットアップするために、先ほど実演したイエローレーザーの結合アライメント手順に従ってください。まず、F-C-F-C-Lブラケットアダプターをブレッドボードに直接取り付けて、カプラパッチコードを厚いジャケット付きパッチコードに接続します。厚いジャケット付きパッチコードの自由端に、コミュテーター回転ジョイントを取り付けます。次に、アニマルパッチコードをコミュテーターに取り付けます。接続用スプリットスリーブを、アニマルパッチコードの金属製フェルール端の空いている側に装着します。この際、スリーブを奥まで無理に押し込まないでください。BNCケーブルを用いて動物に固定された光ファイバーと接続させるため、スリーブを約0.5 centimeters露出させた状態で残します。青色レーザードライバーをパルスジェネレーターに接続し、パルスジェネレーターの電源を入れます。適切な保護メガネを着用してください。次に、ドライバー前面の電源ノブがゼロに設定されていることを確認し、まずドライバーの電源を入れ、次にレーザーキーを回してレーザーをTT L positiveモードに設定し、レーザーを起動させます。レーザー前面のノブをゆっくりと調整し、光パワーメーターを使用して、アニマルパッチコードの先端からの光出力が5〜10 milliwattになるように設定します。この設定に関する詳細については、テキストプロトコルを参照してください。in vivo刺激を行うため、ブルーレーザーをアナログモードに切り替え、レーザーがウォームアップするまで10〜15分待ちます。次に、マウスを優しく固定し、アニマルパッチコードのスプリットスリーブを慢性埋め込みファイバーに接続します。コネクティングスリーブのスリットを窓として利用し、2本のファイバーの末端が互いに直接接触していることを視覚的に確認してください。行動テストを開始する前に、マウスを数分間休ませて回復させます。その後、コネクタコードに引っ掛かりがないことを確認しながら、動物を行動テスト装置に入れます。パルスジェネレーターを使用して、選択したオプションを活性化させるための所定の周波数で青色レーザーを照射します。実験終了後、行動結果を正確に解釈するために、付属のテキストプロトコルに従って、ウイルスおよびファイバーの配置を組織学的に確認してください。顕微鏡下で、オプシン発現部位とファイバー埋め込み部位を確認し、選択した座標に基づいて、ウイルス注入およびインプラントが適切に配置されていることを視覚的に確認します。生体内（in vivo）オプトジェネティクス刺激によって得られた行動結果の例として、チロシン水酸化酵素（tyrosine hydroxylase）GFPマウスの腹側被蓋野（VTA）にあるドーパミン作動性ニューロンに、安定的なステップ関数型オプシン（stable step function OPSIN）またはコントロールウイルスとしてEYFPを導入し、ファイバーインプラントを慢性的に埋め込みました。ここで示すように、マウスのグループに同時に刺激を与え、1時間の移動行動を記録しました。左側のオプシン導入マウスを繰り返し刺激した結果、刺激の間中持続する過活動表現型が認められました。行動テスト後、右側のコントロールマウスに運動行動の変化は見られませんでしたが、免疫組織化学染色を行い、VTAドーパミンニューロンへの正確なウイルス標的化を確認し、本図に示す通り、線維の配置を視覚的に確認しました。この手法を習得すれば、神経回路変調の機能的アウトプットとして、さまざまな行動テストと組み合わせて、任意の脳領域における神経活動を操作することが可能です。

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JoVE Journal

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神経科学

嗅球のアダルト生まれのニューロンはoptogenetically...

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

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光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

この作品は、特注ガラス optrode...

覚醒マウス ガラス Optrode を持つ神経型のオプトジェネティクス同定

ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。...

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

ここでは、マウスの光遺伝学を用いた場所優先パラダイムに関する2つの簡単なステップバイステッププロトコルを紹介します。これら 2...

マウスの腹骨テグメンタル領域内の光遺伝学を用いた2つの異なるリアルタイムプレイス優先パラダイム

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

in vivoイメージングは、健康と疾患における生物学の研究のための強力なツールです。このプロトコルは、標準的な2光子顕微鏡によるマウス網膜の経瞳孔イメージングについて説明しています。また、網膜の複数の細胞コホートを蛍光標識するためのさまざまなin...

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。...

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

本プロトコルは、単一のペレットリーチツー把握タスクにおいて、高速ビデオ撮影と組み合わせた無線光遺伝学を使用して、自由に動くマウスにおける熟練した運動行動の性能に関与する神経回路を特徴付ける方法を記述している。...

インビボ 熟練した運動行動の無線光遺伝学的制御

このプロトコルは、脊髄手術を行うための外科的手順と、げっ歯類の脊髄上に光学シャンクを移植して固定するための外科的手順を詳述しています。...

げっ歯類の脊髄へのオプトエレクトロニクスデバイスの移植

学ぼう、齧歯類の中枢神経系における生体光遺伝学的刺激法。レーザー装置とファイバー光学系を用いて、覚醒自由運動下で神経活動をリアルタイムに制御し、行動と神経回路の機能的関係を解明する手法です。

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

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