Name: 腎摘出後のマウスにおける自発転移性腎細胞癌（MRCC）をモデル化する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶ腎細胞癌の自発転移モデル構築法。マウスへの正位移植、腎摘出術、転移評価の手順を解説。治療薬の有効性評価に有用な標準化プロトコルを提供します。

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我々は、この手順の開発で技術的なヘルプと専門知識のためのロバートS.カーベル（トロント大学、サニーブルック研究所、トロント、カナダ）の研究室に感謝しています。また、博士はサンドラ·セクストンや実験動物資源のロズウェルパークがん研究所部門に感謝したいと思います。この作品は、（JMLEへ）ロズウェルパークアライアンス財団から賞によってサポートされていました。

1。同所腎臓腫瘍移植<ol><li>細胞培養<ol><li>同所移植の前に、75％コンフルエントに単層としてマウスRENCA LUC細胞を成長させる。 </li><li> 5％FBS含有培地1,000 rpmで遠心分離細胞、5分間、4℃、PBS中で洗浄することを3回繰り返すことで、トリプシン処理および再懸濁以下。その後、5×10 4個のRENCA LUC / 5μlの無血清培地の濃度に無血清培地で細胞を懸濁します。 注：使用される変異体または細胞株に依存して、細胞が移植後に非常に攻撃的なマウス細胞増殖及び播種を遅らせる1:1マトリゲルとの比を無血清培地に再懸濁することができる。 </li></ol></li><li>手術と細胞移植 注：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）Pに従って行った、実験的なエンドポイントの維持決定を含む、そこに記載されているロズウェルパークがん研究所によって承認rotocol。 <ol><li>イソフルランを用いたもののBalb / Cマウス（2-3％）で麻酔。足をつまんで、十分な麻酔を確保するために、反射的に確認。乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。右横臥位にマウスを置き、前後と後肢の間で左側を剃る。無菌的に切開するための領域を準備するために背側腰部領域に沿ってアルコールとヨウ素を適用します。 </li><li>最後の肋骨と股関節の間の縦方向に1cmの皮膚切開を開始するために、外科はさみを使用してください。鈍的切開のハサミを用いて皮膚の下に結合組織を緩めます。腹壁内の長手方向に0.5センチの切開を作るために、外科はさみを使用してください。そっと開いた傷口の周りにプッシュダウンする湾曲したピンセットを使用する - これは、腎臓を体外にし、注射前に臓器の穏やかな固定化を可能にする。 </li><li>調製した細胞混合物μlの5でハミルトンシリンジをロードします。サブ莢膜implan用tationsは、2つの埋め込み方法を用いることができる。 <ol><li>浅：縦方向に向い腎臓に平行して走り、、斜めの縁を上にして腎臓​​被膜下（しかし、実質上の）針を挿入します。針が配置されると、小さな白い泡が形成されるまで細胞の全てを注入する。ゆっくりとカプセルから針を外し、すぐに漏れを吸収し、細胞播種を防止するために、滅菌綿棒で注射にわたってブロット。 </li><li>傾斜端を上にして、腎臓の反対側から、最終的な移植部位に始まり、針は（パンクチャリングではなく）表示されるまで、腎臓の内部を通って針を挿入し、サブ莢スペース：内部。任意の漏れを防ぐために白い気泡フォームおよびスワブ注射部位まで、細胞の全てを注入する。 </li></ol></li><li>優しく体腔への腎臓を戻す。吸収性5-0ビクリル縫合糸を使用して腹部の体壁を閉じます。完了したら、一緒にスキン層を引き、wは2-3を配置クリップをound。クリップがしっかりと均等に全く傷の露出を確保しないように間隔をあけていることを確認してください。リカバリ前の0.9％NaCl500μlの皮下25 Gの針を用いてブプレノルフィン（0.01 mg / ml）を100μlの管理。日常のクリップの配置と安定性を監視し、10日後に削除します。 </li></ol></li></ol> 2。腎摘出/原発腫瘍の除去<ol><li>のセクション1.2.1と1.2.2で説明したように（上）マウス麻酔、固定化、切開し、腎臓の露出のための同一のプロトコールに従ってください。 </li><li>優しく尾方端から接続して脂肪組織、腎臓の頭側端から副腎を除去することによって、腎臓を分離するために鉗子の第二の対を使用してください。優しく腎臓を把握しながら、尿管、腎動脈、静脈を二重結び目を作るために、吸収性5-0ビクリル縫合糸を使用しています。ゆっくり確保してから腎臓を取り除くために、結び目の上にカット。すぐに血液の損失の兆候あれば、あるいは不十分なホールドの危険性がある尿管、動脈、静脈に縫合糸は、結び目の上にカットする代わりに、はさみを焼灼器を使用しています。 </li><li>腎臓が除去されると、慎重に縛ら動脈から出血を確認し、必要に応じて焼灼器を使用しています。 5-0ビクリルを使用して腹部の体壁を閉じます。一緒にスキン層を引き、1.2.4で説明したのと同様の注意事項を次の2〜3創傷クリップを配置します。密接に出血苦痛の徴候、あるいは限られた移動性のための手術後、毎日動物を監視します。安全に動物のための施設のガイドラインに従ってください。 </li></ol>エンドポイントで3。のモニタリング転移進行とローカリゼーション<ol><li>転移性疾患の定量化：生物発光モニタリング<ol><li>方法論は、以前にルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞を用いて、転移をモニタリングするためJOVEに記載のゼノジェンIVISイメージングシステム11,12を用いて定量見る。 </li></ol></li><li>転移性分布の比較評価のための視覚的剖検ガイドのTiON <ol><li>犠牲の動物の苦痛の兆候、呼吸困難、体重減少などを含めたエンドポイントを使用して施設のガイドラインに従っ 注：自発的な転移性の進行が非常に変化し、急速なように、動物のクローズ監視は重要です。 </li><li>下顎骨に胸腔を続けて尿道上記切開を開始するために、外科はさみを使用してください。腹壁の筋肉から皮膚を分離するために、平滑末端はさみを使用してください。 </li><li>腕と脚に沿って切開を開始します。皮の皮離れて。密接に結節のための皮膚筋膜と腹壁を調べ、その後、表在リンパ節：鼠径、上腕、腋窩および表面的な子宮頸。 </li><li>腹壁の切開を行い、横隔膜までの左右の側面に沿って切断。 1水平カットと内臓を露出するために腹壁の前部を削除します。 </li><li>内臓fの邪魔されずに外観を調べまたは著しく顕著な腫瘍が。また、胃や腸の内容に注意してください。彼らが空の場合、マウスは食べることができなかった可能性があります。コンテンツが暗い場合、これは、上部/下部胃腸出血の証拠を示すことができる。 </li><li>視覚的に各マウス群の合計スコアを割り当てること、腫瘍の有無を各臓器のスコア（各群4匹の動物が図1D-iの中で例として使用される）。 注：1）リンパ節の拡大が必ずしもそれが腫瘍の成長であることを意味するものではありません。それは、大幅にサイズの非常にしっかりと、白っぽい色であれば、それは可能性が高い転移性結節である。 2）腹部の過剰な乳白色や曇り液体が腹水を示します。腹水は、特に肝臓と胃のローブ間腹部臓器に固体の蓄積を含むことができる。 3）肺などの器官のために、多数の小結節（例えば13を参照）に存在し、個々の動物間の比較にカウントすることができる。 </li><li>慎重に取り外し、噴出ボトルから、PBSで洗浄することにより、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓：個々の腹部臓器の肉眼的腫瘍や異常を特定します。 </li><li>腹部臓器を除去した後、腰椎、仙骨、腎臓、および腸間膜リンパ節を含む腹部のリンパ節を検査する。 </li><li>転移拡散の証拠ダイアフラムを評価します。 注：ダイヤフラムに関する広範な普及はこじつけや呼吸の喪失につながる、それはその収縮性を失う可能性があります。 </li><li>ダイアフラムを外し、胸腔内に2の横切開を行い、肺と心臓を露出させ、正面部分を除去する。 </li><li>そっとつかんで持ち上げ、食道を、心臓の上に気管を切断することにより、肺と心臓を取り出します。結節のための組織を評価する。心を絞る。弾力の一貫性の欠如は、腫瘍の存在を示すことがあります。 </li><li>頭蓋骨を通して直線的にカットする外科はさみを使用してください。優しくトンまで頭蓋の小片を取り除く彼は、全脳を露出させる。目に見える結節や異常変色のために脳全体に見て。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
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<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
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<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの目的は、注入/切除技法を説明するために同系腫瘍マウスモデルを用いて、臨床的に関連する自発的な転移性疾患を評価することである。現在、新たな実験的な治療法を評価する前臨床試験の大半は、転移性疾患の研究が含まれていないと、わずか数は、原発腫瘍の増殖、外科的切除、および最終的な自発的な転移拡散の段階を再現。現在までに、遺伝子操作したマウスモデル（GEMMs）は自発性腎細胞疾患の進行を引き出すために生成された（概要については14を参照）後期転移および外科的介入戦略は、これまで報告されていない含まれていません。したがって、自発的な転移性腎細胞癌の研究は現在、同所腫瘍細胞移植のモデルに限定されている。これらのモデルは、以前2,3開発されてきたが、このプロトコルは広く、特ににおいて、新しい治療法の評価に使用されていないそれは、ほとんどの予測値を有することがあり、周術期の設定。このプロトコルは、細部への治療評価においてより広範な利用を容易にすることができる必要な手続きのステップバイステップガイドを目指しています。記載された技術を実行する際に潜在的な落とし穴の面では、アウトカムに影響を与える可能性...

腎細胞癌（RCC）を有する患者における死亡の主な原因は、典型的には、腎臓中で増殖する原発腫瘍の外科的切除後に生じる全身性の転移性疾患である。しかし、マウスでは実験的な治療法を評価する非常に少数の前臨床腫瘍モデルは、転移性疾患が含まれており、少数の、まだ忠実にローカライズされた成長、手術、および自発的なマイクロ転移開始および進行1-3の臨床病期を再現。テスト中のこのギャップは時々 、動物モデルで見られる顕著な抗腫瘍効果は、常に患者4の同様に治療の成功に翻訳されていない新しい治療法の評価においてますます重要になってきた。結果におけるこのような差異は、ローカライズされた異所性または同所原発腫瘍モデルと後期転移性疾患5-7間の差動薬効に由来する。 RCCの場合には、少数の研究のみが確立採用している一般的に、腫瘍を有する腎臓を受けた患者は全体的または部分的に2,3を削除模倣自発的再発が含まニマルプロトコル。マウスモデルのテストで、この不足の理由は様々である。まず、高コスト動物および腫瘍細胞の選択および転移能の固有の変動性が存在する。 （例えば、ヒト細胞株導出8-10の説明を参照）、例えば、ヒト腎細胞株はめったに転移していない傾向があり、一貫し普及および遠隔病変を形成する変異体を導出するために同所一次注入及び転移複数回の選択にわたって選択されなければならない。逆に、免疫応答性モデルでマウスの細胞では積極的に行動する傾向があり、低細胞数はすぐに全身スプレッド3を減らすためにマトリゲルを注入しなければならない。第二に、技術的な適切な注入、外科的切除（摘出術）を実施し、追跡の困難（かつ定量）自発metastatiCの成長は挑戦することができますし、（詳細については説明を参照）、この手法を採用する場合、いくつかの重要な変数は、検討が必要です。このプロトコルの目的は、同所移植、切除（腎摘出）、および自発的な転移性腎細胞癌疾患のモニタリングの重要なステップ（および潜在的な落とし穴）を記述するために、標準化され（そしてより広範な）のための指針を提供するために科学的な研究室の中で使用しているそれは、実験的治療法の有効性を評価する。

<table><tbody><tr><td>DMEM-Pyrによる高グルコース。L-グルタミン</td><td>コーニング</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン EDTA</td><td>コーニング</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS カルシウム &マグネシウム</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354234</td><td>氷上に保管する必要があります</td></tr><tr><td>人工涙潤滑剤眼軟膏</td><td>アコーンアニマルヘルス</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr>ポケット<tr><td>プロペットトリマー</td><td>ブレインツリー科学</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>アルコールスワブ</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン溶液スワブ</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみストレート、鈍い - 25 mmブレード - 4.5 "&nbsp;</td><td>Southpointe外科</td><td>用RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>アイリス鉗子、鋸歯状、湾曲、長さ10 cm</td>の<td>ケント科学</td><td>INS15915</td>、これらの10 & micro<td>のうちの2つが必要です</td></tr><tr><td>。l ハミルトン シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G、45 度、RN ニードル</td><td>ハミルトン</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿チップ appicator</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>高温焼灼キット</td><td>ケント サイエンティフィック</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 コーティング Vicryl、従来のカッティング ニードル&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>7 mm クリップ用リフレックス クリップ アプライヤー</td><td>ケント サイエンティフィック</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>リフレックス クリップ、7 mm、非滅菌</td><td>ケント サイエンティフィ</td>ック <td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>リムーバル、長さ 12 cm</td><td>ケント サイエンティフィ</td><td>ック INS500347サイエンティフィック カブ</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 塩化ナトリウム</td><td>バクスター ヘルスケア</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン 0.01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8 "針</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>1 mlシリンジ(針付き</td>)<td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジーLUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

腎摘出後のマウスにおける自発転移性腎細胞癌（mrcc）をモデル化する

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

腎細胞癌（RCC）の新実験治療の改善されたテストの重要な課題の一つは、忠実に早期及び後期転移性疾患の進行を再現モデルの開発である。典型的な腫瘍移植モデルは、異所性または同所原発腫瘍移植を利用しますが、いくつかは、臨床設定を模倣全身自発転移性疾患が含まれる。このプロトコルは、患者さんに似腎細胞癌疾患の進行段階を開発するための重要な手順について説明します。まず、同所性腫瘍細胞移植を示すために同系モデルにおいて、高転移性マウス腫瘍細胞株を使用する。方法は、漏れや、早期の広がりを防ぐために、マトリゲルと組み合わせた細胞のサブ莢膜空間に表面的で、内部の移植が含まれています。その横には、重要な前と手術後のマウスの注意を払って、腫瘍を有する腎臓（腎摘出）の切除のための手順について説明します。最後に、監視し、評価するために必要な手順の概要を説明生物発光イメージングなどのミクロおよびマクロ転移性疾患の進行は、同様に全身性疾患の分布を獲得するための詳細な視覚的剖検ガイドを提供します。このプロトコル記述の目標は、将来の治療試験の予測値を改善するために臨床的に関連する転移性RCCモデルの普及を促進することである。

図1Aは、このプロトコルの概要で説明する手順を概説する回路図を示します。いくつかの重要な要因は、各ステップのために考慮されなければならない。たとえば、ステップ1で、それは、腎臓へのサブ莢腫瘍細胞移植のための二つの方法を示しています。腫瘍細胞は、針の慎重な除去と拭き取り過剰エスケープ流体（ 図1B-I）により防止漏れ細胞の局所的な配置を確認した小さな白い泡のサブ莢の空間に移植することができる。漏れを防止するために、細胞は、サブ莢空間（ 図1B-II）に到達するために内部第移植し、血流中に腫瘍細胞の初期分布を防止するために、マトリゲルと組み合わせることができる。腎臓の外科的除去のために、正確なタイミングは、使用される細胞株の成長および転移の可能性に依存する。最適な腎摘出の練習は、マウスの苦痛と回復を最小限に抑えるために高速だが、制御、外科的手順が含まれています。 T尿管、腎動脈と静脈を閉鎖するビクリルのIGHTで安全な結節（ 図1C参照 ）出血を避けるための鍵となります。焼灼を使用する必要がありますが、過...

自発的な転移性腎細胞癌（RCC）、疾患進行のモデルは、臨床的に関連する設定で治療を評価するために使用することができる。このプロトコルは、同所腎臓腫瘍細胞移植、適切な腎摘出のためのさまざまな手順を示していて、最終的には転移性の負担とローカリゼーションの視覚的および生物発光採点のための剖検ガイドの概要を説明します。

腎摘出後のマウスにおける自発転移性腎細胞癌（MRCC）をモデル化する

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

本手順の全体的な目的は、臨床的に関連性のある自発的な転移性腎細胞癌を生成することです。まず、植え込み用にReka Luke細胞を調製し、次に腎臓への正位的な腫瘍細胞植え込みを行います。次に、腫瘍が成長した後、腎摘出術を行って原発腫瘍を除去します。最終ステップでは、腎摘出後の自然転移の進行をモニタリングし、さまざまな部位における疾患の分布を評価します。最終的に、本プロトコルにより、自然転移を伴う腎細胞癌のモニタリングが可能となり、実験的治療法の有効性評価を標準化するためのガイドラインが提供されます。異所性、あるいは多くの場合、表在性または皮下への腫瘍細胞移植といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、腫瘍細胞が全身に転移する能力を含め、患者に見られる腎細胞がん（RCC）の状態を再現できる点にあります。本手法の意義は腎細胞がんの治療にまで及びます。なぜなら、患者における死亡の真の主因は、全身性の転移性疾患であるためです。マウスモデルでは通常、腎摘出術後に起こりうる自然発生的な転移性疾患を再現することはできません。この手法は、自発的な転移性RCC疾患に関する知見を提供できるだけでなく、原発腫瘍の除去が一般的であり、死因の主因が術後の転移性疾患の再発である他の癌種にも適用可能です。これには、乳癌やメラノーマなどのモデルが含まれます。一般的に、この手法に不慣れな方は、まず腎臓の特定が困難であること、および移植時に腫瘍細胞を局在させ、漏出を防ぐことが難しいことから苦戦します。次に、処置が効率的に行われ、術後の回復が可能であるかという点です。正位移植を行う前に、ルシフェラーゼ標識マウスRenCa細胞またはRenCa-Luc細胞を、トリプシン処理後、5% FBS含有培地で再懸濁し、単層で75%コンフルエントになるまで培養します。遠心分離を行い、PBSでの洗浄を3回繰り返した後、細胞を無血清培地で再懸濁し、無血清培地5 µLあたり5 × 10⁴個のRenCa-Luc細胞となる濃度に調整します。2～3%のイソフルランでマウスを麻酔した後、足をつまんで十分に麻酔がかかっているかを確認します。乾燥を防ぐために目に動物用軟膏を塗布し、マウスを右側臥位にして、前肢と後肢の間の左側を除毛します。次に、腰部背側に沿ってアルコールとヨードを塗布します。外科用ハサミを使用し、最終肋骨と股関節の間の縦方向に1cmの皮膚切開を行います。次に、鈍的剥離用はさみを使い、皮膚下の結合組織を緩めます。続いて、外科用はさみを用いて腹壁に縦方向に0.5 centimeterの切開を加えます。ここで、弯曲鉗子を使用して、切開創の周囲をそっと押し下げます。これにより腎臓を体外に露出させ、注入前に臓器を優しく固定することができます。準備した細胞混合液 5 µLをハミルトンシリンジに充填し、浅い被膜下への移植を行います。針の斜面を上に向け、腎臓の長軸に対して平行に保持し、腎被膜の下かつ実質の上に針を挿入します。針が所定の位置に固定されたら、小さな白い気泡が形成されるまですべての細胞を注入します。カプセルからゆっくりと針を抜き、直ちに滅菌綿棒を使用して注入部位を塞ぎ、内部被膜下移植を行います。移植希望部位とは反対側の腎臓側面から開始してください。針の切端（ベベル）を上向きかつ内側に向けて保持します。針が見える位置まで腎臓内部に挿入しますが、反対側の被膜下腔を穿刺しないように注意してください。白い気泡が形成されるまで細胞を注入し、漏出を防ぐために注入部位を綿棒で拭います。腎臓を慎重に体腔に戻します。吸収性5.0 Vicryl縫合糸を用いて腹壁を閉鎖します。完了後、皮膚層を合わせて、回復させる前に2〜3箇所の創傷クリップを留置します。0.9%塩化ナトリウム500 µLおよびブプレノルフィン100 µLを皮下に投与します。移植後26〜30日に、動物を麻酔し、前述と同様に腎臓を露出させます。次に、鉗子を使用して腎臓の尾側から結合脂肪組織を慎重に取り除き、頭側から副腎を摘出します。ピンセットで腎臓をそっと掴み、吸収性5.0 Vicryl縫合糸を尿管、腎動脈、および腎静脈の周囲に通します。次に、止血鉗子で糸を固定し、ゆっくりと二重結びにします。鋏で結び目の上方を切断し、腎臓を取り出します。腎臓を摘出した後、結紮部位や動脈からの出血がないか慎重に確認し、必要に応じて電気凝固を行ってください。5.0 Vicrylを用いて腹壁を縫合した後、皮膚をクランプで閉鎖します。その後、動物に苦痛の兆候、出血、または運動能力の低下がないか毎日観察してください。動物を安楽死させた後、外科用ハサミを用いて、尿道上端から胸腔を経て下顎まで切開します。鈍端ハサミを使用して、腹壁の筋肉から皮膚を分離します。次に、腕と脚に沿って皮膚を切開し、ゆっくりと皮膚を剥離します。皮膚筋膜と腹壁に結節がないか詳細に検査します。次に、表在リンパ節を検査します。腹壁を切開し、左右の外側に沿って横隔膜まで切断します。水平に1回切開します。腹壁の前部を取り除き、内臓を露出させます。内臓の未処理の状態を確認し、肉眼的に顕著な腫瘍がないか検査します。また、食物の有無や出血の痕跡を確認するため、胃および腸の内容物を観察してください。22箇所のチェックリストに基づき、各臓器に腫瘍が存在するかどうかを視覚的にスコアリングします。これらのスコアは、特定のグループ内の動物ごとに集計され、疾患の分布を比較するために使用されます。次に、肝臓を慎重に取り出し、PBSで洗浄してください。次に、肉眼的な腫瘍や異常がないかを確認し、前述と同様にスコア付けを行います。その後、脾臓、腎臓、および膵臓を取り出してスコア付けします。続いて、腰仙骨リンパ節、腎リンパ節、および腸間膜リンパ節を含む腹部リンパ節を検査します。横隔膜に転移の徴候がないかを確認した後、横隔膜を除去し、胸腔の側面に2か所の切開を加え、前面部分を取り除いて肺と心臓を露出させます。食道をそっと持ち上げ、心臓の上方で気管を切断します。肺と心臓を取り出した後、組織に結節がないかを確認します。次に、鉗子を用いて心臓を圧搾します。弾力性の不一致は、腫瘍の存在を示唆している可能性があります。最後に、外科用鋏を用いて頭蓋骨を直線的に切開します。脳全体が露出するまで、頭蓋骨の破片を慎重に取り除いてください。5つの異なる動物群における疾患の有無、分布、および重症度を評価するために、視覚的スコアリングシステムが用いられました。これらの群では、疾患の範囲と重症度に差が見られました。さらに、犠牲直後にバイオルミネッセンスイメージングを行い、微小および巨大転移病変を定量的に評価しました。移植の手技を習得すれば、適切に行うことで、1匹あたり5〜10分で腎摘出または剖検を完了できます。転移性腫瘍細胞の種類によって治療反応が異なるかどうかを検討するため、転移性腎細胞がん由来の細胞を用いました。現在、開発後の局所および転移性疾患の増殖を評価するため、患者由来の組織を動物に直接移植する方法が用いられています。この手法により、RCC分野の研究者は、臨床的に関連のある疾患の進行および治療への反応を探索することが可能となりました。特に、それらの反応が、原発性の局所疾患であるか、あるいは自然発生的な転移性増殖であるかによって異なるかどうかが焦点となっています。複数の手術を受ける小型動物を扱う際は、施設の動物実験プロトコルのガイドラインおよび無菌条件を厳格に遵守する必要があることに留意してください。本手順を適切に実施するためには、動物の快適性と回復が極めて重要な変数となります。

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