Name: ホット生物触媒：等温滴定熱量測定酵素反応を特徴づけるために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 学ぶ等温滴定熱量測定（ITC）を用いた酵素反応の熱力学的・動力学的解析法。尿素加水分解反応を例に、jack bean ureaseのkcatとKmを測定するラベルフリー手法を解説します。

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1。準備サンプル<ol><li>酵素溶液2ミリリットル、各実験操作のための基質溶液0.5mlを準備します。基質添加時に希釈および混合の熱を最小限にするために同一の組成を有する緩衝液中で酵素と基質の濃縮ストック溶液を希釈する。 <ol><li>実験中にpHの変化を防ぐために適切である緩衝液の条件を選択してください。例えば、20mMのHEPES pH7の中性pHでの測定に適している。 注：プロトン交換が関与している場合、それらは反応の測定ΔHに影響するため、使用されるバッファのプロトン化エンタルピーは、考慮しなければならない。分析中のシステム上のバッファや添加物分子の可能な具体的な効果を考慮しなければなりません。有機溶媒（ 例えば、DMSO）を酵素液に含まれている場合、基質溶液中に、正確に同じ濃度でそれらを追加する。 </li><li> M1の実験のために、開始nM範囲の酵素濃度（ 例えば、1 nM）を有する、酵素濃度よりも上記とK M 3桁以上高い基質濃度を有する。 </li><li> M2の実験では、PM-nM範囲の酵素濃度（ 例えば 15時）から開始します。シリンジ内の基質濃度は、10mMの範囲（ 例えば、400 mM）の中にある。 注：単回注射のM1の実験では、濃度が、実験時間をかけて製品への総基質変換を達成するの​​に十分でなければなりません。そのため、酵素の濃度は、酵素レートによって異なります。低k 猫との酵素が検討されている場合、より高い酵素濃度（最大10μm）を使用する必要があります。一方、M2実験に使用される酵素濃度は、注入された基板はわずか（5％未満）が消費酵素反応が定常​​状態で進行することがあることを保証しなければならない。このため、より高い酵素の効率、必要な酵素濃度は低い。実験の終わりに、試料セル中の基質濃度は、K Mよりも高くあるべきである。 </li></ol></li><li>慎重に280nmで、比色、BCAアッセイ11で適切な分析手順（ 例えば吸光度、酵素と基質濃度をチェックしてください。これは、熱力学および動力学的パラメータの正確で信頼性の高い計算を得るために必要とされる。 </li><li>溶液のpHを測定し、酵素と基質溶液の両方のpHの不一致が実験条件（±0.05 pH単位）の下で最小であることを確認してください。 </li></ol> 2。実験を行う注：同じ手順を両方次々に実行され、M1とM2の実験のために適用する必要があります。 <ol><li>サンプルセルと注射器がメーカーのに従って洗浄されていることを確認し指示。蒸留水で機器に付属のローディングシリンジを記入し、静かに、試料セル内の針を挿入し、セルを満たし、同じ注射器を用いて液体を除去。この方法を使用して、緩衝液で2回蒸留水で2回試料セルを洗浄し。 </li><li>慎重に気泡の形成を回避し、ローディングシリンジを用いて酵素液2mlで試料セルをロードする。それは細胞幹の上をこぼしまで、ゆっくり細胞に溶液を注入する。 CAのスパートを生成します。ソリューションの0.25ミリリットルのセルに。二回繰り返します。このステップは、試料セル内に混入した気泡を除去する。 </li><li>細胞幹細胞とポートとの間の棚に積載注射器の針を配置し、余分な溶液を除去。 </li><li> VP-Viewerプログラムを起動し、コンピュータのインターフェイスから、目的の実験温度より低い温度3℃にITC装置を平衡化。これは、長い平衡化を避けるために必要である受動的な楽器の冷却装置による実験前の期間、。 </li><li>上記と同様の手順で、蒸留水で参照セルを埋める。高イオン強度又は高浸透圧を有する緩衝液を試料溶液中にある場合に、同じ緩衝液は、基準として使用されるべきである。 </li><li>薄いシリコンチューブを使用して、注射器の充填ポートにプラスチックシリンジをリンクします。水が注射器が満杯であることを示す、上部充填口から出てくるまで、水の中に針先端を配置し、汲み上げ注射器を充填する。その後、注射器を空にし、水から注射器の先端を移動させ、空気を引き込む。この手順では、緩衝液を注射器を洗浄し、システムを介して空気を引き込む。続いて、チューブの底に溶液の少量を残して、慎重に引き、完全に注射器を充填する、基質溶液0.5mlを含有する細管内に注射針を配置する。 </li><li>からコンピュータインターフェース、Enterキーを押し、「閉じる充填ポート」。シリコンローディングチューブを取り外します。を押して「パージとリフィル「気泡を取り除くために、バックバルク溶液にそれらを排出するために注射器を可能にするためのボタンを。二回繰り返します。 </li><li>任意の水滴を除去し、サンプルセル中に注射器の針を配置するために脇に拭き、注射器を移動します。 </li><li>コンピュータ上で、適切な運転パラメータを設定します。実験的な酵素および基質濃度を示すことができる。 <ol><li> M1実験では、再現性を確認するために、基板の少なくとも二つの加算（5〜30μl）を設定する。熱信号は、次の添加の前にベースラインに戻っていることを確認するのに十分な大きさごとに注射（ 例えば千秒）の間の間隔の時間を設定します。 </li><li> M2の実験では、複数（ 例えば 15×5〜10μL）の注射を設定します。注射の間隔を設定します（ 例：180秒）sにシステムを可能にする各注射後に新しいベースラインに火力をtabilize。 NOTE：M2実験において注射の間の間隔時間は、測定値が定常状態条件下で行うことができるように、基質のかなりの量の変換を回避するのに十分に短くすべきである。 </li><li> M2の実験では、その対応する値、その後のデータ解析の際に廃棄されている最初の注射のために、少量（ 例えば 2μL）を使用します。実際に、多くの場合、注射器の先端を介して初期基板拡散によるアーチファクトを提示し、注射針に捕捉された気泡の存在である。 </li><li>基準パワー、反応が開始する前に、ベースラインが20の値で、配置されているおおよそのレベルを設定します。その後、実験的な酵素と基質濃度を定義し、テストの名前を選びました。 </li><li>典型的には25℃で、実験温度を定義するITCは2間の作業温度を許可する<html> ℃〜80℃、実験は、実行するための準備ができています。実験を開始するを押して「スタート」ボタンを押します。 </li></ol></li><li>実験が完了したら、製造業者の説明書に従って試料セルとシリンジをきれい。 </li><li>データの再現性を確認するための実験を​​少なくとも1つまたは2つ以上の回繰り返す。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>解析プログラムから、「データを読み込む」ボタンをクリックして、実施したM2の実験の。ITCファイルがあるフォルダに移動します。 「ファイルの種類」のスクロールダウン矢印をクリックし、「酵素アッセイ（それを？）」を選択します。その後、クリックして、M2の実験の。ITCファイルを開きます。 </li><li> 式5によると、M1の実験の曲線を統合からの反応のΔHを取得します。 &quot;幅=&quot; 126 &quot;/&gt;（5） <ol><li> 「データの読み込み」ボタンをクリックすると、行わM1実験のファイル。ITCを選択します。原産地を使用して、一つのピークをそれぞれ含むさまざまな部分でのトレースを分割し。OPJファイルとして各ピークを保存します。単回注射のM1実験のサーモのベースラインのずれに起因する、最初のピークに対応したファイルを開き、それを統合し、得られた面積値を分割し、μcalで表し、試料セル中の最終基質濃度によって、μmで、および細胞容積によって式5の反応のΔHによると、決定、リットルで表した。 </li><li> M1の実験の第二のピークのために同じ手順を繰り返し、2ΔH測定の平均値を取得する。 </li></ol></li><li>各注射後の元のベースラインと新しいベースラインとの間の差を測定するのM2実験からDQ / DTを決定します。 Eを変換式4による反応速度への新実験データはM1の実験で得られたエンタルピー値を使用してミカエリス·メンテン式にデータをフィットします。 <ol><li>解析プログラムから、「データを読み込む」ボタンをクリックして、実施したM2実験のファイル。ITCを選択します。 「ファイルの種類」のスクロールダウン矢印をクリックし、「酵素アッセイ（それを？）」を選択します。 </li><li>酵素アッセイダイアログボックスは4つのモデルのいずれかを選択できるように、オープンします。窓から - &quot;基板のみ方法2」を選択します。 </li><li> ΔHウィンドウでは、ステップ4.2で得られたΔHの値を示している。 </li><li>適合手順で使用される濃度値をチェックするために「集中」ボタンをクリックしてください。 「平均時間（P）」ボタンをクリックしてください。ダイアログボックスは、デフォルト値を変更するか、受け入れる機会を与えて開く。この値は、各注入前の時間を表す各基質濃度における電力レベルを決定するためのイオンで楽器平均電力信号。デフォルト値を確認して[OK]をクリックします。 </li><li> 「ゼロY軸」ボタンをクリックしてください。カーソルは、Y = 0で配置するために、ポイントをダブルクリックすることができ十字に変わります。ちょうど最初の注入点の前にダブルクリックします。 </li><li>計算速度のボタンをクリックします。速度は、（アカウント希釈効果を考慮）試料セル容積のために滴定中に加え、基板を割った基質濃度に対してプロットする。この動作は、K Mおよびkの猫を得るために取り付けることができる典型的なミカエリス·メンテン·プロットを与える。 </li><li>いくつかのポイントを削除する場合は、「切り捨てデータ」ボタンを選択します。不正なデータポイントと入力するマーカーやプレスの1をダブルクリックを除外するためにデータマーカーを移動します。 </li><li>カーブにフィットし、するような「モデルに適合」機能を使用する速度定数を得る。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

既存の方法に関連して酵素活性を研究するITCの意義 結合平衡を研究するための古典的な用途に加えて、等温滴定熱量計は、システムの改変または標識を必要とせずに、プローブとして反応熱を用いて溶液中で酵素反応を特徴付けるため信頼性が高く、迅速な方法を提供する。速度論的パラメータは猫を kとK Mは 、通常、生成物形成（又は基質消費）が連続または不連続のアッセイでモニターされる時間経過実験のセットを介して得られる。典型的には、基質又は生成物の濃度は、特性の波長の光の吸光度または蛍光によって測定される。しかし、ほとんどの基板および/または製品は、分光学的にアクティブではないので、発色団または蛍光団は、反応を追跡するために含まれている必要があります。との代わりに、結合されたアッセイ、測定可能な生成物と別の反応のための基質である触媒反応の生成物は、使用することができる。しかしながら、これらの方法は、K Mおよびk 猫</sub...

生化学反応の定量は生命の基礎で生物学的プロセスへの洞察を提供しています。熱量測定を定量的に、溶液中のほぼすべての化学反応を特徴づけるラベルフリーの方法論を提供しています。この技術は、経時的に放出または吸収される熱を測定し、したがって、分子（ 即ち、結合熱力学）を反応させるの量を定量化するため、ならびに反応速度（ すなわち、反応速度）を測定するためのユニバーサル検出システムと非常に便利な方法である。特に、等温滴定熱量測定（ITC）は、タンパク質-リガンド、タンパク質-タンパク質、タンパク質-金属イオンおよびタンパク質-DNA相互作用1-6伴う、生体分子の熱力学平衡を特徴付けるための選択の方法として採用されている。本出願の電位がまだあるがまた、動力学的情報を提供するITCの能力は、その酵素触媒を測定するための非常に強力なシステムとなる7-9を過小評価していた。 ミカエリス定数（K M）および触媒速度定数（k cat）を ：は、2つの動態パラメータに応じて、反応速度及び基質濃度との関係を提供するので、ミカエリス-メンテン式10は 、酵素反応の定量的記述である。 の k cat / K M比が酵素の触媒効率と呼ばれる。実際には、特定の反応のために、K、MとKの猫の決定は、触媒作用の完全な説明を提供しています。 典型的な酵素反応（ 図1）において、基板（S）は、その後、遷移状態中に活性化される酵素-基質（ES）複合体を形成する酵素（E）、（ES *）と相互作用する。後者は、最終的には解離し、酵素生成物（EP）錯体に変換される。これらのステップsが、以下の反応により記載されている。 <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> （1） k 1は ES複合体の形成の速度定数である場合の k cat は触媒速度定数またはターンオーバー数であるが、kが-1、ES複合体の解離の速度定数である。 ミカエリス·メンテン式10によれば、反応速度は次のように計算できます。 <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> （2） ここで、K、M =（K -1 + K 猫 ）/ K 1とK 猫 = V maxは / [E]、V maxは 、すべての酵素が基質に結合されたときに到達した最大速度であることと。 等温滴定熱量計は、尿素の酵素的加水分解を特徴づけるためにこの研究で使用される機器である。この器具は、2つの造語状細胞（ 図1）を含有する断熱シールドで形成されている。これらは、狭いアクセスチューブと外部に接続されている。基準セルは、一般に水または分析のために使用される溶媒で満たされている間に試料セル（ 約 1.4ミリリットル）を、酵素溶液でロードされる。通常、基質溶液の約0.3 mlを含む長い針及び取り付けられた攪拌パドルを有する回転注射器は、試料セルに取り付けられている。熱電素子」とは、細胞フィードバックネットワーク」を用いて、試料と参照セルとの間の温度差を測定し、熱を加算または減算することによってゼロにあるこの差を維持する。実験中、基板は、一定の選択された温度で酵素溶液に注入される。ときはアンzymatic反応は、放出又は吸収される熱の量は、生成物分子に変換される基質分子の数に比例する、起こる。また、熱流の速度を直接反応速度に関係する。最初のベースラインからの熱痕跡のずれ（ 図1）として現れる測定データは、試料セルで発生する熱流に比例した試料セルに機器によって供給される熱出力（μcal/秒）を表す時間をかけて。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。酵素反応を研究するための等温滴定熱量計の概略図。酵素反応は、酵素溶液に（注射器）に基板の滴定の際に発生する（試料セル内）THERの変化をもたらすサンプルセルとリファレンスセル定数の温度差を維持するのに必要な熱量計によってリリースMALパワー、。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> 全体的に、熱変化（Q）は、反応（ΔH）のモルエンタルピーひいては全体積倍の濃度で与えられる（n）が生成された生成物のモル数に比例する。 <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> （3） 反応速度に対応する時間（のdP / dt）は上の生成物の形成は、このようにして関係を介して、同時に（dQ / dtは）上で発生した熱の量に関連することができる。 <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> （4） この式によれば、ミカエリス-メンテンプロットを得るためには、私を測定する必要がある）合計モルエンタルピーΔH、および異なる基質濃度でdQ / dtは ii）の熱流。通常、これは、2つの異なる実験で行われる：第一の実験（ 方法1、M1）において、基質は、酵素溶液中に注入され、完全な基質変換のための熱を測定する;第二の実験（ 方法2、M2）は、基板の複数回の注入が行われ、熱発生の速度は、異なる基質濃度で測定される。これら2つのデータセットは、動力学的パラメーターK Mおよびkの猫を導出するのに十分である。 本記事では、ITCを用いて行われる酵素反応のための速度論的パラメータを決定する一般的なプロトコルが記載されている。私たちは、Canavalia ensiformis尿素により尿素加水分解法を適用それ自体、基準システムとして。この方法を用いて得られた結果を、文献に報告されたデータとの間の良好な一致は、このアプローチの信頼性を実証する。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td> 水<td>に溶解し、NaOH で pH を調整する</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>HCl で水に溶解し</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>で Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>水に溶解</td></tr>する <tr><td>リン酸二塩</td>基性 <td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>水に溶解</td></tr>する <tr><td>尿素</td><td>シグマ</td><td>U4128</td>は<td>40°Cで水に溶解します。C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis ウレアーゼ (タイプ C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td> を <td>20 mM HEPES pH 7 に溶解し、-80 °C で保存。</td></tr><tr><td>C VP-ITC on Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td>SYS13901</td><td>装置&nbsp;</td></tr><tr><td>VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td><td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ホット生物触媒：等温滴定熱量測定酵素反応を特徴づけるために

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

等温滴定熱量測定（ITC）は、ほぼすべての化学プロセスを特徴付けるために固有のプローブとして使用して、化学反応の間に放出または吸収される熱を測定​​する十分に記載された技術である。今日では、この技術は、広く生体分子の結合平衡の熱力学的パラメータを決定するために適用される。また、ITCは直接アプリケーションがまだunderexploitedであっても、酵素反応の動力学及び熱力学的パラメータ（ の k cat、K M、ΔH）を測定できることが実証されている。熱変化は、自発的に酵素触媒反応中に発生するように、ITCは、分析中のシステムの任意の改変または標識を必要とせず、溶液中で行うことができる。さらに、この方法は、材料の少量を必要とする。これらのプロパティは、ITCのようないくつかのアプリケーションでは、例えば、薬剤の発見に酵素反応速度を研究するために、非常に貴重な、強力でユニークなツールとなっています。 、Canavalia ensiformis（ジャック豆）ウレアーゼによる尿素の酵素加水分解のK 猫とK Mを決定するために適用される。反応の固有のモルエンタルピー（ΔHの整数 ）の計算が行われる。このようにして得られた値は、方法の信頼性を実証する、文献に報告され、以前のデータと一致している。

ウレアーゼ（EC 3.5.1.5、尿素アミドヒドロラーゼ）は古細菌、バクテリア、単細胞真核生物および植物に見られるマルチサブニッケル含有酵素である。自然発生的にアンモニアと炭酸水素塩（ 式6）12の第2の分子を与えるために分解し、アンモニアおよびカルバメートに尿素の加水分解を触媒する有機窒素無機化の最終段階で、このタンパク質が作用し、。 <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq6.jpg" width="450" /> （6） この反応は、人の健康や農業13に負の影響の責任がある環境のpHの全体的な増加の原因となる。植物では、ウレアーゼの主な役割は、アルギナーゼ由来尿素14から栄養素の窒素をリサイクルすることです。植物ウレアーゼは、2のNi 2 +イオン15と活性部位を含む各サブユニットと、一般的に...

熱流が化学反応で放出又は吸収等温滴定熱量測定する。この方法は、酵素触媒作用を定量化するために使用することができる。本論文では、楽器の設定、実験の実行、およびデータ分析のためのプロトコルは、一般的に説明されており、ナタマメウレアーゼによる酵素尿素加水分解の評価に適用。

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

本実験では、等温滴定カロリメトリーを用いて、溶液中における酵素反応の熱力学および速度論を定量的に決定する、信頼性が高く迅速でラベルフリーな手法について説明します。この手法では、時間経過とともに放出または吸収される熱を内部プローブとして利用します。具体的には、装置のサンプルセル内で一定温度の下に酵素反応を進行させ、熱量トレースが初期ベースラインからどの程度逸脱するかをモニタリングすることで測定を行います。「手法1」または「M1」と呼ばれる最初の実験では、基質を酵素溶液に注入し、基質が完全に変換されるまでの熱量を測定することで、反応の全モルエンタルピーを決定します。メソッド2（M2）と呼ばれる2番目の実験では、基質を複数回注入し、異なる基質濃度における時間経過に伴う発熱速度を測定します。これら2つのカロリメトリー実験から得られた結果により、ミカエリス・メンテン型の酵素触媒反応を想定して、速度論的パラメータであるkcatおよびkmを決定することが可能となりました。産物の生成を時間経過とともに追跡する分光光度法などの他の手法と比較して、等温滴定カロリメトリー（ITC）を用いる主な利点は、解析対象となる系に修飾や標識を必要とせず、反応自体の固有熱を内部プローブとして利用するため、ごく少量の試料で済む点にあります。当研究室の博士課程の学生が、まず酵素の濃縮液を2 mLのバッファーで希釈し、M1実験用の最終酵素濃度をナノモル範囲に調整します。次に、基質の濃縮液に0.5 mLのバッファーを加え、基質濃度を酵素濃度よりも少なくとも3桁高く、かつkm以上になるように調整します。M2実験では、最終濃度をピコモルからナノモル範囲とした2 mLの酵素溶液を調製します。基質を0.5 mLの緩衝液で希釈し、ミリモル範囲の基質濃度にします。サンプルセルと注入用シリンジがメーカーの指示に従って洗浄されていることを確認した後、ロード用シリンジに蒸留水を満たします。次に、サンプルセルにニードルをゆっくりと挿入し、セルを満たして前述の方法で液体を取り除き、サンプルセルを蒸留水で2回、緩衝液で2回洗浄します。酵素溶液を、セルステムの頂部から溢れ出すまでゆっくりと注入します。サンプルセル内に閉じ込められた気泡を取り除くため、約0.25 millilitersの溶液をセル内に勢いよく注入します。この操作をさらに2回繰り返します。充填用シリンジの針をセルステムとセルポートの間の棚に置き、余分な溶液を取り除きます。VPビューアプログラムを起動し、ITC装置を目的の実験温度より3 °C低い温度で平衡化させます。前述と同様の方法で参照セルに蒸留水を充填した後、細いシリコンチューブを用いてプラスチック製シリンジを注入用シリンジの充填ポートに接続します。注入用シリンジの先端を水に浸し、上の充填ポートから水が出て注入用シリンジが満たされたことが確認できるまで充填します。次に、シリンジのチップを水から出し、空気を吸い上げて注入シリンジ内を空にします。同様の手順で、注入シリンジをバッファーで洗浄し、システム内に空気を吸い込ませます。続いて、清潔な細いチューブに基質溶液を入れます。それをシリンジの下に配置し、注入用シリンジの針を完全に挿入します。コンピューターインターフェースを操作し、チューブの底に少量の溶液が残るように注入用シリンジを満たします。「fill port（充填ポート）」を閉じるボタンを押してください。シリコンローディングチューブを取り外した後、「purge and refill」を押して、注入用シリンジ内にある気泡を解消し、バルク溶液中に排出します。続いて、ペーパータオルで注入用シリンジの側面を拭いて残った溶液を取り除き、サンプルセルに設置します。M1実験では、再現性を確認するために、5～30 µLの基質を少なくとも2回添加するように設定してください。次に、各注入の間の間隔時間を十分に長く設定し、次の添加前に熱信号がベースラインまで戻るようにします。M two実験では、5～10 µLの注入を複数回行います。注入間のインターバルを設定し、各注入後にシステムが熱出力を新しいベースラインに安定させるようにしてください。ここで、リファレンスパワーを20に設定します。次に、実験に用いる酵素および基質濃度を定義し、実験名を選択します。温度を25°Cに設定し、実験を開始します。実験終了後、メーカーの指示に従ってサンプルセルとシリンジを洗浄してください。Origin 7.0ソフトウェアを起動し、[開く]ボタンをクリックして、M1実験の熱履歴における1回目の注入に対応するファイルを選択します。反応のΔHを決定するために、単回注入のサーモグラムにおいてベースラインからの偏差により生じた最初のピークを積分します。M1実験を行います。次に、マイクロカロリーで表される反応全熱量に対応する得られた面積値を、マイクロモーラーで表される試料セル内の最終基質濃度およびリットルで表される試料セル容量で除します。M1実験の2番目のピークに対しても同様の手順を繰り返し、2回のΔH測定で得られた値の平均を算出します。その後、各注入後の元のベースラインと新しいベースラインの差を測定することにより、M2実験からdQ/dTを決定します。これは、以下の式に従って実験データを反応速度に変換することで行えます。M1の実験で得られたエンタルピー値を用います。その後、解析プログラムを用いて、特にミカエリス・メンテン式にデータをフィットさせます。「データ読み込み」ボタンをクリックし、M2実験データが保存されているフォルダに移動します。次に、「ファイル形式」のプルダウンメニューから「酵素アッセイ」を選択します。その後、目的のファイルをクリックして開きます。M2実験のITCを行います。酵素アッセイのダイアログボックスが開いたら、ウィンドウから「method two substrate only」を選択し、ΔHウィンドウにM1実験で得られたΔHの値を入力します。次に、「zero y axis」ボタンをクリックし、最初の注入直前の点をダブルクリックします。「calculate rate」ボタンをクリックして、基質濃度に対する速度をプロットします。最後に、「fit to model」機能を使用して曲線をフィッティングし、速度論的定数を求めます。ITCが酵素触媒の定量的決定に適用可能であることを示す代表的な反応として、cannavaleおよびCMISまたはJAK bean URIの溶解活性を選択しました。M1実験において、ウレアーゼ溶液への尿素基質の注入により生じる熱出力を積分し、反応を完結させることで、ΔH値として-10.5 kcal/molが測定されました。M2実験で記録された熱出力は、以下の式を用いて反応速度に変換されました。得られたデータをMichaelis-Menten式にフィッティングさせることで、20 mM HEPESにおけるジャックビーンウレアーゼの速度論的パラメータを算出しました。pH 7においてkcatは30,200 s⁻¹、KMは3.45 mMであり、これは既報のデータと一致しています。M1実験で測定された全熱変化は、分析中の反応において起こるすべての事象の合計であり、基質から生成物への変換だけでなく、関与するすべてのプロセスのモルエンタルピーに依存します。緩衝溶液中で反応系がプロトンを取り込む一般的なプロセスでは、緩衝剤がプロトンを放出するため、反応セル内で追加の熱が発生します。したがって、測定されたΔHは見かけの値であり、反応自体の固有のΔHに加えて、強調表示された式に従い、緩衝液の電離エンタルピーおよび交換されるプロトン数が含まれています。M1実験においてこの式を用いることで、異なる電離エンタルピーを持つ緩衝液で同様の実験を行い、交換されるプロトン数と固有のΔHを決定することができます。尿素加水分解の全反応では、緩衝液からプロトンが取り込まれます。したがって、上述のように、反応熱には緩衝液のプロトン化による寄与が含まれます。加水分解反応の固有のΔHを算出するため、イオン化エンタルピーが既知で異なる3種類の緩衝液を用いて、3つのM1実験を行いました。固有のエンタルピーおよび緩衝液から放出されたプロトン数は、実験データの線形近似の切片と傾きから算出できます。それらはそれぞれ-14.7 kcal/molおよび0.98であり、以前に報告されたデータと完全に一致していました。この手順の応用範囲は、酵素反応の速度論が決定されれば、基礎研究から応用研究、さらには薬剤スクリーニングまで多岐にわたります。この実験を、異なる種類や濃度の酵素阻害剤の存在下で繰り返すことにより、阻害定数をモニタリングすることが可能です。

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Chemistry

化学

ITCは、そのホストへのリガンドの結合を研究するための強力なツールです。複雑なシステムではしかし、いくつかのモデルも同様にデータをフィットすることがあります。ここで説明する方法は、複雑なシステムのための適切な結合モデルを解明し、対応する熱力学的パラメータを抽出する手段を提供します。...

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細菌の代謝活性を監視するための等温マイクロカロリメトリー

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膜酵素で溶剤ダイナミクスによって誘導される解明エントロピーレートの高速化

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等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

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この記事では、自己組織化ジブロック共重合体ベースの超分子から得たナノポーラステンプレート上に無電解金属堆積経由秩序ニッケルナノフォームの製造が記載されている。...

ジブロック共重合体超分子からジャイロイドニッケルナノ構造

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マイクロ波支援酸 - 触媒反応によりシリカナノ粒子の調製

retropinacol /クロスピナコールカップリング機構に基づいて、非対称の1,2  - ジオールの合成のための新規のアカウントが記述されている。このため反応の触媒的執行に従来のクロスピナコールカップリングに比べて大幅な改善が達成される。...

Retropinacol /クロスピナコールカップリング反応 -  1,2  - 非対称ジオールに対して触媒のアクセス

学ぶ等温滴定熱量測定（ITC）を用いた酵素反応の熱力学的・動力学的解析法。尿素加水分解反応を例に、jack bean ureaseのkcatとKmを測定するラベルフリー手法を解説します。

ホット生物触媒：等温滴定熱量測定酵素反応を特徴づけるために

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