その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコルその場で幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション
2014年10月14日
ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。
この手順の全体的な目標は、損傷後の軸索誘導の研究のために、完全な脊髄、離断、および脳の解剖を行うことです。これは、最初に、5番目の鰓のレベルでランプレ脊髄を横断することによって達成されます。その後、脳を解剖し、シルガードに固定します。
脳を固定した後、メタノールに保存するか、またはすぐにin situハイブリダイゼーションに使用して、最終的に軸索の発現を変化させることができます。誘導受容体は、脊髄損傷後の再生する椎骨に見られます。今日ご紹介する技術は、従来のパラフィン切片やクライオスタット切片に比べて、脊髄に投射するニューロンを含む脳全体を見る
ことができ、その大きさが特定されている点です。その手順を実演しているのは、私たちの研究室の研究科学者であるキャシー・ザン博士です ミシガン湖の支流に供給する小川からペンシルベニア州のデラウェア川、またはメイン州の小川まで。種の野生型幼虫ウミランプレ。マルスのペットマイズが手に入りました。
4〜7歳の幼虫は体長が10〜14センチで、怪我や解剖に十分な大きさです。それらを52、100のグループで維持します。摂氏16度の50ガロンの淡水タンク。
タンクには、ヤツメウナギが借りることができるように、1インチの砂利基板が必要です タンクに追加されるすべての水は、タンクに追加される前に、少なくとも48時間木炭のろ過と曝気で調整する必要があります。動物が1年以内に使用された場合、この手順のために動物に餌を与える必要はありません。準備したばかりのリンガー溶液を用意します。
まず、ランプを飽和ベンゾカイン水溶液に移します。麻酔をかけたら、シルガードを半分入れた皿に移します。皿を氷の上に置き、皿に氷をのせます。
コールドリンガー。直径0.15の昆虫ピンを3本、鼻に1本、5本目の鰓に2本、動物を固定します。次に、手術のために実体顕微鏡の下に配置します。
まず、11番のメスを使用して、5番目のえらのレベルで背側正中線に沿って縦方向に切開します。これにより、この切開を行う際に脊髄が明らかになります。昆虫のピンから作られた2つのフックを使用して、カストロの露出番号8、はさみを使用して体壁を固定します。
露出した脊髄を垂直に切り込みます。脊髄の切断端を検査して、切断が完了していることを確認します。次に、鉗子を使用して、切り口を再調整し、傷を閉じます。
リンガー溶液に浸した濾紙にランプレ溶岩を移します。準備を氷のベッドに1時間移動して、1時間後に傷が乾くようにします。溶岩を氷冷水の小さなタンクに移します。
そこで24時間治癒させます。24時間後、離反に対する動きを確認します。動きがある場合、切断は不完全でした。
そうでない場合は、トランセクトは良好であり、動物が回復するまでの間、動物を室温のタンクに移動して回復させることができます。2〜3日ごとに水を交換してください。切除された動物が十分に回復したら、麻酔をかけ、前述のように解剖の準備
をします。脳を解剖するには、鼻孔と松果体器官の間の横切開から始めます。次に、カストロの子牛肉では、ハサミで脳の周囲の組織を切断し、動物を固定します。鉗子付き。
脳幹の両側にある白い楕円形の構造は耳嚢です。脳が露出したら、鉗子を使用して脈絡叢を取り除きます。次に、変更されたピンフックを使用して動物の頭を広げ、脳神経を露出させます。
次に、脊髄を鉗子で固定しながら、はさみで脊髄を横方向に切断します。脳神経を切開して脳を解剖します。次に、脳を小さなシリコン片に移し、そこに固定します。
脊髄に1本の昆虫ピンを使用し、嗅球の1つに1本のピンを使用します。次に、はさみを使用して、嗅球交連、脳保護剤交連、および背側正中線に沿って脳幹のOEXを切断します。交連とoexが切断されたら、A LRプレートを横方向に偏向させ、合計7つの昆虫ピン(嗅球に2つ、カットの端に2つ、脳保護剤交連)、拡張OEXに2つ、脊髄の正中線に1つ
。次に、RNAフリー試薬を使用して、調製物を4%パラホルムアルデヒドに室温で3時間、穏やかに攪拌しながら固定します。その後、脳は、脊髄、制御ニューロンの投射、動物および動物において同定された転写物中の新遺伝子の発現が記載された方法を用いて、in situの2つのハイブリダイゼーションによって分析することができる。ここに見られる病変後2週間は、代表的な無傷のコントロールです。
脊髄全離断後、新生受容体の発現に変化がみられた。2週間後、非対照のネオゲン受容体は、M1、I、I、2、I、4、またはMTHニューロンのような悪い再生器で優先的に発現しました。この技術の開発により、誘導受容体、コンドロイチン硫酸受容体、プロチオ、糖鎖、キャスト塩基の活性化など、すべて同じ脳内での発現を探求する道が開かれました。
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概要
本研究では、ヤツメウナギにおける完全脊髄切断および脳解剖の技術を実演します。脊髄損傷後の運動機能の回復と、特定の脊髄投射ニューロンの再生能について詳しく解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生生物学
- 損傷応答
背景
- ウミヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後でも運動機能を回復させることができる。
- 一部の脊髄投射ニューロンは、優れた再生能を示す。
- 損傷後の軸索誘導を理解することは、脊髄再生に関する知見を得るために極めて重要である。
- 本研究では、解析にin situハイブリダイゼーション技術を用いる。
研究の目的
- 脊髄損傷後の軸索誘導メカニズムを調査すること。
- 脊髄切断および脳解剖の技術を解説すること。
- 軸索誘導受容体の発現変化を分析すること。
使用した手法
- 第5鰓レベルでの完全な脊髄切断。
- 脳の摘出および解析のための固定。
- 脳サンプルのメタノールでの保存、またはin situハイブリダイゼーションへの即時使用。
- 脊髄へ投射する特定された巨大ニューロンを可視化するためのホールマウント標本作成。
主な結果
- 損傷後のヤツメウナギにおける運動能の回復を実証した。
- 脊髄投射ニューロン間における再生能力の差異を明らかにした。
- 再生中の椎体における軸索誘導受容体の発現変化を示した。
- 従来の切片法に対するホールマウント法の優位性を強調した。
結論
- 提示された手法は、脊髄再生に関する貴重な知見を提供します。
- ニューロン再生を理解することは、将来的な治療戦略に寄与します。
- ホールマウント標本作製により、神経接続の包括的な解析が可能になります。
よくある質問
産業上の重要性
このプロトコルは、脊髄損傷に対するニューロン固有の応答を研究するための疾患関連システムを提供することで、軸索再生ターゲットのメカニズム的なリスク低減を可能にします。ホールマウント標本法では、同定可能な大型の脊髄投射ニューロンを直接可視化してターゲットの検証を行うことができるため、再生能が高いニューロンと低いニューロンとの間で遺伝子発現の比較解析が容易になります。このアプローチは、脊椎動物の中枢神経系（CNS）モデルにおいて分子表現型と機能的な再生結果を関連付けることで、初期探索段階における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットのバリデーション
- 科学的価値： 機能的に異なるニューロン集団間で遺伝子発現プロファイルを比較することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 再生不全または再生成功に関与する特定のニューロンサブタイプを単離し、分析するための再現可能な手法を提供する。
- 戦略的価値： 再生能力に関連する分子シグネチャーを特定することで、標的の優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 損傷後の軸索誘導受容体の発現変化を定量的に評価するため、検証済みの生物学的システムを調製します。
- 運用上の価値： 中枢神経系（CNS）のホールマウント標本調製を標準化し、異なる実験条件下で一貫したin situハイブリダイゼーションの読み取りを可能にします。
- 戦略的価値： 単一のプラットフォームにおいて、誘導受容体、コンドロイチン硫酸受容体、および関連ターゲットのスケーラブルなスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： ヤツメウナギを用いて脊椎動物の中枢神経系（CNS）の損傷および再生ダイナミクスをモデル化し、疾患との関連性を立証する。
- 運用上の価値： 一貫したホールマウント標本作製により、基礎研究から前臨床検証に至るまで、トランスレーショナルな連続性を確保する。
- 戦略的価値： Axon guidance（軸索誘導）経路のメカニズム的なリスク低減を可能にし、リスク調整に基づいた開発推進の意思決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、パスウェイ調節戦略に寄与する分子的なリードアウトを提供することにより、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスへと統合されます。
- 探索生物学： 同定された再生ニューロンと非再生ニューロンにおける遺伝子発現を直接比較可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 軸索誘導受容体のマルチプレックスin situハイブリダイゼーションに対応した標準的な全量標本作製により、アッセイの即時導入を可能にします。
- 分析： 受容体発現変化の定量的な空間的読み取り値を生成し、分子レベルの変化と表現型としての再生結果を相関させることができます。
- トランスレーショナルリサーチ： 機能回復および近位軸索の再生を示す脊椎動物の中枢神経系（CNS）損傷モデルを通じて、前臨床研究への継続性を確保します。
- エンタープライズでの再利用： 同一のニューロンコンテキストにおいて、複数の誘導受容体ファミリー（例：Neogen、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン）を研究するための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経細胞レベルでの直接的な解析により、軸索再生経路におけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：下流の分子解析に向けた神経細胞の解剖および固定の標準化と再現性を向上させる。
- 戦略的価値：再生能力を有する神経細胞における標的結合の早期バイオマーカー的証拠を提供することで、Go/No-Go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済み神経細胞集団における発現動態に基づき、軸索誘導標的のリスク調整後の優先順位付けに寄与する。
実施上の検討事項
- ヤツメウナギ幼魚の脊髄切断および脳解剖のための微小外科手術技術の習熟が必要です。
- ホールマウント標本の作成および固定のため、実体顕微鏡、昆虫ピン、シリコン基材、およびRNaseフリー試薬へのアクセスが必要です。
- 組織の品質を一定に保つため、麻酔、回復、および固定プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 中枢神経系（CNS）の解剖学的構造やサイズの個体差があるため、発生段階や種をまたいでプロトコルを適用する際は調整上の検討事項があります。
- 回復および解剖に進む前に完全な切断を確認する必要があるため、受傷後24時間の治癒ウィンドウによる制約があります。
