その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコルその場で幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション
October 14th, 2014
ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。
この手順の全体的な目標は、損傷後の軸索誘導の研究のために、完全な脊髄、離断、および脳の解剖を行うことです。これは、最初に、5番目の鰓のレベルでランプレ脊髄を横断することによって達成されます。その後、脳を解剖し、シルガードに固定します。
脳を固定した後、メタノールに保存するか、またはすぐにin situハイブリダイゼーションに使用して、最終的に軸索の発現を変化させることができます。誘導受容体は、脊髄損傷後の再生する椎骨に見られます。今日ご紹介する技術は、従来のパラフィン切片やクライオスタット切片に比べて、脊髄に投射するニューロンを含む脳全体を見る
ことができ、その大きさが特定されている点です。その手順を実演しているのは、私たちの研究室の研究科学者であるキャシー・ザン博士です ミシガン湖の支流に供給する小川からペンシルベニア州のデラウェア川、またはメイン州の小川まで。種の野生型幼虫ウミランプレ。マルスのペットマイズが手に入りました。
4〜7歳の幼虫は体長が10〜14センチで、怪我や解剖に十分な大きさです。それらを52、100のグループで維持します。摂氏16度の50ガロンの淡水タンク。
タンクには、ヤツメウナギが借りることができるように、1インチの砂利基板が必要です タンクに追加されるすべての水は、タンクに追加される前に、少なくとも48時間木炭のろ過と曝気で調整する必要があります。動物が1年以内に使用された場合、この手順のために動物に餌を与える必要はありません。準備したばかりのリンガー溶液を用意します。
まず、ランプを飽和ベンゾカイン水溶液に移します。麻酔をかけたら、シルガードを半分入れた皿に移します。皿を氷の上に置き、皿に氷をのせます。
コールドリンガー。直径0.15の昆虫ピンを3本、鼻に1本、5本目の鰓に2本、動物を固定します。次に、手術のために実体顕微鏡の下に配置します。
まず、11番のメスを使用して、5番目のえらのレベルで背側正中線に沿って縦方向に切開します。これにより、この切開を行う際に脊髄が明らかになります。昆虫のピンから作られた2つのフックを使用して、カストロの露出番号8、はさみを使用して体壁を固定します。
露出した脊髄を垂直に切り込みます。脊髄の切断端を検査して、切断が完了していることを確認します。次に、鉗子を使用して、切り口を再調整し、傷を閉じます。
リンガー溶液に浸した濾紙にランプレ溶岩を移します。準備を氷のベッドに1時間移動して、1時間後に傷が乾くようにします。溶岩を氷冷水の小さなタンクに移します。
そこで24時間治癒させます。24時間後、離反に対する動きを確認します。動きがある場合、切断は不完全でした。
そうでない場合は、トランセクトは良好であり、動物が回復するまでの間、動物を室温のタンクに移動して回復させることができます。2〜3日ごとに水を交換してください。切除された動物が十分に回復したら、麻酔をかけ、前述のように解剖の準備
をします。脳を解剖するには、鼻孔と松果体器官の間の横切開から始めます。次に、カストロの子牛肉では、ハサミで脳の周囲の組織を切断し、動物を固定します。鉗子付き。
脳幹の両側にある白い楕円形の構造は耳嚢です。脳が露出したら、鉗子を使用して脈絡叢を取り除きます。次に、変更されたピンフックを使用して動物の頭を広げ、脳神経を露出させます。
次に、脊髄を鉗子で固定しながら、はさみで脊髄を横方向に切断します。脳神経を切開して脳を解剖します。次に、脳を小さなシリコン片に移し、そこに固定します。
脊髄に1本の昆虫ピンを使用し、嗅球の1つに1本のピンを使用します。次に、はさみを使用して、嗅球交連、脳保護剤交連、および背側正中線に沿って脳幹のOEXを切断します。交連とoexが切断されたら、A LRプレートを横方向に偏向させ、合計7つの昆虫ピン(嗅球に2つ、カットの端に2つ、脳保護剤交連)、拡張OEXに2つ、脊髄の正中線に1つ
。次に、RNAフリー試薬を使用して、調製物を4%パラホルムアルデヒドに室温で3時間、穏やかに攪拌しながら固定します。その後、脳は、脊髄、制御ニューロンの投射、動物および動物において同定された転写物中の新遺伝子の発現が記載された方法を用いて、in situの2つのハイブリダイゼーションによって分析することができる。ここに見られる病変後2週間は、代表的な無傷のコントロールです。
脊髄全離断後、新生受容体の発現に変化がみられた。2週間後、非対照のネオゲン受容体は、M1、I、I、2、I、4、またはMTHニューロンのような悪い再生器で優先的に発現しました。この技術の開発により、誘導受容体、コンドロイチン硫酸受容体、プロチオ、糖鎖、キャスト塩基の活性化など、すべて同じ脳内での発現を探求する道が開かれました。
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概要
この研究は、カワウソにおける完全な脊髄切断と脳の解剖の技術を示しています。脊髄損傷後の運動機能の回復と、特定の脊髄投射ニューロンの再生能力を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 再生生物学
- 損傷反応
背景
- カワウソは完全な脊髄損傷後に運動機能を回復させることができます。
- 一部の脊髄投射ニューロンは優れた再生特性を示します。
- 損傷後の軸索誘導の理解は、脊髄再生に関する洞察に重要です。
- この研究は分析にin situハイブリダイゼーション技術を利用しています。
研究目的
- 脊髄損傷後の軸索誘導メカニズムを調査すること。
- 脊髄切断と脳の解剖の技術を示すこと。
- 軸索誘導受容体の発現変化を分析すること。
使用した方法
- 第5鰓孔レベルでの完全な脊髄切断。
- 脳の解剖と分析のための固定。
- 脳サンプルのメタノールでの保存またはin situハイブリダイゼーションのための即時使用。
- 脊髄に投射する大型ニューロンを視覚化するための全層準備。
主な結果
- 損傷後のカワウソの運動機能回復を示しました。
- 脊髄投射ニューロン間の再生能力の違いを特定しました。
- 再生している脊椎における軸索誘導受容体の発現変化を示しました。
- 従来の切片法よりも全層技術の利点を強調しました。
結論
- 提示された技術は、脊髄再生に関する貴重な洞察を提供します。
- ニューロンの再生を理解することは、将来の治療戦略に情報を提供できます。
- 全層準備により、ニューロン接続の包括的な分析が可能になります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of axon regeneration targets by providing a disease-relevant system for studying intrinsic neuronal responses to spinal cord injury. The wholemount preparation supports target validation through direct visualization of large, identifiable spinal-projecting neurons, facilitating comparative gene expression analysis between good and bad regenerators. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to functional regeneration outcomes in a vertebrate CNS model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing gene expression profiles between functionally distinct neuron populations.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate and analyze specific neuronal subtypes implicated in regeneration failure or success.
- Strategic Value: Supports target prioritization by identifying molecular signatures associated with regenerative capacity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for quantitative assessment of axonal guidance receptor expression changes post-injury.
- Operational Value: Standardizes wholemount CNS preparation for consistent in situ hybridization readouts across experimental conditions.
- Strategic Value: Enables scalable screening of guidance receptors, chondroitin sulfate receptors, and related targets in a single platform.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease relevance by modeling vertebrate CNS injury and regeneration dynamics in sea lamprey.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via consistent wholemount preparation.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling mechanistic de-risking of axon guidance pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing molecular readouts that inform pathway modulation strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct comparison of gene expression in identified regenerating vs. non-regenerating neurons.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized wholemount preparation compatible with multiplex in situ hybridization for axonal guidance receptors.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts of receptor expression changes that allow teams to correlate molecular shifts with phenotypic regeneration outcomes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through a vertebrate CNS injury model that exhibits functional recovery and proximal axon regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying multiple guidance receptor families (e.g., Neogen, chondroitin sulfate, proteoglycans) in the same neuronal context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axon regeneration pathways through direct neuronal resolution.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neuronal dissection and fixation for downstream molecular analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biomarker evidence of target engagement in regeneration-competent neurons.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of axon guidance targets based on expression dynamics in validated neuronal populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for spinal cord transection and brain dissection in larval sea lamprey.
- Dependent on access to stereomicroscopy, insect pins, silicone substrates, and RNase-free reagents for wholemount preparation and fixation.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, recovery, and fixation protocols to ensure consistent tissue quality.
- Involves adaptation considerations when transferring protocols across developmental stages or species due to variations in CNS anatomy and size.
- Limited by the 24-hour post-injury healing window required to confirm complete transection before proceeding to recovery and dissection.
