Name: その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコルその場で幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ海ヤツメウナギの完全脊髄切断と脳解剖法。in situハイブリダイゼーションを用いて軸索誘導受容体の発現変化を解析し、神経再生メカニズムを解明する。ホールマウント法で大きな脊髄投射ニューロンを可視化できる。

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NIH助成金NS14837、R01 NS38537、R24 HD050838による支援を受けています。これは、マイケル・E・セルツァー博士によるものです。シュライナーズ研究助成金SHC-85220をマイケル・E・セルツァー博士に授与。シュライナーズ研究助成金SHC-85310をマイケル・I・シフマン博士に授与。 アントン・バレイロ・イグレシアス博士は、Fundación Barrié(スペイン)とXunta de Galicia(スペイン、ガリシア)の支援を受けました。

このプロトコルで使用されるすべての材料については、表1を参照してください。 実験は、テンプル大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1。動物<ol><li>野生型幼虫の海ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス L.）を取得し、10 -メイン州のデラウェア川（ペンシルベニア州）またはストリームへの支流から、ミシガン湖の供給流れから- （7歳4）長さが14センチ。 </li><li> 16℃で50ガロンの淡水タンク内の100の動物 - 研究室では、50のグループで幼虫を維持する。ライン砂利のインチでタンク幼虫が中に穴を掘るためにのために、水を炭濾過し、その中にヤツメウナギを置く前に、塩素や他の不純物を除去するために、少なくとも48時間、エアストーンで調整されている。使用する日まで、自らの残骸をリサイクル動物を供給する必要はありません。 </li></ol> 2コンプリート脊髄コー​​ド離断<ol><li>脊髄手術の前に以下の組成を有するヤツメウナギリンゲル液の準備：110のNaCl、2.1のKCl、2.6のCaCl 2、1.8mMのMgCl 2および10mMのトリス緩衝液を; pHは7.4。 </li><li>脊髄切断を行うために、小さな容器に幼虫を置き氷冷リンゲル液中の1％トリカインメタンスルホネートで麻酔する。 </li><li>麻酔された場所にペトリ皿の動物の半分シルガード（シリコーン）で満たし、一動物の鼻に配置される（手術のための位置に尾少なくとも一つを、動物を保持するために4昆虫ピン（0.15ミリメートルの直径）を使用して一度そして2つの5 番目の鰓のレベルで）。ほとんどリンゲル液でトップまでのペトリ皿を埋める。実体顕微鏡下で手術を行いながら、氷上で幼虫をシャーレを入れてください。 </li><li>脊髄離断に背を実行するには、正中線、5 番目のレベルで外科用メス（＃11）と長手方向に切開する脊髄を可視化する鰓。最初に皮膚を上に向けて外科用メスの刃の先端を挿入し、脊髄を上から見ることができるまで、筋肉組織が非常に緩やかに切断されることによって開放されている。ファッション2昆虫ピンからフックと脊髄離断を行いながら、身体の壁が開いて保持するためにそれらを使用しています。 </li><li>完全にハサミを使用して、5 番目の鰓（カストロ＃8）のレベルで脊髄を横断する、脊髄に垂直にはさみを挿入します。脊髄は完全に1きれいにカットを横切する必要があります。脊髄を完全に離断されたことを確認する実体顕微鏡下で脊髄切断端を可視。そして、一対の鉗子（＃5）を用いて、横切開後に脊髄の切断端を再調整。 </li><li>脊髄切断を行った後、微細ピンセットを背体壁に傷を閉じ、創傷tを可能にするために1時間氷上に幼虫を入れO乾燥させます。氷と幼虫の間のフィルタ·一枚の紙を入れて、ヤツメウナギのリンゲル液でそれを浸します。低温は、傷が空気乾燥することができますので、感染を予防するのに役立つと同時に、生きている動物を保持します。 </li><li>その後、24時間氷冷水小さな水槽（タンクあたり1幼虫）の幼虫を移す。 </li><li>行動的に損傷部位への移動、尾がないことを確認するために、脊髄離断後に病変幼虫1日を調べます。幼虫（5 番目の鰓のレベルで）損傷部位にのみ、その頭の吻側を動かすことができれば、脊髄離断が完了したと見なされる。この場合、幼虫は現在、室温で淡水と戦車（タンクあたり1幼虫）に転送することができます（23 それらは、選択された時点で回復することを可能にする°C）。 </li><li>回復期間中は2〜3日ごとに水の交換。 </li></ol> 3。脳解剖との調製in situハイブリダイゼーションのための脳<ol><li>損傷後の希望の時点で幼虫の海ヤツメウナギと場所を再度麻酔し、上記のように、脳の解剖を行うためにリンゲル溶液とペトリ皿で​​それらをピン。 </li><li>脳を解剖するには、最初の鼻孔および松果体臓器の間にメスで横切開を行います。ここからピンセットでそれを保持しながら、カストロのハサミを使用して、脳の周囲の組織を切断し始める。 </li><li>脳が露出された後、ピンセットを使って、脈絡叢を除去し、動物の頭部を広げ、脳神経を露出するためのフックを使用しています。その後、カストロのはさみで脊髄横断を切った。脳を切開する脳神経を切断するために鉗子の別のペアを使用しながら、ピンセットで脊髄を持ちます。 </li><li> 2プラグを挿入することで解剖した後、シリコンの小片に脳を入れて、位置に保持脊髄の嗅球と1電気ショック療法のピン。その後、はさみで背側正中線に沿って後方と脳のcerebrotectal交連をカットし、横方向に翼状プレートを偏向し、4昆虫ピン（ 図2）を有するシリコーンフラットそれらをピン。 </li><li>回転装置上で3時間室温温度に固定されるリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドを含むチューブに脳シリコーン片を移す。 </li><li>前述のように定着後のin situハイブリダイゼーションホールマウント用に脳を使用して（スウェインら 、1994）。コントロールまたは偽手術動物からの脳を負傷した動物からの脳と並行して、常に実行する必要があります。 wholemounted幼虫の脳は、そのフラットで薄型のin situハイブリダイゼーションにより研究し、また、脳はかなり半透明になりミエリン10の欠如に起因することができます。 </li></ol>

<ol><li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li>
<li>Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li>
<li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li>
<li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li>
<li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning%2C+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li>
<li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li>
<li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li>
<li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+myelin+sheaths%3A+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li>
<li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、幼虫の海のヤツメウナギで完全な脊髄離断および後脳の解剖を実行するために詳細なプロトコルを提示する。この手順では、in situハイブリダイゼーションホールマウント脳による脊髄損傷後のニューロンを投影する識別可能な脊髄の間の遺伝子発現の差を分析することができる。手順における重要なステップはstereomicrocope下、脊髄の切断端を観察することによって制御され、穏やかに一対の幼虫の鼻に触れることにより24時間後に確認することができる完全な脊髄切断の正確な性能である鉗子損傷部位への移動、尾がないかどうかを確認します。また、手術のために使用されるハサミは鈍ではない、動物の回復のための重要かつシングルとクリーンカットが完全に脊髄を横断するために行われていることである。 損傷後の動物の生存は非常なアニメーションを維持することによって改善され手術中の最初の24時間空気乾燥した後、氷冷水中に傷を可能にするために使用時間中に氷上でALS。この期間の後、創傷を閉じ、動物が既に室温で淡水をタンクに移すことができる。 動物のより大部分...

哺乳動物では、脊髄損傷（SCI）は、負傷した軸索がトラウマゾーンを通って再生し、それらの適切なターゲットに再接続していないため、損傷部位以下の機能の永久的な損失につながる壊滅的な条件である。哺乳類とは対照的に、ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復。1興味深いことに、ヤツメウナギは、それらの大きなサイズのホールマウント脳調製物において個別に識別可能なニューロンを投影する36脊髄のセットを持っている2,3（ 図1） 。これらの脊髄投射ニューロンのすべてが高レベルの完全な脊髄離断により軸索切断されている。私たちのグループとその他の以前の研究では、他の人は通常、損傷部位を通じて軸索を再生しながらでも、これらのニューロンのいくつかは非常に低い再生能力を示し、SCI後の機能回復の存在下で、（彼らは &quot;悪い再生器を」と考えられている）ことを示している（それらが考慮される「グラムOOD再生器」）。2,3この特性は、ヤツメウナギ面白い脊椎動物モデルは今度にしようとする神経細胞の本質的な再生能力の違いにつながる良い面と悪い蓄冷脊髄投射ニューロン間の遺伝子発現の違いを研究することができます同じ外因環境での軸索を再生。1 このモデルを用いて、私たちは、以前にそれぞれネトリンとRGMの阻害作用を媒介しUNC5 4,5及びネオゲニンなどの軸索ガイダンス分子レセプターの低い再生能力を示して発現とその脊髄投射ニューロン、6を示している。また、この方法を使用することによってわれわれのグループはまた、唯一の良い再生器は、損傷後、再生プロセス中にニューロフィラメントの発現の回復を示すことが示されている。最近では、ブッシュとモーガン7が悪い再生器がincreasを示すことが免疫蛍光によって示されている「悪い再生器「脊髄投射ニューロンはゆっくりと完全な脊髄離断5,7,8の後に死亡するという事実に著者によって関係している傷害後シヌクレインのエド式。だから、完全な脊髄損傷のヤツメウナギモデルは、脊髄に突出ニューロン軸索切断後に「悪い再生器 &quot;を作るかを理解するために非常に有用なモデルとして登場しました。 私たちの研究を実施するために、本 ​​発明者らは、in situハイブリダイゼーションホールマウントを実行するために、損傷した後、所望の時点で完全な脊髄離断手術プロトコルと後方脳の解剖を行っている。現在の方法論的な記事では、幼虫ヤツメウナギにおける完全な脊髄損傷の手術の適正なパフォーマンスのために詳細なプロトコルを提示し、動物のその後のメンテナンスやin situハイブリダイゼーションホールマウントのための最終的な脳の解剖と脳の準備。 PEに詳細なプロトコル幼虫ヤツメウナギの脳においてin situハイブリダイゼーションホールマウントをrformは、以前に報告されている。9はまた、脊髄損傷および脳の解剖のためのこのプロトコルは、その後、免疫組織化学または他の組織学的方法のために脳を処理するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>トリカインメタンスルホン酸</td><td>スペクトル</td><td>TR108</td><td>ベンゾカイン飽和溶液PBS犠牲メス用</td></tr>メス<tr><td>#3</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr>メス<tr><td>用ブレード:#11</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>カストロビエホハサミ #8</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 #4 & #5</td><td>デュモン、スイス</td><td>Roboz RS4955</td><td>#4 脊髄の解剖用; #5 menninges</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>シルガード</td><td>ダウ コーニング Co.</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン 0.15, 0.20 mm</td><td>Austerlitz</td><td>カタログなし #</td><td>0.15 mm 脳と脊髄のピン留め用; 0.20 mm 本体用 0.20 mm</td></tr><tr><td>7 ml HDPE シンチレーションチューブ キャップ付き</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16%</td><td>Electron Microscopy Science (EMS)</td><td>19210</td><td>PBS で 4% に希釈</td></tr></tbody></table>

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

完全な脊髄損傷後、最初は海のヤツメウナギは離断のレベル以下に麻痺している。しかし、これらは数週間後に歩行をリカバリし、これを脊髄固有の軸索および脳幹から脊髄に突出する軸索の短い距離再生（数mm）を伴う。 36大の識別可能脊髄投射ニューロンの中には、優れた再生器であり、他は悪い再生器である。これらのニューロンは、最も容易にホールマウントCNS調製物中で同定することができる。有利ニューロン固有のメカニズムを理解または脊椎動物CNSにおける損傷後の軸索再生を阻害するためには、良い、悪い再生器との間の遺伝子発現の相違を決定する方法、および発現は、脊髄切断によって影響される。本稿では、顕微鏡のビジョンの下で、完全な脊髄離断を生産、住宅幼虫のための技術と新鮮な水タンク内の最近変換された大人の海のヤツメウナギを示しており、BRの準備AINおよびin situハイブリダイゼーションのための脊髄wholemounts。簡単に述べると、動物を16に維持される&#160; C°、ヤツメウナギリンガーで1％ベンゾカインで麻酔し。脊髄は背側アプローチを介して、虹彩切除鋏で切開され、動物は23℃の真水タンクに回復させる。 in situハイブリダイゼーションのために、動物を再麻酔され、脳と脊髄は背側アプローチを介して除去。

この方法を使用するときに得られる結果は、識別可能な脊髄突出におけるネオゲニン転写物の発現を示すwholemounted脳の代表画像の一例として、制御のニューロンおよび2週間後の病変幼虫海ヤツメウナギは、 図2に示されている。読者は、完全な脊髄離断および完全な詳細については、海のヤツメウナギの神経細胞を投影する識別可能な脊髄の再生能力の後ネオゲニンの発現との関係を報告して、以前の研究6と呼ばれている。簡単に述べると、結果は、損傷後に識別脊髄投射ニューロンにおけるネオゲニン受容体の発現に変化があることを示している。二週間M1、I1、I2、I4、またはM番目のニューロン様ネオゲニン受容体を優先的に悪い再生器中で発現される完全な脊髄離断後（ 図2Bを参照）これらの結果は、結果を実証プロトコル及びネオゲニン受容体がこれらの細胞の再生の障害に関与し得ることを示唆している。 <img alt="図1" fo:content-widt...

ヤツメウナギは、完全な脊髄損傷後の運動を回復する。しかし、いくつかの脊髄投射ニューロンが良い再生器であり、そうでないものもあります。本稿では、完全な脊髄離断を生成し、in situハイブリダイゼーションのためのホールマウントの脳や脊髄の準備、住宅海ヤツメウナギの幼生（最近変換された大人）のための手法を例示する。

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

本手順の目的は、損傷後の軸索誘導を研究するために、脊髄の完全切断および脳の解剖を行うことです。まず、ヤツメウナギの脊髄を第5鰓のレベルで切断し、次に脳を解剖してSylgard上に固定することでこれを達成します。脳を固定した後、メタノールに保存するか、直ちにin situハイブリダイゼーションに使用します。最終的に、脊髄損傷後の再生脊椎において、軸索ガイダンス受容体の発現変化を確認することができます。今日実演する手法が、従来のパラフィン切片作成やクライオスタット切片作成よりも優れている点は、脊髄に投射する大きく同定可能なニューロンを含む、脳全体を観察できることです。手順を実演するのは、当研究室のリサーチサイエンティストであるKathy Zang博士です。ミシガン湖に流れ込む支流からペンシルベニア州のデラウェア川、あるいはメイン州の河川に至るまで、野生型の*Petromyzon marinus*の幼生が入手されました。4～7歳の幼虫は、全長10～14 cmであり、損傷処置および解剖を行うのに十分な大きさです。これらを50ガロンの淡水タンクに入れ、16 °Cで52～100匹のグループに分けて飼育します。ランプリーが穴を掘ることができるよう、水槽には1インチの砂利の底砂が必要です。水槽に加えるすべての水は、加える前に少なくとも48時間、活性炭ろ過とエアレーションによるコンディショニングを行う必要があります。動物を1年以内に使用する場合、本手順における給餌は不要です。新鮮に調製したリンゲル液を準備しておいてください。まず、lampeを飽和ベンゾカイン水溶液に移します。麻酔後、Silgardを満たしたディッシュに移します。ディッシュを氷上に置き、さらにディッシュの上部を氷で満たします。冷やしたリンガー液を用意します。動物の吻端に1本、第5鰓に2本の直径0.15の昆虫ピンを刺して固定します。その後、手術のために実体顕微鏡の下に配置します。まず、11番メスを用いて、第5鰓の高さの背側正中線に沿って縦切開を行います。この切開により脊髄が露出します。昆虫ピンで作製した2本のフックと、Castro reveal 8番鋏を使用して、体壁を固定します。露出した脊髄を垂直に切断します。脊髄の切断端を確認し、完全な横断が行われていることを確かめてください。その後、ピンセットを用いて切断端を再整合させ、創傷を閉鎖します。ヤツメウナギの幼魚を、リンガー液に浸したフィルターペーパー上に移します。創傷部位を乾燥させるため、氷上のベッドに1時間置いてください。1時間後、幼魚を氷冷水の入った小型タンクに個別に移します。そのまま24時間安静にして治癒させます。24時間後、切断部に対して脊髄方向（cordal）への動きがないか確認します。もし動きが見られる場合は、切断が不完全であったことを意味します。もし症状が見られない場合は、切断は適切に行われたと考えられ、動物を室温のタンクに移して回復させることができます。水換えは2〜3日ごとに行います。切断した動物が十分に回復したら、前述の手順に従って麻酔を施し、解剖の準備を行います。脳を解剖するには、まず鼻孔と松果体との間で横切開を行います。次に、ピンセットで動物を固定しながら、カストロ・ベール剪刀を用いて脳周囲の組織を切除します。脳幹の両側にある白い楕円形の構造が耳包です。脳を露出させた後、ピンセットを用いて脈絡叢を除去します。次に、改良型ピンフックを使用して動物の頭部を広げ、脳神経を露出させます。次に、ピンセットで脊髄を固定しながら、ハサミで脊髄を横方向に切断します。脳を取り出すために、脳神経を切断します。その後、脳を小さなシリコン片の上に移動させ、そこに固定します。昆虫ピンを1本脊髄に、もう1本を嗅球のいずれかに刺します。次にハサミを用いて、背側正中線に沿って嗅球前交連、大脳前交連、および脳幹の視蓋（oex）を切断します。交連と視蓋を切断した後、ALR板を外側に折り曲げ、計7本の昆虫ピン（嗅球に2本、切断した大脳前交連の端に2本、伸展した視蓋に2本、脊髄の正中線に1本）を使用して、シリコン上に平らに固定します。次にRNA分解酵素除去剤を用い、4%パラホルムアルデヒドで室温にて3時間、緩やかに攪拌しながら固定します。その後、記載された方法を用いてin situハイブリダイゼーションにより脳を解析できます。neogenの転写産物の発現が、対照動物および病変後2週間の動物の脊髄および投射ニューロンで確認されました。ここに、代表的な非損傷対照を示します。脊髄の完全切断後、neogen受容体の発現に変化が見られました。2週間後、非コントロール群におけるneogen受容体は、M1 I one I two I fourやMTHニューロンなどの再生不良個体において優先的に発現していました。本手法の開発により、ガイダンス受容体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの受容体、およびcast baseの活性化についての発現を、すべて同一の脳内で探索することが可能となりました。

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Neuroscience

神経科学

このビデオは、走査型電子顕微鏡(SEM)と透過型電子顕微鏡(TEM)の両方の要素を組み合わせて高解像度の画像を生成する技術である大規模な走査型透過型電子顕微鏡(STEM)を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の脳損傷を調査する方法を示しています。サンプルの準備と、脳損傷を特定するための高解像度STEM画像の取得に必要な手順を概説しています。...

大規模走査型透過電子顕微鏡によるゼブラフィッシュ幼生脳損傷の検討

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。...

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

シナプス前放出面膜でのCa2+電流の記録は、Ca2+の侵入と神経伝達物質の放出を正確に理解するための鍵となります。ヤツメウナギの脊髄の急性解離を示し、機能的な孤立した細網脊髄軸索を生成し、個々のシナプス前末端の放出面膜から直接記録できるようにします。...

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

脱髄疾患は、リゾレシチンを中枢神経系に局所的に適用することで、動物でモデル化することができます。マウスの脊髄にリゾレシチンを1回注射すると、時間の経過とともに自然に修復する病変が生じます。目標は、脱髄および再髄鞘形成に関与する因子を研究し、修復を強化するための薬剤をテストすることです。...

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

大規模2次元電子顕微鏡法(EM)、またはナノトミーは、ナノスケール分解能のEMの組織全体への応用です。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生の脳を健康に、および非侵襲的な脳損傷時に調査するために適用されるナノトミーの普遍的な方法について説明します。...

健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

私たちは、成人ゼブラフィッシュのマルマルー重量降下モデルを変更し、鈍力外傷性脳損傷(TBI)とその後の神経再生の基礎となるメカニズムに続く幅広い病理を調べた。この鈍力TBIモデルはスケーラブルであり、軽度、中等度、または重度のTBIを誘導し、ヒトTBIで観察された傷害の不均一性を再現する。...

成虫ゼブラフィッシュにおける鈍力損傷の影響を研究するスケーラブルモデル

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

アフリカツメガエル・ラエビス・...

アフリカツメガエル・ ラエビス ・オタマジャクシの脊髄切除

学ぶ海ヤツメウナギの完全脊髄切断と脳解剖法。in situハイブリダイゼーションを用いて軸索誘導受容体の発現変化を解析し、神経再生メカニズムを解明する。ホールマウント法で大きな脊髄投射ニューロンを可視化できる。

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル

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