マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成
2014年2月21日
液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。
この手順の全体的な目標は、膜、unla、モル濃度、モノ分散性、および内部内容物に対する制御を強化したリン脂質二重層小胞を生成することです。CADを使用して、アクリルシートと天然ゴムからチャンバーを製造。懸濁脂質二重層は、チャンバーに脂質と溶液を充填することによって生成されます。
次に、封入する溶液を含んだインクジェットを噴射装置にセットする。適切な設定が確立されると、ジェットされた流体パルスは脂質二重層小胞を生成します。最終的に、マイクロ流体ジェットは、再現性のあるモノ分散二重層ベシクルを生成します。
電気形成、エマルジョン、液滴生成などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、膜、片側モル濃度、モノ分散性、および内部内容物を制御する制御レベルの増加です。手順を実演するのは、研究室の大学院生であるヨハンナ・ハロウであり、CADソフトウェアを使用して学部生のカラ・パテルが支援し、レーザーカッターの最初のドリルを使用してアクリルから作ることができるチャンバーの形状を描きます組み立てられたアクリルチャンバーの両側に1つの16インチの貫通穴。それは無限大の形をした井戸に排水されます。
次に、0.2ミリメートルのアクリルシートからハサミで小さな長方形を切り取り、無限大の底として機能します。速乾性接着剤でこれを所定の位置にしっかりと固定し、表示領域に接着剤がつかないように注意してください。アクリルシートはチャンバーの壁にフラッシュし、チャンバーの底に固定する必要があります。
第三に、速乾性接着剤を使用して、ドリルで開けた穴に薄い天然ゴムシートを接着します。ピンセットで所定の位置に押し込みます。接着されたすべての縫い目に漏れがないかテストします。
何もないはずです。最後に、23ゲージの針を使用して、ドリルで開けた穴からゴムに穴を開けると、圧電インクジェットチップがこれらの穴に挿入されます。ストックリン脂質はクロロホルムに溶解し、マイナス20°Cで保存する必要があります。
D-P-H-P-C または DOPC。このデモンストレーションでは脂質が使用されています。クロロホルムに溶解した脂質をガラスバイアルに斜めに保持しながらガラスバイアルに移し、アルゴンまたは窒素ガス下で脂質を穏やかに乾燥させます。
次に、バイアルのキャップを少し緩めた状態で真空下で1〜2時間置き、残留溶媒を取り除きます。このステップには、乾燥剤も使用できます。次に、エンドデッキで脂質を可溶化して、最終的な脂質濃度を25ミリグラム/ミリリットルにします。
解決策をボルテックスします。キャップをパラメータで短時間密封し、15分間超音波処理します。この溶液は摂氏マイナス20度で保管してください。
次に、生理学的に浸透圧のようなスクロース原液を調製します。これがジェッティングソリューションです。コントラストや蛍光を加えるために、溶液にダークフードメディーズまたは蛍光ビーズを一滴加えることを検討してください。
ショ糖溶液を1ミリリットルの注射器に入れて、閉じ込められた空気を取り除きます。シリンジをフリックすると、気泡がルアーの開口部に上昇し、排出できるようになります。次に、シリンジに33mm0.22ミクロンのフィルターを取り付け、フィルターを通して1滴を押し出します。
次に、インクジェットのメスルアーアダプターを緩め、フィルターの端に押し付けます。閉じ込められた空気を取り除くために、液体を押し出します。最後に、シリンジをインクジェット液の上部に取り付けます。
シリンジが正しく取り付けられている場合は、インクジェットチップに移動する必要があります。まず、シリンジアセンブリを顕微鏡ステージに取り付け、この実験のためにインクジェットコントローラーを配線します。ステージとシリンジは独立した制御が必要であり、ステージとシリンジの両方が3次元で移動して視覚化されます。
毎秒 1000 フレーム以上の高速カメラをセットアップします。画像ベースの自動トリガーを使用して録音を開始するように設定します。次に、チャンバーをテープでステージに固定し、インクジェットチップをチャンバーの側面にあるゴムシートに開けられた穴に慎重に合わせます。
まずは目視で調整し、その後、顕微鏡で微調整を行います。位置合わせが完了したら、シリンジを1つの次元に沿って戻し、無限大の形をロードします。次に、プランジャーに穏やかな圧力をかけると、ノズルに液滴が形成されます。
これにより、初期背圧が発生します。噴射パラメータを設定する必要があります。次に、台形バイポーラ波の特定の値が、画面の印加電圧とトリガー制御小胞サイズあたりのジェットパルス数に表示されます。
今度は無限大の形の全表面をカバーする脂質解決の25から30マイクロリットルを部屋に荷を積む。その後、それぞれに、25マイクロリットルのグルコース溶液を最も外側のエッジにゆっくりと滑らかにピペッティングして加え、グルコースが脂質溶液に混ざらないようにする必要があります。10分以内に、チャンバの中央に脂質二重層が形成されます。
二重層は不安定で、準備によっては壊れる可能性があるため、二重層のセットアップは最も重要なステップです。我慢してください。チャンバーを数回充填する練習をすると、うまくいきます。
次に、インクジェットチップが液滴界面から200ミクロン以内にあるときに、インクジェットチップをチャンバーに慎重に挿入します。バイレイヤー、ジェッティングプロセスを開始し、インクジェットを使用してデータを記録し、ベシクル生成プロセスに関する洞察を提供します。例えば、インクジェットノズルと脂質二重膜の間の距離を変えると、膜を変形させる力に影響を与えます。閉める。
二重層に近接しているため、ジェット気流が集中し、膜が小胞生成点からエネルギーを分散させるのを防ぎました。また、渦の移動は、pizo電動アクチュエータに印加される電圧とともに増加しました。小胞の形成は、その形成に続く一連のイベントとして視覚化されました。
小胞の安定性は小胞の直径によって変化する傾向があり、小胞が小さいほど安定していました。このビデオを見れば、マイクロ流体ジェッティングを使用して脂質違反者ベシクルを生成する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、マイクロ流体ジェット法を用いて、液滴界面リピッド二重層に対してリン脂質二重層ベシクルを生成する方法について説明します。この技術により、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の組み込み、材料のカプセル化を精密に制御することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- バイオテクノロジー
背景
- リン脂質二重層ベシクルは、局所化された生体分子の研究に不可欠です。
- マイクロ流体技術により、ベシクル形成の再現性と制御が向上します。
- 膜の特性を理解することは、様々な生物学的応用にとって重要です。
- ジェット技術は、ベシクル生成プロセスを効率化できます。
研究目的
- 膜の特性を制御したベシクルを生成すること。
- 特定のタンパク質を二重層に組み込みやすくすること。
- 研究目的のための様々な材料のカプセル化を可能にすること。
使用された方法
- アクリル板と天然ゴムからチャンバーを製造すること。
- チャンバーにリピッドと溶液をロードして、浮遊リピッド二重層を生成すること。
- 溶液をカプセル化するためのインクジェット装置をセットアップすること。
- ベシクルを作成するためのジェット液体パルスの適切な設定を確立すること。
主な結果
- マイクロ流体ジェットは、繰り返し可能で一様な二重層ベシクルを生成します。
- この方法により、ベシクルの特性を精密に制御できます。
- 材料のカプセル化が効果的に達成されます。
- 様々な生物学的研究に適したベシクルを作成できます。
結論
- マイクロ流体ジェットは、ベシクル生成の信頼できる技術です。
- 膜の非対称性とタンパク質の組み込みの制御が向上します。
- この方法は、局所化された生体分子の研究に重要な意味を持ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
