子宮摘出標本から初代ヒト子宮内膜間質細胞の確立するための2つの方法

この手順の全体的な目標は、切除された子宮摘出術から初代子宮内膜間質細胞培養を確立することです。これは、最初に子宮層を区別して分離し、子宮内膜組織の一部を分離することによって達成されます。2番目のステップは、スクレイピング法を利用する際に、スクレイピング法とトライイン法の間で細胞分離技術を選択することです。

機械的な力と掻き取りは、子宮内膜間質細胞を分離および解離するために使用されます。あるいは、トリプシン法を利用する場合、トリプシンの酵素活性を使用して子宮内膜間質細胞を分離し、解離させます。最終的には、顕微鏡法を使用して細胞の成長と形態を観察し、原稿で説明した他の手法を使用して子宮内膜間質培養物を確認します。

この方法は、生殖周期や月経などの生殖野現象における主要な生理学の質問に答えるのに役立ちます この原稿で使用されている子宮摘出術標本は、大学のIRB承認の倫理プロトコル(番号:I-R-B-H-S-R、番号:1、4、4、2、4)に従って収集されました。患者由来の組織を、高グルコースのRPMIまたはDMEMを含む50ミリリットルのチューブに摂氏4度で保持し、サンプルが処理される前の24時間以内に保ちます。開始する準備ができたら、組織サンプルを1つのXPBSで3回洗浄し、各洗浄の間に溶液を廃棄します。

次に、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した4〜10ミリリットルの成長培地を組織サンプルに加えます。また、真菌ゾーンを最終濃度0.25マイクログラム/ミリリットルまで追加し、30分間インキュベートします。次に、増殖培地を廃棄し、1つのXPBSで組織を2回洗浄します。

組織を6cmの細胞培養プレートに置き、これらの画像をガイドとして使用して子宮内膜層を特定します。次に、子宮内膜を分離し、組織の他の層を将来の使用のために保存します。メスまたはカミソリの刃を使用して、細胞培養皿に引っ掻きながら組織を小片に切り裂きます。

引っかき傷は、出現する一次子宮内膜間質細胞の付着を促進します。次に、傷のついた皿に2ミリリットルの成長培地をそっと加えます。この段階では、組織の断片が見え、引っ掻く動きから固定されます。

コンタミネーションを避けるために、他の細胞株とは別の指定の細胞培養インキュベーターにディッシュを置きます。光学顕微鏡を使用して細胞を毎日監視します。スライスした組織から2日目または3日ごとに出現する細胞の小さな集団を探します。

1つのXPBSで古い培地を静かに取り除き、培養液を洗浄し、次に2ミリリットルの新鮮な成長培地を加えます。4ミリリットルの成長培地を追加し始めます。洗浄ステップ中に増殖速度が増加したら、残りの組織片を吸引します。

新しいコロニーが組織から出現する可能性は低いです。成長継代の1週間後、細胞は0.05%トリプシンを使用します。細胞が75〜80%coの流暢さに達したら、細胞の1つのプレートを凍結します。

2枚または3枚のプレートが維持されると、初代細胞を無期限に継代することはできません。tripsin媒介分離を開始するには、0.25%トリプシンの2ミリリットルとミリリットルあたり0.03ミリグラムを補給した円錐形のチューブに子宮内膜組織の小片を置きます。その後、マイシンは、37°Cの回転プラットフォーム上で組織を30分間インキュベートできます。

次に、組織を短時間ボルテックスし、次にGの200〜400倍で2分間遠心分離し、上清を捨てて新鮮なトリプシンを加えます。そして、マイシンは、回転しながら組織を摂氏37度で1時間インキュベートできます。インキュベーション後、組織を5〜10秒間ボルテックスします。

次に、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む2ミリリットルの成長培地を追加します。トリプシンを不活性化するには、細胞をGの200〜400倍で2〜3分間遠心分離します。その後、上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁します。

2ミリリットルの増殖培地に細胞懸濁液を6cmの細胞培養皿にプレートし、プレートをこすり落とすと初代細胞の付着が促進されます。光学顕微鏡で細胞増殖を毎日モニタリングし、増殖培地を2〜3日ごとに交換します。細胞が75〜80%の同時流暢さに達したら、0.05%または0.25%トリプシンを使用してそれらを継代し、子宮内膜間質細胞を分離します。

スクレイピング法を使用すると、早期に出現する細胞のクラスターが生成されます。メスによって誘発された引っかき傷に沿って、子宮内膜間質細胞はそれらの線維芽細胞の形態によって識別できます。トリプシン法は掻き取り法よりも調製時間が長くなりますが、生細胞はより早く観察されます。

tryin法では、クラスター化された成長パターンと分散した成長パターンの両方を持つ細胞も生成されます。子宮内膜間質細胞の組織特異的マーカーはまだ発見されていません。子宮内膜間質細胞を同定する方法の1つは、マーカーの損失を測定することです。

サイトケラチンなどの上皮細胞用。サイトケラチンの欠如は、子宮内膜上皮細胞の不在を示しています。継代5で観察されたサイトケラチン染色の喪失は、継代2と比較して、上皮細胞の不在を裏付けています。

子宮内膜間質細胞の存在に関する機能的証拠は、脱細胞化アッセイを用いて提供することができる。CAMPおよびヒドロキシプロゲステロンアセテートによる治療に応答したプロラクチンおよびインスリン様成長因子結合タンパク質1の増加は、子宮内膜間質培養の確立が成功したことを示しています。このビデオを見れば、切除された子宮摘出術から初代子宮内膜間質細胞培養を確立する方法について十分に理解できるはずです。