蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

次の実験の全体的な目標は、オーファンGタンパク質共役受容体またはG PCRの機能活性化リガンドを同定することです。これは、細胞発現系において、目的のA-G-P-C-Rを一過性にトランセクトし、細胞発現系で無差別なGα16コンストラクトをトランセクトして、両タンパク質の一時的な異種発現を得ることによって達成される。第2のステップとして、トランスフェクションされた細胞にカルシウム感受性色素インフルエンザoh fourをロードし、カルシウム相互作用による蛍光シグナルの増加を通じて細胞内貯蔵からのカルシウムの放出を検出します。

次に、蛍光ベースのカルシウム動員アッセイは、候補リガンドの化合物ライブラリーを用いて異種発現受容体に挑戦することにより、受容体を活性化し、細胞内シグナル伝達カスケードを誘発して小胞体からのカルシウムの放出をもたらす化合物を決定し、これを蛍光シグナルとして測定することができます。活性化リガンドの最大有効濃度の半分の濃度応答曲線を示す結果が得られ、これは、細胞発現系に投与されたリガンド濃度に応じて異なる蛍光シグナルの検出に基づいています。安定なクローン細胞株を使用するよりも、GPCRの一時的な発現を得るために一過性トランスフェクションを行う主な利点は、そのような安定的にトランスフェクションされた細胞株の確立に時間がかかる必要がないことです。

無差別なG α 16サブユニットのトランスフェクションは、ほとんどのGPCRの細胞内シグナル伝達経路を、内因性設定における天然のシグナル伝達経路に関係なく、カルシウムの放出に向けてリダイレクトすることができます。このように、このセットアップは、短時間で目的のGPCR上の数百の化合物のミディアムスループットスクリーニングを可能にし、手順がイエローガスであることを実証し、博士課程の学生と私たちの研究室の技術者であるNick Suは、実際のカルシウム動員アッセイが行われる3日前にT 75フラスコでHEK 2 93 T細胞を成長させます。 80%の合流点に達したときに細胞を継ぎます。受容体コンストラクトによるトランスフェクション用のT 75フラスコを1つ、ネガティブコントロールとして空の発現ベクターを使用したトランスフェクション用のフラスコを1つ準備します。

ここに示すように、細胞培養物が50〜70%のコンフルエントに近づくまで、5%CO2加湿インキュベーターでフラスコを摂氏37度で20〜24時間インキュベートします。次に、3.9マイクログラムの受容体コンストラクトまたはエンプティベクターと3.9マイクログラムのGα16発現コンストラクトを1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに加える。ジェットプライムバッファーを500マイクロリットル追加します。

チューブをボルテックスした後、短いスピンでよく混ぜます。その後、37.5マイクロリットルのジェットプライム試薬ボルテックスを加え、最高速度で1分間スピンダウンします。トランスフェクションミックスを10分間インキュベートします。

室温で、細胞の1つの集団を発現ベクターでトランスフェクトしたものとして標識し、目的のGPCRとG alpha 16コンストラクトをコードし、2番目のフラスコを空のベクターとG alpha 16コンストラクトでコードします。インキュベーション後、トランスフェクションミックスを細胞培養培地に滴下し、培地に直接ピペットで移漬し、培養フラスコの壁との接触を避けるようにします。フラスコを摂氏37度で5%CO2加湿インキュベーターで20〜24時間インキュベートし、カルシウム動員アッセイを行います。

トランスフェクションされた細胞を収集し、96に播種します。よく黒い壁の透明な底板。まず、室温のウェルあたり60マイクロリットルでプレートをコーティングします。

フィブロネクチンを含むリン酸緩衝生理食塩水。蓋をした状態でプレートを室温で1時間インキュベートします。溶液をウェルから取り出し、室温で蓋をせずにプレートを再度1時間インキュベー

その間、細胞から古い増殖培地を取り除きます。死んだ細胞を3ミリリットルのPBSで洗い流し、PBSを取り除きます。次に、溶液を除去する前に、EDTAで1分間インキュベートする室温PBSトライイン3ミリリットルを追加します。

この時点で、細胞の形態は星形から球形に変わります。フラスコの底から細胞を軽くたたいてほぐし、室温10ミリリットルで数回すすいで細胞を集めます。DM em転送媒体。

細胞を50ミリリットルのファルコンチューブに移します。ミリリットルあたりの細胞数をカウントするには、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに100マイクロリットルの細胞培養物を追加します。次に、100マイクロリットルの溶解バッファーを加え、チューブを軽くたたいて混合します。

最後に、100マイクロリットルの安定化バッファーを加え、タッピングして混合します。核カセットに細胞懸濁液を充填し、カウンターで細胞をカウントします。nucleo viewソフトウェアは、細胞が3倍に希釈されたため、細胞の数を自動的に3倍にします。

溶解および安定化緩衝液を添加するときは、細胞を最終濃度600,000細胞/ミリリットルに希釈し、コーティングされたプレートにウェルあたり150マイクロリットルの細胞を播種します。ウェルあたり約90, 000個の細胞密度を得るには、気泡を避け、プレートを軽くたたいて細胞を均等に広げます。連続した細胞層を得るためには、プレートを摂氏37度で5%CO2加湿インキュベーターで16〜24時間インキュベー

細胞から培地を廃棄します。ウェルあたり200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、PBSを除去します。細胞を使用した操作を含む以下のすべての手順は、この時点から細胞にフルオロ4がロードされるため、暗闇で実行する必要があります。

ウェルあたり55マイクロリットルのローディングバッファーを追加し、プレートが光にさらされるのを防ぐためにプレートをアルミホイルで包み、室温で1時間インキュベートします。次に、洗浄バッファーを使用して、シリコン処理された1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで乾燥したペプチドを可溶化します。濃度レスポンス解析を実行し、リガンドのEC 50値を決定するための希釈系列を調製します。

アッセイ中に、化合物プレートからの50マイクロリットルのリガンドが細胞プレート上に100マイクロリットルの洗浄バッファーを充填したウェルに移されることに注意してくださいので、化合物を所望の最終濃度の3倍で調製してください。次に、70マイクロリットルのリガンドをコンパウンドプレートの対応するウェルにトリプリケートで追加します。各プレートにポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めます。

セルプレートからローディングバッファーを廃棄し、各ウェルに100マイクロリットルの洗浄バッファーを加えて光にさらさないようにします。プレートを室温で15分間インキュベートします。細胞プレートから洗浄バッファーを廃棄し、それぞれに100マイクロリットルの新しい洗浄バッファーを追加します。

セルプレート、コンパウンドプレート、チップラックを15分間十分にインキュベートします。摂氏37度で、ソフトウェアを使用して目的のプロトコルファイルを作成してロードし、ここで読み取りチャンバーの温度制御ユニットをアクティブにします。カルシウム応答は、摂氏37度で2分間、一度に1列ずつ測定され、525ナノメートルで連続する読み取り間隔は1.52秒間隔です。

インフルエンザOHの励起を488ナノメートルに設定し、総量50マイクロリットルの化合物を細胞プレートに移します。読み取りの18秒後。分注速度を毎秒26マイクロリットル、ピペットの高さを135マイクロリットルに設定して開始します。

コンパウンドとセルプレート、およびチップラックをステーションデバイスの適切な引き出しに配置します。エンドポイントモードで同じ励起波長と発光波長でセルプレートを1回読み取りてから、フレックスモードで実際のスクリーニングを開始します。アッセイを開始し、図のソフトウェアを使用してデータの解析に進みます。

これは、doofus short NPF 1 concentration シリーズの 3 つのレプリカのうちの 1 つに対応するグラフです。ネガティブコントロールは蛍光シグナルを誘導しなかった。一方、ポジティブコントロールは、内因性プロテアーゼ活性化受容体1の強力な活性化を誘発し、高い蛍光シグナルをもたらしました。

このソフトウェアでは、活性化の割合や、とりわけさまざまな濃度の標準誤差を決定するための式を入力することができます。得られたデータは、4 つの食道短 NPF ペプチドに示されているように、EC 50 値を推定するための予備的な濃度応答曲線を作成するために使用されます。曲線には、空のベクターをトランスフェクションした細胞でショウジョウバエの短いNPFペプチドの濃度シリーズを試験したネガティブコントロールのデータも含まれています。

この結果は、これらの細胞へのペプチドの添加は内因性受容体に影響を及ぼさず、実際に目的の受容体を活性化することを示しています。蛍光ベースのカルシウム動員アッセイの予備的な濃度応答曲線を実施し、試験した濃度を曲線のダイナミックレンジをカバーするように適合させました。ショウジョウバエの短いnpf 1、2、3、および4のEC50値は類似しており、この手順に従って受容体を活性化するために等しく強力であることを示しています。

構造活性、関係性研究などの他の方法を実行して、ペプチドのどのアミノ酸が受容体の活性化に重要であるかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、Gタンパク質共役受容体の機能活性化リガンドを同定するために、フルーラーセンスに基づくカルシウム動員を行う方法について十分に理解できるはずです。これには、太陽発現系の維持とそれに続く、目的の受容体による細胞系のトランスジェンダートランスフェクションが含まれます。

硬質カルシウム動員アッセイの後、アッセイを行うことができます。