繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

このプロトコルは、エレクトロスピニングとマイクロスフェアを組み合わせて、ニューロンを指向するための組織工学的な足場を開発します。神経成長因子をPLGAマイクロスフェア内にカプセル化し、ヒアルロン酸(HA)繊維状足場にエレクトロスピニングしました。 タンパク質の生理活性は、初代ヒヨコの背根神経節を足場に播種し、4〜6日間培養することによって試験されました。

この手順の全体的な目標は、神経の成長と修復をサポートするための多面的な環境を作り出すことです。これは、まず成長因子を分解性ミクロスフェア内にカプセル化することによって達成されます。2番目のステップは、環境の大部分のサポート材料を準備することです。

次に、ミクロスフェアと支持材料を組み合わせ、エレクトロスピニングして整列した繊維状の足場にします。最後のステップは、ひよこ後根神経節ニューロンで足場をテストすることです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を使用して、神経突起の成長と方向が対照と比較して加速されることを示します。

このシステムは、使用するタンパク質や材料にわずかな変更を加えた神経組織用に設計されていますが、心臓、肺、骨など、さまざまな種類の組織にも適用できます。この手順を開始する前に、必要な試薬、脱イオン水中のポリビニルアルコールまたはPVAの容量あたり2%および0.5%重量の溶液、体積あたり2%の溶液、イソプロピルアルコールと脱イオン水、および目的の親水性タンパク質の水溶液を準備します。場所。50ミリリットルの遠心分離管に0.5%PVA溶液の40ミリリットルを取っておき、65から35ポリ乳酸coグリコール酸またはPLGAの300ミリグラムを溶解した小さなバイアルに取っておいた、ジクロロメタンの3ミリリットル。

ボルテックスミキサーを使用して、200マイクロリットルのタンパク質溶液と4マイクロリットルの2%PVA溶液を組み合わせたPLGA溶解を加速できます。タンパク質PVA混合物をPLGA溶液に注ぎます。解決策は、ほとんど別々のままです。

バイアルを氷水のビーカーに約10ワットのWターを使用して入れ、均一なクリーミーな白いエマルジョンが作成されるまで溶液を5〜10秒間攪拌します。エマルジョンを0.5%PVAを含む予め調製した50ミリリットルのチューブに注ぎます。溶液をボルテックスミキサーで約20秒間高速で混合します。

解決策は曇った外観になります。エマルジョンを200ミリリットルのビーカーに移し、350RPMの攪拌板に2分間置きます。攪拌板のビーカーに50ミリリットルの2%イソプロピルアルコールを加えます。

混合物を最低1時間攪拌し続けて、クロロメタンを蒸発させ、PLGAを硬化させます。次に、ミクロスフェア溶液を遠心チューブに移し、Gの425倍で3分間遠心分離します。マイクロスフィアはチューブの底に集まり、白く見えますマイクロスフィアの上のチューブから上清を慎重に取り除き、500ミリリットルのボトルに保管します。

各チューブを4分の3まで満たし、それを振って液体中のマイクロスフィアを再分配することにより、マイクロスフィアを脱イオン水ですすいでください。遠心分離による上清の除去と、最終すすぎ後、脱イオン水によるマイクロスフェアのすすぎを4回繰り返します。上清を取り除き、他のサンプルと一緒に500ミリリットルのボトルに入れます。

遠心分離管に集めたミクロスフェアをマイナス20°Cで一晩凍結し、その後少なくとも24時間凍結乾燥します。次のエレクトロスピニング溶液は、脱イオン水、容量あたり2%の重量、メス関連のヒアルロン酸またはミハで事前に調製する必要があります容量あたり3%の重量、900キロダルトンのポリエチレンオキシドまたはPEO、および容量あたり0.05%の重量。フォトイニシエーターソリューション。

所望の量のエレクトロスピニング溶液を調製した後、ミリリットルあたり400ミリグラムまでの所望の濃度でミクロスフェアを添加する。ミクロスフェアが溶液中に均一に分布するまで、ボルテックスミキサーで溶液を混合します。溶液をシリンジに移し、6インチの18ゲージの鈍い先端針を取り付けます。

シリンジをシリンジポンプに入れ、1時間あたり1.2ミリリットルで分注するように設定します。マンドレルにアルミホイルの層をテープで留めます。これにより、完成した足場の清掃と保管が容易になります。

回転するマンドレルを使用して、整列したファイバーを作成します。高電圧電源からのアース線を収集装置に接続します。プラスのリード線を針に接続して、エレクトロスピニングを成功させます。

すべての接続と設定が正しいことを確認することが非常に重要です。ポリマーポンピングを開始し、溶液がシリンジの端に見えるようになったら、電圧源をオンにして電圧を24キロボルトに設定します。目的の足場の厚さに達するまで、溶液を実行します。

完了したら、電圧源とシリンジポンプをオフにしてください。この手順を開始するには、エレクトロスピニングの前に、取り外し可能な両面テープを使用して、関連するカバースリップをエレクトロスピナーの収集エリアに取り付けます。カバーに回転させると、エレクトロスピニング後の取り扱いと表示が容易になります。

前のビデオセグメントで示したように、マンドレルからカバースリップを慎重に取り外します。足場でコーティングされたカバースリップを透明な窒素チャンバーに入れ、すべての酸素がパージされていることを確認します。チャンバーと足場を10ミリワット四方センチメートル、365ナノメートルの光の下に15分間置きます。

架橋後、カバーを適切なサイズのウェルプレートに滑り込ませます。スキャフォールドの面が上を向いていることを確認します。ウェルプレートの各足場に100〜200マイクロリットルの培地を置きます。慎重に。

メディア液滴の各足場に1つの後根神経節またはDRGを配置します。厚いスキャフォールドの場合、より多くのメディアが必要になる場合があります。DRGは、浮かんでいない状態で完全に水没している必要があります。

スキャフォールドとDRGを摂氏37度で4時間インキュベートし、細胞がスキャフォールドに付着することを確認します。次に、ウェルに適したレベルまでメディアを充填します。プレートをインキュベーターに戻し、インキュベーション期間後4〜6日間インキュベートします。

各ウェルからメディアを慎重に取り出し、PBSで一度やさしく洗います。体積あたり4%の重量を使用して細胞を30分間固定します。パラホルムアルデヒドは、その後、確立されたプロトコルに従って、細胞のニューロフィラメントと核を染色します。

蛍光顕微鏡を使用して細胞を可視化するには、ウェルプレートを顕微鏡のステージに置き、フィルターとdpiの励起設定を使用して細胞塊を特定します。セルが特定されたら、フィルターを zi に切り替えます。伸長した神経突起を視覚化するには、顕微鏡のステッチ機能を使用して、全体の構造を見るために必要な数の画像を収集して組み合わせます。

このプロトコルでは、直径50±14マイクロメートル、85%以上のタンパク質カプセル化が一貫して製造され、エレクトロが足場に紡糸されています。この蛍光画像は、PLGAシェルにロッドドミンがあり、その中にBSAフィットがカプセル化された代表的なミクロスフェアを示しています。

カプセル化を評価するために、ミクロスフェアにBSAを充填し、Bradfordタンパク質アッセイで60日以上にわたってタンパク質の放出を試験しました。放出は最初のバーストから始まり、エレクトロスピニング後にミクロスフェアが分解するにつれて続きます。ミクロスフェアは、3D繊維構造のいたるところに見られます。

このSEMでは、完全な足場の画像です。球体は、矢印で示された複数のレイヤーで見ることができます。この高倍率画像は、1つのマイクロスフィアとその上の足場からのナノファイバーです。

背根神経節またはDRGを使用して、足場内のマイクロスフェアにおける神経成長因子またはNGFの生存率をテストしました。これは、マイクロスフィアを含む足場に座っているDRGです。NGFがロードされた1つのマイクロスフェアの隣に示されており、長い神経突起内にタンパク質はありませんNGF足場上のDRGから伸びる伸長は、NGFが生存可能であり、成長を促進することができることを示しています。

このビデオを見れば、タンパク質をミクロスフェアにカプセル化し、それらを繊維状の足場に組み込む方法について十分に理解できるはずです。