Name: 繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶ、電気紡糸法と微小球を組み合わせた神経組織工学用足場の作製法。ヒヨコ背根神経節を用いて神経突起の成長と方向性を促進する効果を検証し、神経再生医療への応用可能性を示す。

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この作業は、リチャード・バーバー財団とトーマス・ランブル・フェローシップ（TJW）を通じて部分的に資金提供されました。

1。水/オイル/水ダブルエマルションマイクロス制作<ol><li>最初の脱イオン水中のポリビニルアルコール（PVA）vの溶液/ wの2％及び0.5％を準備する。透明になるまで50℃での溶液を撹拌し、これには数時間かかる場合があります。脱イオン水に2％v / vのイソプロピルアルコールの溶液を調製する。 </li><li>希望親水性タンパク質の水溶液を調製します。下の表は、例示的製剤を提供する。 </li></ol><img alt="表1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> 表1：実施例プロテインソリューション以下のタンパク質溶液は、正常にこのプロトコルを使用してカプセル化され、エレクトロスピニングされている。必要に応じて他の親水性タンパク質溶液を使用することができる。 <ol start="3"><li> 50ミリリットルの遠心分離管に0.5％PVA溶液40mlを置き、脇に置きます。 </li><li> 15mlの遠心管中で65:35、300mgの溶解ジクロロメタン3ml中のポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）。ボルテックスミキサーは、PLGAの溶解を促進するために使用することができる。 </li><li>タンパク質溶液200μl、2％PVA溶液4μlのを結合します。 PLGA溶液（ステップ1.4）にタンパク質混合物を注ぐ。ソリューションは、主に独立したままになります。 </li><li>氷水のビーカーにチューブを置きます。均一な乳白色のエマルションが作成されるまで、〜10ワット（RMS）でワンド超音波処理器を使用して、数秒（5-10）の解を攪拌する。 </li><li> 0.5％PVA（ステップ1.3）を含む50mlチューブ中にエマルジョンを注ぐ。 〜20秒間ボルテックスミキサーで高速でソリューションを混ぜる。解決策は、曇った外観を開発します。 </li><li> 2分間350rpmで撹拌プレート上200ミリリットルのビーカーや場所にエマルジョンを転送します。撹拌プレート上のビーカーに2％イソプロピルアルコール50mlを加える。混合物が硬化するDCMが蒸発させる1時間の​​最小値とPLGA攪拌継続できるようにします。 </li><li>転送さt彼は遠心管に溶液をマイクロスフェア。 </li><li> 3分間425×gで遠心分離する。マイクロスフェアは、チューブの底に集め、白が表示されます。慎重にマイクロスフェアの上に、チューブから上清を除去し、500ミリリットルボトルに保管してください。 </li><li>四分の三の完全かつ液体中のマイクロスフェアを再配布するためにそれを振っチューブを充填して脱イオン水でマイクロスフェアを洗い流す。 </li><li>繰り返します1.10＆1.11 4回繰り返します。 </li><li>最後のすすぎに続いて、他のサンプルで再び500ミリリットルボトル内の場所上清を除去。その後少なくとも24時間、凍結乾燥、遠心管に集めミクロスフェアを凍結する。 </li><li>光学顕微鏡下で、または走査型電子顕微鏡で微小球を可視化する。 60ミクロンよりも大きくないマイクロスフェアは、効果的なエレクトロスピニングのためのものです。マイクロスフェアが大きすぎる場合、より長い超音波処理またはボルテックス時間は、ステップ1.6または1.7で必要とされ得る。 </li> &lt;李&gt;は、-20℃の冷凍庫内で乾燥微小球を保管してください。 </li><li>オプション：ステップ1.10 30から500ミリリットルボトルにタンパク質の量をテストするために、製造者の指示に従って、タンパク質アッセイを使用してください。これは、製造工程において使用したものと溶液中の量を減算することにより、マイクロスフェア中にカプセル化タンパク質のパーセントを計算するために使用される。 </li></ol>注：PLGA溶液31ミリリットルにローダミンを2μg/を追加し、FITC結合タンパク質をカプセル化マイクロスフェア中のタンパク質の位置を視覚化するために、図1に例を示します。 マイクロスフェアと2。エレクトロスピニング<ol><li>電界紡糸溶液を調製する前に、37℃で溶解することによって脱イオン水に、光開始剤のw / v溶液0.5％を作成する。このプロセスには数時間かかることがあります。 </li><li> 29（バーディックらを参照してください。合成のための）2％W / Vメタクリル化ヒアルロン酸（MeHAを）を作成し、3％/ 900 kDのポリ（エチレンオキシド）（PEO）v及び0.05％wの脱イオン水vの光開始剤溶液/ wである。 <ol><li>所望の体積のためMeHAをとPEOの正確な量を計算します。例えば、電界紡糸溶液10mlをMeHAをとPEO 300mgの200mgのを必要とする。 </li><li>所望の最終体積（この例では9 ml）を90％の脱イオン水にPEOを溶解する。これには数時間かかることがあり、37℃で加熱撹拌プレートまたは水浴プロセスを加速するために使用することができる。 </li><li>次MeHAを追加し、透明になるまでソリューションを撹拌するボルテックスミキサーを使用しています。これはほんの数分かかります。 </li><li>最後に、残りの10％の体積（この例では1 ml）を充填するために0.5％の光開始剤溶液を添加する。 </li></ol></li><li> 400 mg / mlの最大所望の濃度でマイクロスフェアを追加します。マイクロスフェアが均等に溶液中に分散されるまで、ボルテックスミキサー上に溶液を混ぜる。 </li><li>シリンジにソリューションを移し、6インチの18ゲージのBLを添付UNT先端の針。 </li><li>シリンジポンプにシリンジを配置し、1.2ミリリットル/時間で分配するように設定します。 </li><li>収集プレートまたはマンドレル上にアルミ箔の層をテープで固定します。これは、完成した足場を簡単にクリーンアップとストレージが可能になります。回転マンドレルは、整列した繊維を作成するために使用されている。平板または固定マンドレルは、ランダムに配置された繊維になります。 </li><li>収集装置に高電圧電源からアース線を接続する。針に正のリードを接続します。 </li><li>ニードルチップと収集面間に15センチあるように、シリンジポンプ及び収集面を調整する。 </li><li>ソリューションは、注射器の最後に表示されている場合、ポリマーポンプを起動し、電圧源をオンにし、24 kVの電圧を設定する注意 ：電圧がオンにされると、システムの金属部分に触れないでください。チャージはまた、皮膚に帯電部分から短い距離をジャンプすることがあります。 </li><li> Dまで溶液を実行します。esired足場の厚さが達成される。完了すると、電圧源とシリンジポンプをオフにしてください。 </li><li>添付足場とホイルを外します。タンパク質を含む完成した足場は、-20℃の冷凍庫に保存されている。 </li></ol> 3タンパク質生物活性試験<ol><li>細胞培養培地を準備します。追加の10％v / vのウシ胎児血清ダルベッコ改変イーグル培地に1％v / vのL-グルタミン、および1％v / vのペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li>ウェルプレートに完全にフィットするカバーガラスを選択します。 </li><li>製造業者によって記載されるようにカバースリップを治療するために3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを使用する。メタクリル化は、カバースリップの足場付着性を向上させます。 </li><li>エレクトロスピニングの前に取り外し可能な両面テープでelectrospinnerの収集領域へのメタクリル化カバーガラスを取り付けます。カバースリップ上に紡績することは取り扱いや閲覧が容易になります。 </li><li>上記のように所望の厚さにエレクトロスピニング。 </li><li> AFTERは慎重にマンドレルからカバースリップを削除エレクトロスピニング。明確な窒素室に足場コーティングしたカバーガラスを置き、全ての酸素がパージされることを確認してください。 </li><li> 15分間は10mW / cm 2の 365nmの光の下でチャンバーと足場を置きます。適切なサイズのウェルプレートに場所を架橋した後。足場側が上を向いていることを確認します。 </li><li> 30分間殺菌灯の下に置いて足場を滅菌する。所望であれば、フィブロネクチンまたは他のタンパク質は、細胞接着を強化するためのコーティングとして使用される。コー​​ト足場に、メーカーの指示に従ってください。 </li><li>収穫後根神経節（DRG）、以前にホーレンベック32によって記述。一つのDRGは、試験した各足場に覆わカバースリップのために必要とされます。 </li><li>ウェルプレートの各足場上のメディア100〜200μLを置きます。慎重メディア滴の各足場に1 DRGを置く。厚手の足場のために複数のメディアが必要になる場合があります。 DRGは、完全に水没する必要があり、floaませんティン。 </li><li>細胞は足場に付着させ4時間、37℃で足場およびDRGをインキュベートします。 </li><li>ウェルについての適切なレベルにメディアを記入し、バックインキュベーターに配置します。 4-6日間培養を続けます。 </li><li>インキュベーション期間の後、慎重に各ウェルから培地を除去し、穏やかにPBSで一回洗浄します。 / vパラホルムアルデヒドwの4％を用いて30分間、細胞を固定します。 </li><li>ニューロフィラメントに対する抗体染色を用いて染色する細胞。これは定量化のための神経突起伸長を可視化することができます。 DAPIは、細胞の核を表示するために使用することができる。例えば、染色プロトコルはSundararaghavanおよび同僚14によって記載された。 </li><li>蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。 <ol><li>顕微鏡のステージ上ウェルプレートを置きます。 </li><li> DAPI用のフィルタおよび励起の設定を使用して、細胞塊を見つけます。 </li><li>セルたら拡張神経突起を可視化するために、FITCにフィルタを切り替えることである。 U収集し、全体の構造を見るために必要な数の画像を組み合わせ、顕微鏡でのステッチ機能を歌う。 DAPI、FITC及び明視野に対して繰り返します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多くの研究は、神経細胞が地形手がかり（繊維配向）および化学的手がかり（成長因子）1,2,10,11,35によって指示することができることを示している。エレクトロスピニングは、整列した繊維を作成するための容易な方法です。成長因子は、神経成長を促すが、神経導管（NC）にそれらを含めるために、持続放出のための方法が必要とされる。両方の手がかりとより堅牢なシステムを作成するには、次の2つの信号が結合されるべきである。いくつかの方法が以前に神経再生のためのエレクトロ繊維状足場内のタンパク質の持続放出を提供するために研究されてきたが、今日までの、いずれも60日間を超えて持続放出が可能なされていない。さらに、成長因子放出のパターニングが不可能であった。本明細書では、両方の信号を提供するために、PLGAミクロスフェア送達に電界紡糸を結合するシステムを説明する。 従来の方法は、そのようなデ·ボーアらによって概説したプロトコルとして、PLGAマイクロスフェアを作製した。&lt;/ em&gt;の、エレクトロスピニング法に耐えることができなかった...

神経組織工学における継続的な課題の一つは、神経が自然に成長する細胞外マトリックスを模倣神経導管（NC）を作成します。研究は、細胞が機械的、地形、接着剤及び化学的シグナル1-3を含め、環境内のいくつかの要因に反応することが示されている。この分野における主要な課題の一つは、信号の適切な組み合わせを決定し、細胞増殖4を支持するために長時間のキューを維持することができるシステムを製作される。末梢ニューロンが軟質基板を好むことが知られており、整列した繊維により誘導され、神経成長因子（NGF）5-7に応答する。週間の化学的手がかりを提供することができnCSが近い同種移植、神経修復8,9の現在のゴールドスタンダードと改善された機能回復を提供することが示されている。 さまざまな材料および製造方法は機械的およびトポグラフィーを生成するために使用することができアルは10-13頭出し。機械的な合図は、アプリケーションのクリティカル1,13のための適切な材料の選択を行うこと、選択された材料に固有である。製造方法は地形キューが相分離、自己集合および1,13エレクトロスピニングが挙げられる制御する。マイクロスケールの用途、マイクロ流体工学、フォトパターニング、エッチング、塩浸出、またはガスフォームに対して14〜17をも使用することができる。エレクトロスピニングは、その柔軟性と生産13,18-23のしやすさに組織培養のための繊維状基材を設計するための最も一般的な方法として登場しました。電界紡糸ナノファイバーは、それ自体を撃退および24を放電するために短いギャップを横切って伸張させるポリマー溶液に高電圧を印加することにより製造される。整列足場は、接地回転マンドレル上に繊維を収集することによって作成することができ、非整列足場は、固定プレート25上に収集される。接着シグナリングは、繊維状足場ウィットをコーティングすることによって達成することができる時間フィブロネクチンまたは26をエレクトロスピニングする前に、HAへのそのようなRGDなどの接着ペプチドを、結合させる。 成長因子などの化学信号は、それらが制御された放出のためのソースを必要とするので、長期間にわたって維持することが最も困難である。多くのシステムは成功のさまざまなレベルで電界紡糸繊維質のネットワークに制御された放出を追加しようとしてきた。これらの方法は、ブレンドの電界紡糸、エマルジ ​​ョンエレクトロスピニング、コアシェル電気紡糸およびタンパク質共役27を含む。さらに、エレクトロスピニングは、伝統的に考慮されなければならない、したがって、タンパク質の生物活性を維持し、タンパク質28の生存率に影響を与えることができる揮発性溶媒中で行われる。 このアプローチは、特に末梢神経成長のための調整可能な足場を作成するために、機械的、地形的、化学的および接着剤信号を結合対処しています。足場の力学を正確に合成することによって制御されるメタクリル化ヒアルロン酸（HA）。メタクリル化部位は、光反応性架橋剤を取り付けるために使用される。架橋された材料は、もはや水溶性ではなく、排他的に酵素29により分解される。架橋の量は、分解速度、力学と材料の他の物理的特性を変更します。 〜500 Paで引張弾性率を有する30％のメタクリル化とHAを使用して、神経組織の本来の力学に近く、一般的に、ニューロン26,29に好まれているソフトの基板を作成します。回転マンドレル上でエレクトロスピニングすると、地形のキューのための整列した繊維を作成するために使用されている。マイクロスフェアと一緒にエレクトロスピニングを使用すると、長期間にわたって足場内の化学信号を提供する。 NGFを含む神経突起成長のミクロスフェアをサポートするために、化学信号を作成するために使用される。 NGFは製造中に過酷な溶剤に遭遇しないように、ほとんどのエレ​​クトロスピン材料とは異なり、HAは水溶性である。 、SCAを粘着信号を追加するには、ffoldは、フィブロネクチンで被覆されている。 NGFはフィブロネクチン（接着剤）でコーティングされたマイクロスフェア（化学）を放出したソフト（機械）整列（地形）繊維：完成したシステムは、上記の信号の4つのすべてのタイプが含まれています。このシステムの製造および試験は、このプロトコルに記載されている。 プロセスは、水中油中水のダブルエマルジョンとマイクロスフェアの製造から始まる。エマルジョンは、界面活性剤、ポリビニルアルコール（PVA）で安定化される。内側の水相は、タンパク質が含まれています。それはジクロロメタン（DCM）に溶解PLGAシェル材料を含有する、油相に添加されると、界面活性剤は、DCMからタンパク質を保護する相の間の障壁を作成する。このエマルジョンは、ミクロスフェアの外表面を作成するためにPVAを含む別の水相中に分散しなくなる。安定したエマルジョンがDCMを蒸発させて攪拌される。洗浄および凍結乾燥した後は、乾いたマイクロスフェアの続きが残されているタンパク質をaining。 微小球が完了した後、それらを足場に電界紡糸される準備ができている。まず、電界紡糸溶液を調製。溶液の粘度は、適切な繊維形成にとって重要である。純粋なHAの解決策はこの要件を満たしていない。 PEOは、電界紡糸を可能にするために、担体ポリマーとして添加される。マイクロスフェアは、全体に分散マイクロスフェアと繊維状足場に得られた溶液とエレクトロに追加されます。 生産が完了すると、タンパク質は、その実行可能性を検証するためにテストする必要があります。これを行うには、NGFに応答する一次電池を使用することができる。このプロトコルは、8〜10日齢のニワトリ胚から後根神経節（DRG）を使用しています。セルの束は、NGFまたは空のあるもので満たされたマイクロスフェアを含む足場上に播種する。 NGFはまだ実行可能である場合は、NGFを含む足場上の強化された神経突起成長が表示されるはずです。 NGFはもはや実行可能でない場合、それは意志拡張するとコントロールのように表示されます神経突起を促進しない。 本明細書で説明正確な手順は、システムがさまざまな細胞および組織型に対して最適化することができる単純な物質への変更、エレクトロスピニング法、およびタンパク質で、しかし、神経支持体上に集光される。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>メタクリロキチルチオカルバモイルローダミン B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td>でストック溶液を調製 <td>KDサイエンティフィック</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>ガンマ</td>高電圧 <td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>モーター</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>カスタムビルドのマンドレルに取り付ける必要があります</td></tr><tr><td>タコメーター</td><td>ネットワークツールウェアハウス</td><td>ESI-330</td><td>マンドレル速度</td></tr><tr><td>を監視するために使用オムニキュアUVスポット硬化システム、コリメートアダプター付き</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>イソポロピルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-神経成長因子(NGF)</td><td>R&D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 ポリ乳酸グリコール酸 (PLGA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfaアエサル</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

繊維状足場に微小球を離すエレクトロ成長因子

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

この手順は、神経細胞の成長を指示するための多面的な基質を製造する方法を説明しています。 このシステムには、機械的、地形的、接着的、化学的な信号が組み込まれています。 機械的特性は、エレクトロスピニングファイバーの製造に使用される材料の種類によって制御されます。 このプロトコルでは、30% メタクリル化ヒアルロン酸 (HA) を使用し、引張弾性率は ~500 Pa で、柔らかい繊維状の足場を生成します。回転するマンドレルにエレクトロスピニングすると、整列した繊維が生成され、トポグラフィーの手がかりが作成されます。 密着性は、足場をフィブロネクチンでコーティングすることによって達成されます。 本明細書で対処する主要な課題は、長期間にわたって足場の深さ全体に化学シグナルを提供することである。 この手順では、神経成長因子(NGF)を含むポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)ミクロスフェアを作製し、エレクトロスピニングプロセス中にこれらのミクロスフェアをスキャフォールドに直接含浸させる方法について説明します。高い純粋な力や電荷などの過酷な生産環境のため、タンパク質の生存率は製造後に測定されます。このシステムは、60日以上にわたってタンパク質を放出し、初代神経細胞の成長を促進することが示されています。

85％のタンパク質カプセル化微小球は直径50±14μmで、一貫して足場に生産され、エレクトロれています。サイズは、3つの別個の製造バッチから微小球のサンプルを撮像することによって決定した。商業ラボソフトウェアを使用して測定光学顕微鏡および長さに撮影された画像。 図1は、サイズ分布のヒストグラムを示す。封入率は、製造プロセス中に脱出したタンパク質を定量することにより、3つの個別のミクロスフェアバッチから試験された。 図2は、内にカプセル化されたPLGAシェルおよびウシ血清アルブミン（BSA）-FITCにおけるローダミン（2μg/ ml）を有する代表的な微小球を示している。画像は、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。シェルは、明らかに内部の（緑色）で濃縮タンパク質と（赤）を見ることができる。 、ミクロスフェアのカプセル化を評価するためsはBSAで満たし、ブラッドフォード（Bradford）タンパク質アッセイによるタンパク質の放出について試験した。 PLGAは、タンパ...

このプロトコルは、エレクトロスピニングとマイクロスフェアを組み合わせて、ニューロンを指向するための組織工学的な足場を開発します。神経成長因子をPLGAマイクロスフェア内にカプセル化し、ヒアルロン酸(HA)繊維状足場にエレクトロスピニングしました。 タンパク質の生理活性は、初代ヒヨコの背根神経節を足場に播種し、4〜6日間培養することによって試験されました。

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

この手順の全体的な目的は、神経の成長と修復を支援するための多面的な環境を構築することです。まず、分解性マイクロスフェア内に成長因子を封入することでこれを達成します。次のステップでは、環境の大部分となる支持材料を調製します。次に、マイクロスフェアと支持材料を混合し、電界紡糸法により配向した繊維状スキャフォールドを作製します。最終ステップとして、このスキャフォールドを用いてニワトリ後根神経節ニューロンの試験を行います。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、対照群と比較してニューライトの伸展と方向性が促進されていることを示します。本システムは神経組織向けに設計されていますが、使用するタンパク質や材料をわずかに変更することで、心臓、肺、骨を含む様々な組織タイプにも適用可能です。本手順を開始する前に、必要な試薬である、脱イオン水による2%および0.5% w/v ポリビニルアルコール（PVA）溶液、2% v/v イソプロピルアルコールおよび脱イオン水溶液、ならびに目的の親水性タンパク質水溶液を準備してください。0.5% PVA溶液 40 mLを50 mL遠心チューブに入れ、小瓶に 65:35 ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA） 300 mgをジクロロメタン 3 mLに溶解させて置いておきます。ボルテックスミキサーを使用して、200 µLのタンパク質溶液と4 µLの2% PVA溶液を混合し、PLGAの溶解を促進させることができます。タンパク質とPVAの混合液をPLGA溶液に注ぎます。これらの溶液は、ほとんど分離した状態のままとなります。バイアルを氷水の入ったビーカーに入れ、W atorを約10 Wで用い、均一な乳白色のエマルションが形成されるまで5〜10秒間溶液を撹拌します。このエマルションを、あらかじめ準備しておいた0.5% PVAを含む50 mLチューブに注ぎます。ボルテックスミキサーを用いて、高速で約20秒間溶液を混合します。溶液は白濁します。乳濁液を200 milliliterのビーカーに移し、スターラープレートの上に置いて350 RPMで2分間撹拌します。スターラープレート上のビーカーに2%イソプロピルアルコールを50 milliliters加えます。クロロメタンを蒸発させ、PLGAを硬化させるため、混合物を最低1時間攪拌し続けます。次に、マイクロスフェア溶液を遠心管に移し、425 ×gで3分間遠心分離します。マイクロスフェアは管の底部に集まり、白色に見えます。マイクロスフェアの上層にある上清を管から慎重に取り除き、500 mLボトルに保存します。各チューブの4分の3まで脱イオン水を満たし、振とうしてマイクロスフィアを液体中に再分散させることで、マイクロスフィアを洗浄します。最後の洗浄の後、遠心分離による上清の除去と脱イオン水でのマイクロスフィアの洗浄を4回繰り返します。上清を除去し、他のサンプルとともに500 milliliterのボトルに入れます。遠心チューブに回収したマイクロスフィアを-20 °Cで一晩凍結させ、その後、少なくとも24時間凍結乾燥させます。以下のエレクトロスピン溶液を、脱イオン水を用いて事前に調製しておきます。2% w/vのメタクリル化ヒアルロン酸（miha）、3% w/vの900 kDaポリエチレンオキシド（PEO）、および0.05% w/v的光開始剤溶液を用います。所定の量の電界紡糸溶液を作製した後、マイクロスフェアを最大 400 mg/mL の所定の濃度で添加します。ボルテックスミキサーを用いて、マイクロスフェアが溶液中に均一に分散するまで混合します。この溶液をシリンジに移し、6インチの18ゲージ鈍端針を取り付けます。シリンジをシリンジポンプにセットし、1.2 milliliters per hourで分注するように設定します。マンドレルにアルミホイルを一層貼り付けます。これにより、完成したスキャフォールドの回収と保存が容易になります。配向したファイバーを作製するために、回転マンドレルを使用します。高電圧電源からの接地線を回収装置に接続します。エレクトロスピンニングを確実に成功させるため、正極リードをニードルに接続します。すべての接続と設定が正しいことを確認することが非常に重要です。ポリマーのポンピングを開始し、シリンジの先端に溶液が見えたら、電圧源のスイッチを入れ、電圧を24 kilovoltsに設定します。目的のスキャフォールドの厚さに達するまで、溶液を流し続けてください。完了したら、電圧源とシリンジポンプの電源を切ります。本手順を開始する前に、取り外し可能な両面テープを使用して、エレクトロスピン装置の回収エリアに関連するカバーガラスを貼り付けます。カバーガラス上に紡糸することで、目的の厚さに達した後のハンドリングや観察が容易になります。前のビデオセグメントで示したように、マンドレルからカバーガラスを慎重に外します。スキャフォールドをコーティングしたカバーガラスを透明な窒素チャンバーに入れ、すべての酸素がパージされていることを確認します。チャンバーとスキャフォールドを10 mW/cm²、365 nmの光の下に15分間置きます。架橋後、カバースリップを適切なサイズのウェルプレートに入れます。この際、スキャフォールド側が上を向くようにしてください。ウェルプレート内の各スキャフォールドに、100〜200 µLの培地を慎重に加えます。培地ドロップ内の各スキャフォールドに、背根神経節（DRG）を1つずつ配置します。厚いスキャフォールドを使用する場合は、より多くの培地が必要になることがあります。DRGは浮いていない状態で、完全に浸漬させてください。細胞をスキャフォールドに接着させるため、スキャフォールドとDRGを37 °Cで4時間インキュベートします。次に、ウェルの適切なレベルまで培地を満たします。プレートをインキュベーターに戻し、インキュベーション期間後、さらに4〜6日間インキュベートします。各ウェルから培地を慎重に取り除き、PBSで1回優しく洗浄します。4% weight per volume パラホルムアルデヒドを用いて細胞を30分間固定します。その後、確立されたプロトコルに従い、ニューロフィラメントおよび核で細胞を染色します。蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化するには、ウェルプレートを顕微鏡のステージに載せ、dpi用のフィルターおよび励起設定を使用して細胞塊を探します。細胞を確認したら、フィルターをziに切り替えます。伸展したニューライトを可視化するには、顕微鏡のスティッチ機能を使用して、構造全体が見えるまで必要な枚数の画像を収集し、結合させます。dpi、fite、および明視野マイクロスフィアについても同様に繰り返します。このプロトコルにより、直径 50 ± 14 µm でタンパク質封入率 85% 以上のマイクロスフィアが安定して作製され、電界紡糸によるスキャフォールドへの組み込みが達成されています。この蛍光画像は、PLGAシェルに Rhodamine を含み、内部に BSA FITC を封入した代表的なマイクロスフィアを示しています。封入効率を評価するため、マイクロスフィアにBSAを充填し、Bradfordタンパク質定量法を用いて60日以上にわたるタンパク質放出試験を行った。放出は初期バーストから始まり、その後、電界紡糸後のマイクロスフィアの分解に伴い継続的に放出される。マイクロスフィアは3D繊維構造の全体にわたって観察できる。完成したスキャフォールドのSEM画像です。矢印で示されているように、球体が複数層にわたって観察できます。この高倍率画像は、1つのマイクロスフィアとその上にあるスキャフォールド由来のナノファイバーを示しています。足根神経節（DRG）を用いて、スキャフォールド内のマイクロスフェアに含まれる神経成長因子（NGF）の活性を検証しました。ここでは、マイクロスフェアを含むスキャフォールド上に配置されたDRGを示しています。NGFを充填したものは、タンパク質を含まないマイクロスフェアの隣に示されています。NGFスキャフォールド上のDRGから伸びる長い神経突起は、NGFが活性を保持しており、成長を促進できることを示しています。このビデオを視聴することで、タンパク質をマイクロスフィアに封入し、それらを繊維状スキャフォールドに組み込む方法について十分に理解することができます。

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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