皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

本手順の全体的な目的は、子宮内電穿孔法を用いて、発生過程にあるマウス脳の前脳における介在ニューロンを標的にすることです。これは、まず注射針を準備し、次に麻酔をかけた動物から胚を摘出することによって行われます。

次に、脳内へのDNA注入およびエレクトロポレーションを行います。最終ステップとして、動物を手術から回復させます。最終的に、子宮内エレクトロポレーションを用いることで、介在ニューロンのサブタイプを選択的に標的化することが可能になります。

非特異的な子宮内電穿孔法などの既存の手法に対するこれらの手法の利点は、皮質介在ニューロンの一部分について、細胞自律的な解析を行う手段を提供できる点にあります。GFPが高レベルで発現するため、単一の介在ニューロンの可視化および解析が可能です。この手法は、成熟する介在ニューロンの統合を制御するルールとは何かという、神経発達分野における根本的な問いに答える一助となります。

本手順を開始するために、ピペットプラーを用いてガラスキャピラリーを引き伸ばし、マイクロインジェクション用ピペットを準備します。次に、キャピラリーを慎重に取り外し、マイクロインジェクションに使用する先端の針を回収します。その後、麻酔をかけた妊娠マウスを、腹側が上になるようにヒーティングパッドの上に配置します。

手術の間、継続的にイソフルランを供給できるよう、マスクで口と鼻を覆います。次に、両眼に眼潤滑剤を塗布します。術後の低体温症を防ぐため、ヒートパッドを36 °Cに設定します。

後肢の足先または尾をつまみ、足および尾の反射がないことを確認します。次に、腹部の皮膚を70% ethanolで清浄します。ピンセットを使用して皮膚を上方に引っ張ります。

次に、3番目と4番目の乳腺対の中間点から始まり、正中線に沿って2 cmの小さな垂直切開を加えます。ラウンド鉗子を使用し、腹壁を損傷しないよう注意してください。胚鎖を体腔からゆっくりと引き出します。

チェーンをウェットワイプの上に置きます。まず子宮の半分を露出させます。次に、もう半分に移る前に、胚のエレクトロポレーションを行います。

本手順では、標準的なマキシプレップ精製プロトコルで得られたペレットを蒸留水に溶解し、DNA溶液を調製します。次に、注入中の視認性を確保するため、DNA溶液にファストグリーンを1:20の比率で添加します。続いて、あらかじめ細く引いたマイクロピペットのチップを精密ピンセットでカットし、ショルダーの開始点からチップの先端までが6 mmになるように調整します。

その後、注入用のFast Greenを含むDNA溶液を1 µL、マイクロピペットに吸い込みます。丸いピンセットで胚の頭部を固定します。正中線付近に位置する側脳室を狙い、ピペットを45度の角度で脳に挿入します。

針が脳室を貫通した場合は、ゆっくりとピペットを後退させます。溶液が充填され始めると、脳室が緑色に変わります。この時点でピペットの移動を止め、1 µLのDNAを注入します。

その後、ピペットをゆっくりと引き抜きます。ECM 830 エレクトロポレーターを、パルス幅 50 milliseconds、パルス間隔 950 milliseconds の 5 45 volt パルスに設定します。効率的な電流伝達を確実にするため、5 millimeter パドル電極を PBS に浸します。

次に、電極パッドを胚の頭部の周囲に配置し、DNA溶液が含まれる脳室の上に陽極パッドを置きます。神経節隆起を介して腹側方向に電流が流れるように、陽極パッドを陰極パッドよりもわずかに低い位置に配置します。これにより、傍外套細胞における異所性発現を最小限に抑えることができます。

フットペダルを1回押し、パルスを与えます。その後、電極を取り外してきれいに拭き取ってください。すべての胚に対して同様の手順を繰り返します。すべての胚への電気穿孔が完了した後、

腹腔内にPBSを3 mL注入し、胚を腹腔内に戻します。次に、曲針と5-0シルク縫合糸を用いて腹壁を縫合し、続いて皮膚を縫合します。創部にリドカインを塗布し、鎮痛目的として初回の鎮痛剤としてアスピリンを120 mg/kg投与します。

麻酔チューブから動物を取り出し、ペーパーワイプを敷いたヒーティングパッドの上で回復させます。その後、動物をケージに戻します。37 °Cのヒーティングパッド上に保持し、健康状態を観察します。

本実験では、エレクトロポレーションを施した介在ニューロンを、CGE由来サブタイプのマーカー発現によって識別します。この画像は、CGE由来の介在ニューロンにDLX5/6 EGFPプラスミドがエレクトロポレーションされていることを示しています。この画像は、P8におけるVIP発現介在ニューロンを示しています。

EGFPの発現により、単一ニューロンの樹状突起および軸索の全貌が描き出されており、こちらがP8におけるNPY発現インターニューロンです。NPYの発現はニューログリア形成細胞を規定しています。最後に、こちらがP15におけるNPY発現インターニューロンです。

この手法に習熟し、適切に実施すれば、20分で完了させることができます。特定のプラスミドと遺伝子組換えマウス系統を組み合わせることで、目的遺伝子の発現を時間的および空間的に制御することが可能です。一部の実験では、AU依存性トランスジェンの発現を誘導するためにA-D-L-X-T-T-Aプラスミドを使用しています。

これらの実験では、ドキシサイクリンを投与することにより、導入遺伝子の発現をサイレンシングさせました。