Name: 皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学ぶ マウス前脳の皮質介在ニューロンサブタイプ選択的エレクトロポレーション法。子宮内電気穿孔により特定の介在ニューロンに遺伝子発現を標的化し、発達神経科学の研究に応用できます。

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私たちは、技術支援のためのLihong陰に感謝しています。 NVDはNARSAD若手研究賞を受賞であり、また、NIH（5 K99 MH095825-02）からの助成金によってサポートされています。 Fishellラボでの研究は、国立衛生研究所、国立精神衛生研究所（5 R01 MH095147-02、5 R01 MH071679-09）、神経疾患·脳卒中研究所（5 R01 NS081297-02、1 P01 NS074972によってサポートされている-01A1）とシモンズ財団。

全ての動物は、医学のNYUの学校の施設内動物管理使用委員会の規則やガイドラインに沿って処理した。 マウス系統 TACONICによって提供スイスウェブスター雌マウスをこれらの実験に使用した。具体的に表層のニューロンを標的化するために、E15.5胚を使用した。 注：この作品で使用されたプラスミド（DLX5 / 6.eGFPプラスミド3μgを/μl）を、標準的なクローニング技術を使用して生成された。 eGFPの cDNAはDLX5 / 6-Pminは、ポリAプラスミドにクローニングした。このプラスミドは、要求（demarn02@nyumc.org）に応じて入手可能です。 マイクロインジェクションピペットの作製<ol><li> 860に引っ張りヒート＃2を設定してください。 </li><li>フィラメントに近いガラスキャピラリーを配置し、固定します。ピペットの外径（OD）が約30ミクロンであることを確認してください。 </li><li> 「プル」ボタンを押します。 </li><li>慎重にキャピラリーを削除します。底部が針である。上部を捨てる。 </li></ol> 2麻酔手順<ol><li>イソフルラン収納室を準備します。注：イソフルランは、その高速動作や副作用の発生率が低い、好ましい麻酔薬である。ペントバルビタールは、別のオプションです。しかしながら、この薬物の耐性は可変であり、イソフルランよりも高い死亡率につながる可能性がある。 </li><li> 0.5-1リットル/分のO 2中4から5パーセントにイソフルランの流れを設定します。 </li><li>ヘッドアダプタ用のバルブが閉じているのに対し、室内用のバルブが開いていることを確認してください。 </li><li>チャンバー内に妊娠したマウスを置きます。 </li><li>マウスは麻酔の影響下で行くことを許可します。これは、約2〜3分かかります。呼吸数をチェックしてください。マウスが過呼吸始めた場合、イソフルランの投与量を下げる。 </li><li>マウスを麻酔した後は、速やかにチャンバーから取り外します。加熱パッド上で腹側を上に置き、私手術全体にイソフルランを供給していきますマスクで頭をnsert。ヘッドアダプタピースを接続するチューブにチャンバーからイソフルランの流れを切り替えるようにしてください。各眼内の眼潤滑剤のドロップを入れて、目を閉じて。 </li><li>低体温症を最小限にするために36℃度に加熱パッドを設定してください。 </li><li>後足と尾をつまんで足と尾反射の不在を確認してください。 </li></ol> 3。手術<ol><li> 70％エタノールで腹部を覆っている皮膚を清潔に。 </li><li>上向きに皮膚を引っ張って鉗子を使用してください。各手術後、洗剤と水ですべての楽器を洗浄し、72℃のCO / Nで滅菌した。 </li><li>乳腺の3番目と4番目のペアの間の中間に始まる正中線に沿って小さな垂直切開（約2cm）を作成します。細かい手術はさみを使用してください。腹壁を損傷しないように注意してください。 </li><li>静かに腹膜から皮膚を分離する。 </li><li>動脈を可視化腹壁上の静脈。腹腔を露出させ（血管を避ける）腹膜を介して他の2センチメートル垂直の切開を加えます。 </li><li>動脈をクランプ避け各側の皮膚や腹壁をクランプ。動脈を誤ってパンクしている場合は、頸椎脱臼またはイソフルラン過剰投与を行うことで、すぐに動物を犠牲に：注意してください。 </li><li>前37℃に滅菌PBSを温める。キムワイプ湿ったPBSでクランプをカバー。 </li><li> PBSで露光され、腹腔に潤いを与える。手術を行いながら、この手順を数回繰り返します。 </li><li>ラウンド鉗子を使用して、静かにキャビティからの胚チェーン（E15.5）を引く。ウェットティッシュ上の鎖の残りをしましょう​​。最初の子宮の半分を露出することから始めます。その中の胚をエレクトロポレーションされた後、後半では動作した後、内部に戻ってそれを持って来る。 </li></ol> 4。エレクトロポレーション<ol><li>胚を操作するために丸いピンセットを使用し続ける。 </li><li> 6側脳室をsualize。正中線（ 図1b）に沿って走る側脳室。 </li><li>注射の間、それを可視化する1：20混合物のためのDNA溶液に：ファストグリーン（10％w / vの株式）を追加します。蒸留水で標準マキシプレップ精製プロトコルから得られたペレットを溶解させてDNA溶液を調製します。 </li><li>ファストグリーンでDNA溶液1ミリリットル（DLX5 / 6-EGFP、3μgの/μl）を注入するためにプランジャーで前に引っ張らマイクロピペットを使用してください。ピペットをロードする前に、針の先端の最後に肩の先頭から6ミリメートルの長さを残すように細かい鉗子＃5（デュモン）でマイクロピペットの先端をカットします。丸いピンセットで胚の頭部を持ってください。正中線の近くに位置し、側脳室を目指して45°の角度でピペットを用いて、脳を入力してください。針が心室を貫通する場合には、DNAを注入するプランジャーを使用したように、ゆっくりとピペットを撤回。心室はグリーンに点灯したとき解決策は、それを埋めるために開始されます。この時点で、ピペットを移動を停止し、DNAの1ミリリットルを注入。静かに、ピペットを撤回。 </li><li> 950ミリ秒だけ離れた50ミリ秒の5 45VパルスにCUY21のエレクトロを設定します。 </li><li> E15.5胚のために5mmのパドル電極を使用してください。効率的な電流伝達を確実にするために、PBS中の電極を浸し。 </li><li> DNA溶液を含む心室にプラスのパドルを胚の頭の周りの電極パドルを配置します。少し神経節隆起を通して腹側に電流を作成するために、負の1のに対して正のパドルを下げる。この操作は錐体細胞における異所性発現を最小限に抑えることができます。 </li><li>電極を配置した後、一度フットペダルを押して、パルスを供給。 </li><li>電極を取り外し、きれいなそれらを拭いてください。繰り返します各胚を4.6から4.9を繰り返します。 </li><li>すべての胚をエレクトロ後、腹腔内に3mlのPBSを注ぎ、腹腔に戻す。 </li><li>第1の縫合湾曲した針と5-0絹縫合した後、皮膚と腹壁。傷口にリドカイン（4％）を適用します。鎮痛のためのアスピリンのイントラ腹膜120mgの/ kgのを管理します。 注：全体の手順は、20分以内に行われるべきである。それは、初心者は、短い動作時間を維持するために、いくつかの胚をエレクトロポことをお勧めします。長時間の手術は胚の生存率を減少させる。 </li><li>麻酔管から動物を取り出し、拭い紙に加熱パッド上で回復を可能にします。 </li><li> 、ケージに動物を返し、37℃で加熱パッド上にそれを維持し、健康状態を監視します。動物は一般的によく手術に耐え、それらが麻酔管から除去された後すぐにゆっくりと移動し始める。過度の出血や無気力が認められた場合、動物実験委員会は、頸椎脱臼または麻酔の過剰摂取などの安楽死の手続きを承認し実行することで、すぐに動物を生け贄に捧げる。 </li><li>ビバにケージを返すバクテ。女性は自然に出産します。 </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

技術の限界この技術は、細胞プロセスの細胞自律的な分析を可能にするが、それは集団分析には適していない。エレクトロポレーションは、脳あたりにエレクトロ未満千細胞と非常に疎である。結果として、この技術は、CGE由来のニューロンの遺伝子操作から生じる行動の結果を評価するために使用することができない。 エレクトロポレーションは、E13.5-E14.5ターゲットMGE由来のサブタイプで行っているが、効率が10低い。私たちは、DLX5 / 6エンハンサーは少なくともエピソームの発現との関連で有糸分裂後MGEサブタイプにおける活性が低いと推測している。 既存の方法に関して意義技術は介在ニューロンの研究のため、以前にエレクトロポレーション法12,13から進歩を表しています。それらの相対的な希少性と腹側胚のためにNIC原点は、神経細胞のこの集団は、対象とすることは困難であるこ...

皮質GABA作動性介在ニューロンの大部分は、内側と尾側神経節隆起（MGEそれぞれとCGE）をという名前の2つの一過性の胚の構造から発生4。パルブアルブミンおよびソマトスタチンを発現するニューロンは、ニューロンは、CGEから発信表現カルレチニン（CR）、Vasointestinalペプチド（VIP）およびリーリン（再）に対し、MGEに由来する。これらのニューロンのサブタイプは、その誕生日によって区別す​​ることができる。 MGE派生サブタイプは胎生9.5（E9.5）とE16.5 5,6の間に生まれている。これとは対照的に、CGE派生介在ニューロンは、それらの生産がE15.5 6でピークに達してE12.5からE18.5を通して生まれている。この後半生まれの人口の遺伝的標的化は、しかし、とらえどころのないままになります。 ネズミ遠位レス（デラックス）の遺伝子はもっぱら発展途上腹側前脳3で表現される。 GABA作動性介在ニューロンと線条体投射ニューロンではなく、皮質錐体細胞がDlx1を表現、初期の発達段階3での2,5、及び6つの遺伝子。実際、 デラックス遺伝子は、すべてのGABA作動性前駆細胞におけるMGEとCGE脳室下帯（SVZ）で表現される。これらの遺伝子の発現は、有糸分裂後の段階7-9でのサブタイプを選択するために制限となる。以前の実験的証拠は、DLX5 / 6エンハンサーエレメントは、トランスジェニックマウスモデル2におけるGABA作動性系統の選択的ターゲティングを可能にすることを示した。私たちは、発生中のマウス脳におけるエピソーム発現の文脈におけるこれらのエンハンサーエレメントの1つの使用を試験した。私たちは、サブブルースクリプト（BS）骨格プラスミド（ 図1）における最小プロモーターおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）と共にDLX5 / 6エンハンサーエレメントをクローニングした。私たちは、選択的にCrイオン、VIPおよび再サブタイプ3,8,10を標的とするためにE15.5での子宮内電気穿孔中によりプラスミドを導入しました。私たちの技術は容易にスパースエレクトロポレーションを可能にする焦がす細胞の形態学的特徴の再構築。また、皮質GABA作動性ニューロンにおける遺伝子発現の非常に高いレベルの機能研究を可能にします。私たちは、いくつかの野生型およびドミナントネガティブ遺伝子11を用いた機能研究の損失と利得を実施しました。

<table><tbody><tr><td>エレクトロポレーター&nbsp; ペダル付き</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm パドル電極&nbsp;</td><td>プロテックインターナショナル</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド&nbsp;</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>サッターインスツルメンツP30プーラー&nbsp;</td><td>サッター器具</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac 麻酔システム</td><td>ハーバード装置</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>繊細な手術用はさみ 4.75インチ ストレート シャープ/シャープ</td><td>ロボズ</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 シルク ブラック ブレード 18インチ C-1 ボックス 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>マイクロクリップ鉗子適用 5.5インチ</td> <td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2クランプハサミ</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>保持鉗子&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリーチューブ&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>ボロシル 1.0 mm OD x 0.75 mm</td></tr><tr><td>ID Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>滅菌PBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

中枢神経系（CNS）成熟の研究は、ニューロン集団の遺伝的標的化に依存しています。しかし、特定のニューロンのサブタイプに関心のある遺伝子の発現を制限するタスクが原因特定のプロモーターエレメントの相対的希少性に著しく困難なことが証明されている。 GABA作動性ニューロンは、大規模な遺伝的および形態的多様性ニューロン集団を構成している。確かに、GABA作動性介在ニューロンの11を超える異なるサブタイプは、マウスの大脳皮質1に特徴付けられている。ここでは、GABA作動性集団の選択的標的化のために適合したプロトコルを提示する。私たちは、ホメオボックス転写のエンハンサーエレメントを使用することによりGABA作動性ニューロンのサブタイプ選択的ターゲティングを達成し子宮内電気穿孔法で特定の遺伝子の発現を介して駆動するためにDLX5とDlx6、ショウジョウバエ遠位レス（DLL）遺伝子2,3のホモログを、要因。

私たちは、成熟ニューロンの細胞型特異的ターゲティングを達成するために、 子宮内エレクトロポレーション技術を適合される。 CGE由来のニューロンにおけるEGFPの発現を駆動するためには、CGE由来のニューロンの大部分が生成される段階、DLX5 / 6エンハンサーエレメントを使用し、E15.5に私達の注射を制限した。私たちは、P8とP15 11（ 図1および図2）で解析を行った。私たちは、E15.5での等モル濃度で、CAG-mCherryをとDLX5 / 6-EGFPプラスミドをエレクトロポレーションの共同による電気穿孔ニューロンの腹側の原点を確認した。この実験では、脳室下帯（SVZ）の共同に位置だけ腹前駆細胞は、両方のタンパク質11を発現したことを観察した。蛍光タンパク質のこの時空間時間的発現は、正常な発達心室で表現されていないDLX5及び6の遺伝子の発現が、subventrと一致しているicularゾーン4。<...

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

本手順の全体的な目的は、子宮内電穿孔法を用いて、発生過程にあるマウス脳の前脳における介在ニューロンを標的にすることです。これは、まず注射針を準備し、次に麻酔をかけた動物から胚を摘出することによって行われます。次に、脳内へのDNA注入およびエレクトロポレーションを行います。最終ステップとして、動物を手術から回復させます。最終的に、子宮内エレクトロポレーションを用いることで、介在ニューロンのサブタイプを選択的に標的化することが可能になります。非特異的な子宮内電穿孔法などの既存の手法に対するこれらの手法の利点は、皮質介在ニューロンの一部分について、細胞自律的な解析を行う手段を提供できる点にあります。GFPが高レベルで発現するため、単一の介在ニューロンの可視化および解析が可能です。この手法は、成熟する介在ニューロンの統合を制御するルールとは何かという、神経発達分野における根本的な問いに答える一助となります。本手順を開始するために、ピペットプラーを用いてガラスキャピラリーを引き伸ばし、マイクロインジェクション用ピペットを準備します。次に、キャピラリーを慎重に取り外し、マイクロインジェクションに使用する先端の針を回収します。その後、麻酔をかけた妊娠マウスを、腹側が上になるようにヒーティングパッドの上に配置します。手術の間、継続的にイソフルランを供給できるよう、マスクで口と鼻を覆います。次に、両眼に眼潤滑剤を塗布します。術後の低体温症を防ぐため、ヒートパッドを36 °Cに設定します。後肢の足先または尾をつまみ、足および尾の反射がないことを確認します。次に、腹部の皮膚を70% ethanolで清浄します。ピンセットを使用して皮膚を上方に引っ張ります。次に、3番目と4番目の乳腺対の中間点から始まり、正中線に沿って2 cmの小さな垂直切開を加えます。ラウンド鉗子を使用し、腹壁を損傷しないよう注意してください。胚鎖を体腔からゆっくりと引き出します。チェーンをウェットワイプの上に置きます。まず子宮の半分を露出させます。次に、もう半分に移る前に、胚のエレクトロポレーションを行います。本手順では、標準的なマキシプレップ精製プロトコルで得られたペレットを蒸留水に溶解し、DNA溶液を調製します。次に、注入中の視認性を確保するため、DNA溶液にファストグリーンを1:20の比率で添加します。続いて、あらかじめ細く引いたマイクロピペットのチップを精密ピンセットでカットし、ショルダーの開始点からチップの先端までが6 mmになるように調整します。その後、注入用のFast Greenを含むDNA溶液を1 µL、マイクロピペットに吸い込みます。丸いピンセットで胚の頭部を固定します。正中線付近に位置する側脳室を狙い、ピペットを45度の角度で脳に挿入します。針が脳室を貫通した場合は、ゆっくりとピペットを後退させます。溶液が充填され始めると、脳室が緑色に変わります。この時点でピペットの移動を止め、1 µLのDNAを注入します。その後、ピペットをゆっくりと引き抜きます。ECM 830 エレクトロポレーターを、パルス幅 50 milliseconds、パルス間隔 950 milliseconds の 5 45 volt パルスに設定します。効率的な電流伝達を確実にするため、5 millimeter パドル電極を PBS に浸します。次に、電極パッドを胚の頭部の周囲に配置し、DNA溶液が含まれる脳室の上に陽極パッドを置きます。神経節隆起を介して腹側方向に電流が流れるように、陽極パッドを陰極パッドよりもわずかに低い位置に配置します。これにより、傍外套細胞における異所性発現を最小限に抑えることができます。フットペダルを1回押し、パルスを与えます。その後、電極を取り外してきれいに拭き取ってください。すべての胚に対して同様の手順を繰り返します。すべての胚への電気穿孔が完了した後、腹腔内にPBSを3 mL注入し、胚を腹腔内に戻します。次に、曲針と5-0シルク縫合糸を用いて腹壁を縫合し、続いて皮膚を縫合します。創部にリドカインを塗布し、鎮痛目的として初回の鎮痛剤としてアスピリンを120 mg/kg投与します。麻酔チューブから動物を取り出し、ペーパーワイプを敷いたヒーティングパッドの上で回復させます。その後、動物をケージに戻します。37 °Cのヒーティングパッド上に保持し、健康状態を観察します。本実験では、エレクトロポレーションを施した介在ニューロンを、CGE由来サブタイプのマーカー発現によって識別します。この画像は、CGE由来の介在ニューロンにDLX5/6 EGFPプラスミドがエレクトロポレーションされていることを示しています。この画像は、P8におけるVIP発現介在ニューロンを示しています。EGFPの発現により、単一ニューロンの樹状突起および軸索の全貌が描き出されており、こちらがP8におけるNPY発現インターニューロンです。NPYの発現はニューログリア形成細胞を規定しています。最後に、こちらがP15におけるNPY発現インターニューロンです。この手法に習熟し、適切に実施すれば、20分で完了させることができます。特定のプラスミドと遺伝子組換えマウス系統を組み合わせることで、目的遺伝子の発現を時間的および空間的に制御することが可能です。一部の実験では、AU依存性トランスジェンの発現を誘導するためにA-D-L-X-T-T-Aプラスミドを使用しています。これらの実験では、ドキシサイクリンを投与することにより、導入遺伝子の発現をサイレンシングさせました。

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JoVE Journal

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神経科学

子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin...

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

このビデオは、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンの両方で、さまざまなin...

器官型脳スライス培養におけるシングルセルエレクトロポレーション:脳海馬スライスの標的ニューロン内にプラスミドを送達するためのIn vitro技術

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。...

新生児軟膜表面エレクトロ

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

ここでは、初期産後マウスの皮質に移植された皮質間ニューロン前駆体の活性を操作するために化学遺伝学的ツールを使用するように設計されたプロトコルを提示する。...

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。...

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。...

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

学ぶ マウス前脳の皮質介在ニューロンサブタイプ選択的エレクトロポレーション法。子宮内電気穿孔により特定の介在ニューロンに遺伝子発現を標的化し、発達神経科学の研究に応用できます。

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

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