皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。

この手順の全体的な目標は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス4脳のインターニューロンを標的とすることです。これは、最初に注射針を準備することによって達成されます。2番目のステップは、麻酔をかけた動物から胚鎖を取り除くことです。

その後、脳内でDNA注入とエレクトロポレーションを行います。最後のステップは、動物が手術から回復するのを許可することです。最終的に、子宮内では、エレクトロポレーションを使用して、ニューロン間のサブタイプを選択的に標的化することができます。

私たちの既存の技術のこれらの方法の利点は、子宮内電気操作の非特異的な操作と同様に、皮質間ニューロンのサブセットの細胞自律解析を実行する手段を提供することです。高レベルのGFP発現により、単一のインターの可視化と分析が可能になります。この方法は、成熟期の統合を支配するルールが何であるかなど、神経発達分野の基本的な質問に答えるのに役立ちます。

この手順を開始するには、ピペットプーラーでガラスキャピラリーを引っ張ってマイクロインジェクションピペットを準備します。次に、毛細血管を慎重に取り外し、マイクロインジェクション用の下部の針を収集します。次に、麻酔をかけた妊娠中のマウスの腹側を上にして、加熱パッドに置きます。

手術中ずっとisofフッ素を供給し続けるマスクでその運命を覆います。次に、両目にアイローションを塗ります。加熱パッドを摂氏36度に設定して、その後の低体温症を防ぎます。

後足または尻尾をつまんで、足と尾の反射神経がないことを確認します。次に、腹部の皮膚を70%エタノールできれいにします。鉗子を使用して皮膚を上に引っ張ります。

次に、乳腺の3番目と4番目のペアの中間から、正中線に沿って2センチメートルの小さな垂直切開を行います。丸い鉗子を使用して腹壁を傷つけないように注意してください。胚鎖を空洞からそっと引き離します。

チェーンをウェットティッシュの上に置きます。子宮の半分を露出させることから始めます。次に、胚のエレクトロポレーションに進み、残りの半分に進みます。

この手順では、標準的なマキシ調製精製プロトコルから得られたペレットを蒸留水に溶解してDNA溶液を調製します。次に、DNA溶液に1対20の比率でファストグリーンを添加して、注入中の可視化を可能にします。次に、細い鉗子で事前に引っ張ったマイクロピペットの先端をカットして、肩の始まりから先端の先端まで6ミリメートル空けます。

その後、マイクロピペットに1マイクロリットルのDNA溶液を注入用の速乾グリーンでロードします。丸いピンセットで胚の頭を持ちます。ピペットを脳に45度で挿入し、正中線の近くにある側脳室を狙います。

針が心室を貫通する場合は、ピペットをゆっくりと引っ込めます。溶液が心室を満たし始めると、心室は緑色に変わります。この時点で、ピペットの移動を停止し、1マイクロリットルのDNAを注入します。

その後、ピペットをゆっくりと引き出します。ECM 8 30 ator を 50 ミリ秒間隔の 5 つの 45 ボルト パルスに 950 ミリ秒の間隔で設定します。5mmのパドル電極をPBSに浸して、効率的な電流伝送を確保します。

次に、DNA溶液を含む心室に正のパドルを付けて、電極を胚の頭の周りに置きます。ポジティブパドルをネガティブパドルよりわずかに低く置き、神経節の隆起部に腹側電流を作り出します。これにより、パラメタル細胞での異所性発現が最小限に抑えられます。

次に、フットペダルを一度押してパルスを送り、電極を取り外してきれいに拭きます。各胚に対して手順を繰り返します。すべての胚をエレクトロペリングした後。

3ミリリットルのPBSを腹腔に注ぎ、胚を腹腔に戻します。次に、湾曲した針と5OHシルク縫合糸で腹壁を縫合し、次に皮膚を縫合します。傷口にリドカインを塗布し、鎮痛のためにアスピリン1キログラムあたり120ミリグラムを最初に投与します。

動物を麻酔チューブから取り外し、紙拭きの上で加熱パッドを回復させます。その後、動物をケージに戻します。摂氏37度で加熱パッドに置いて、健康状態を監視します。

この実験では、エレクトロポレーションされたニューロン間を、CGE E由来のサブタイプマーカーの発現によって描写します。この画像は、CGE由来のインターニューロンがDLX five six EGFPプラスミドでエレクトロポレーションされていることを示しています。この画像は、P 8でニューロン間を発現するVIPを示しています。

EGFPの発現は、単一のニューロンの樹状突起と軸索樹状突起全体を描写し、ここにはP 8でニューロン間を発現するNPYがあります。NP y発現は、神経膠細胞を形成する。最後に、P15でニューロン間を発現するNPYを示します。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば20分で完了します。特異的なプラスミドと遺伝子改変マウス系統の使用を組み合わせることで、目的遺伝子の発現を時間的かつ特異的に制御することが可能になります。いくつかの実験では、A-D-L-X-T-T-Aプラスミドを使用してAU依存性導入遺伝子の発現を誘導します。

これらの実験では、ドキシサイクリンを投与することにより、導入遺伝子の発現をサイレントにします。