二光子 in vivoで間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング
2014年5月12日
Time-lapse imaging は、無傷の脳の構造的再編成に関する貴重な情報を提供します。ここでは、2光子顕微鏡法により、生きたマウス皮質の蛍光標識シナプス構造の経頭蓋イメージングを可能にする薄鼓頭蓋骨製剤を紹介します。
この手順の全体的な目標は、2光子顕微鏡法によって生きているマウス皮質の蛍光標識シナプス構造である経頭蓋イメージングを可能にすることです。マウスに麻酔をかけた後の最初のステップは、薄くなった頭蓋骨の準備を行うことです。次に、カスタムメイドの保持プレートを使用してマウスの頭を固定します。
次に、2つの光子顕微鏡を使用して、薄くなった頭蓋骨を通して画像スタックを取得します。最終的には、再配置とイメージングです。以前に画像化された領域により、樹状突起スパインのダイナミクスをさまざまな条件下でさまざまな期間にわたって追跡することができました。
手術の準備として、マウスにケタミンとキシラジンを麻酔し、つま先をつまんで完全な麻酔を確保します。次に、マウスを加熱パッドに置き、かみそりの刃を使用して頭を剃ります。交互のアルコールパッドで皮膚を拭いて、剃った部分を滅菌し、残っている髪の毛の切り抜きを取り除きます。
また、両目にやさしく眼軟膏を塗ります。次に、頭皮の正中線に沿ってまっすぐに切開し、皮膚を頭蓋骨の端に向かって横方向に動かします。次に、頭蓋骨に付着している結合組織を取り外して、薄くなった頭蓋骨の準備を開始します。
まず、正中線とbgmaに対する相対的な位置に基づいて、目的のイメージング領域を特定します。次に、頭蓋骨を生理食塩水で湿らせて血管系を観察し、血管の透過を遮断して画像構造をぼやけさせるため、血管が大きな領域で頭蓋骨が薄くならないようにします。直径0.5〜1ミリメートルの領域を選択したら、高速マイクロドリルを使用して頭蓋骨の円形領域を薄くします。
ドリルを頭蓋骨に当てて押し下げるのではなく、頭蓋骨の表面と平行に動かして、過熱による損傷を防ぎます。外側のコンパクトな骨層と中央の海綿状骨層の両方が除去されるまで、ドリルビットとスカルドリルの間の長時間の接触を避けてください。次に、約45度に保持された顕微手術用ブレードを使用して、ドリルが薄くなった領域の中央にある内側のコンパクトな骨層を薄くします。
直径200〜300マイクロメートル、厚さ約20〜30マイクロメートルの均一に薄くなった領域が得られるまで、頭蓋骨を押し下げずに頭蓋骨をこすり落とします。頭蓋骨が十分に薄くなったら、骨の破片を慎重に取り除きます。次のステップは、テープで覆われた鋭いエッジを持つかみそりの刃から作られたヘッドプレートを取り付けることです。
まず、ヘッドプレートの中央の開口部の各端にシアノアクリレート接着剤を少量ずつ入れます。次に、ヘッドプレートを薄くなった領域の中央に配置します。頭蓋骨にしっかりと当てます。
次に、頭蓋骨の側面からヘッドプレートの中央の開口部の端まで皮膚をそっと引っ張ります。ヘッドプレートを所定の位置に1〜2分間保持します。次に、ヘッドプレートが頭蓋骨にしっかりと取り付けられるまで、さらに8〜9分待ちます。
10分後、ヘッドプレートを保持プレートの2つの側面ブロックに置きます。次に、ヘッドプレートの端でネジを締めて、マウスを保持プレートに固定します。マウスの頭を解剖顕微鏡で観察し、マウスの背中をそっとパッドして、頭が適切に固定されていることを確認します。
次に、露出した頭蓋骨を生理食塩水で洗い流し、重合していない接着剤を取り除き、以前に画像化された領域を再配置します。その後のイメージングセッションでは、露出した頭蓋骨の薄くなった領域の血管系の写真を撮ります。これはマップ1と呼ばれます。次に、マウスをイメージング顕微鏡の下に置き、10 x air対物レンズの下の薄くなった領域を見つけます。
落射蛍光を使用して、最も薄い領域をビューの中央に移動します。次に、頭蓋骨の上部に生理食塩水を一滴加え、60 xの目標に切り替えます。個々の樹状突起スパインが樹状突起に沿ってはっきりと見える領域を選択します。
マップ1で対応する領域を特定し、ラベル付けします。これにより、エピ蛍光ビューと血管系写真の血管系を比較します。次に、フルオロ4に従って2光子レーザーの波長を調整します。次に、60 x 対物レンズを使用して、Z 軸に沿って 2 マイクロメートル ステップで画像スタックを取得し、約 200 マイクロメートル x 200 マイクロメートルの領域をカバーします。
これはマップ2として指定され、その後のイメージングセッション中に画像樹状突起セグメントを再配置するために使用されます。次に、3 x デジタル ズームを使用して、マップ 2 内の 9 つの画像スタックを取得します。各画像スタックは、Z 軸に沿って 0.7 マイクロメートル刻みで、約 70 マイクロメートル x 70 マイクロメートルの領域をカバーします。
イメージング後、ヘッドプレートを頭蓋骨からそっと取り外します。次に、顕微手術用ブレードを使用して、頭蓋骨から残っている接着剤を取り除きます。次に、頭蓋骨と皮膚を生理食塩水で数回すすぎ、滅菌外科用縫合糸で頭皮を縫合します。
回復中は、動物を別のケージの温熱パッドに保管し、術後の痛みに対してブプレノルフィン鎮痛薬を皮下投与します。.完全に回復した後、動物をホームゲージに戻します 別の日に樹状突起を再画像化するには、動物に麻酔をかけ、頭蓋骨を露出させます。先ほどと同様に、頭部プレートを取り付けて保持プレートに取り付けて頭部固定を繰り返します。
次に、血管系パターンをマップ1と比較し、樹状突起分岐パターンをマップ2と比較することにより、以前に画像化された領域を特定します。1週間以内に再イメージングを行えば、新たに成長した骨の薄層を顕微手術用ブレードで除去することができます。1週間以上後に再イメージングを行う場合は、まずマイクロドリルを使用し、次にマイクロサージカルブレードを使用して頭蓋骨を薄くします。
次に、2つの光子顕微鏡で位置と向きを調整して、以前に撮影した画像スタックと一致する画像スタックを取得します。画像を取得した後、マウスを回復させて以前と同様にケージに戻すと、マップ1として指定された薄い頭蓋骨領域を囲む血管パターンの画像を使用して、その後のすべてのイメージングセッションを参照します。ブラックボックスは、2つの光子in vivo画像が取得された領域を示しています。
生後1か月のマウスの運動皮質にある樹状突起枝のこの画像は、マップ2に指定されています。白いボックスは、イメージング用に選択された樹状突起セグメントを示しています。時間の経過とともに、0日目、2日目、4日目、および8日目に同じ樹状突起セグメントの2つの光子イメージングが行われました。
新しく形成された棘。すなわち、前回のイメージングセッションには存在しなかったスパインは矢印で示され、イメージングセッションの間に排除されたスパインは矢印で示される。フィリップ・ポディアは、習得すると星で示されます。
この手法は、適切に実行すれば1〜2時間で実行できます。
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概要
本記事では、2光子顕微鏡を用いて、生存マウスの大脳皮質において蛍光標識されたシナプス構造を経頭蓋的にイメージングする方法を提示します。薄い頭蓋骨標本（thinned-skull preparation）を用いることで、無傷の脳における構造的な再編成を長期的に詳細に観察することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- シナプスダイナミクス
背景
- シナプス構造の理解は、神経科学研究において極めて重要です。
- 従来のイメージング手法では、in vivoでの観察が困難な場合があります。
- 2光子顕微鏡は、高解像度のイメージング能力を提供します。
- 薄頭蓋骨標本作製法は、このようなイメージングのための新しいアプローチです。
研究目的
- 生存マウスにおけるシナプス構造の経頭蓋イメージングを可能にする。
- 樹状突起スパインの時間的なダイナミクスを観察する。
- 脳内の構造的再編成に関する研究を促進する。
使用した手法
- マウスの麻酔。
- 頭蓋骨薄層化処置の実施。
- カスタム固定プレートを用いたマウス頭部の固定。
- 二光子顕微鏡を用いた薄層化した頭蓋骨経由の画像スタックの取得。
主な結果
- 蛍光標識されたシナプス構造のイメージングに成功したこと。
- 樹状突起棘のダイナミクスを時間経過とともに追跡できること。
- 生存マウス皮質における構造的変化に関する知見。
- 薄層頭蓋骨標本（thinned-skull preparation）の有効性の実証。
結論
- 頭蓋骨薄層化法は、神経科学研究において非常に有用な手法である。
- 2光子顕微鏡を用いることで、詳細なin vivoイメージングが可能になる。
- この手法により、シナプスダイナミクスへの理解を深めることができる。
よくある質問
産業上の重要性
マウス皮質の樹状突起棘における高解像度二光子in vivoイメージングにより、シナプスの構造動態を時間経過とともに直接観察することが可能となり、神経生物学的な発見におけるメカニズムのリスク低減が支持されます。このアプローチは、CNS（中枢神経系）創薬ポートフォリオにおけるターゲット検証および経路解析に対して、予測的な信頼性を提供します。本手法の再現性と低侵襲性は、トランスレーショナルな連続性に不可欠な縦断的研究を容易にします。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- シナプスのリモデリングを直接的に可視化でき、標的への結合（ターゲットエンゲージメント）およびパスウェイの関連性を判断することが可能になる。
- 疾患に関連する神経回路におけるシナプス可塑性メカニズムの機能的検証をサポートする。
- 樹状突起スパインのダイナミクスを反復的かつ定量的に評価することで、メカニズム面のデリスキング（リスク低減）を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 化合物がシナプス構造に及ぼす影響を評価するための、検証済みin vivo系を提供します。
- 異なる条件下での比較解析に適した、再現性のある定量的なイメージング出力を可能にします。
- 複数回のセッションにわたって同一の樹状突起セグメントをマッピングおよび再特定することで、アッセイの標準化をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 生理学的および病理学的状態における様々な皮質領域および細胞型のイメージングを可能にすることで、疾患関連モデルとの整合性を図ります。
- 長期的なシナプス変化の追跡により、縦断的なバイオマーカー研究を促進します。
- 堅牢で再現性のあるin vivo測定を通じて、リスクを調整した開発進展の意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このイメージングプロトコルは、発見から前臨床に至る連続的なプロセスに組み込まれており、初期のメカニズム研究と、CNS（中枢神経系）ポートフォリオにおけるトランスレーショナルリサーチを橋渡しするものです。
- 探索生物学： シナプス変化の直接観察を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 生体神経組織における化合物の評価に、再現性のある定量的なイメージングデータを提供します。
- 分析： 統計的比較のためのハイコンテンツ画像スタックおよび定量的なスパインターンオーバー指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 同一個体において、異なる時点および条件下での反復イメージングを可能にすることで、連続性を確保します。
- 企業の再利用： 多様なCNS標的、細胞型、および疾患モデルに適用可能な、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： シナプス標的の検証における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを低減する。
- 運用的価値： in vivo イメージングのワークフローを標準化し、研究間での再現性を向上させる。
- 戦略的価値： 強固な縦断的データ収集を可能にすることで、go/no-go 判断の質と資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けを行い、CNSプログラムの推進を支援する。
実施上の検討事項
- 2光子顕微鏡および小動物の手術技術に関する専門知識が必要です。
- 高度なイメージング装置およびカスタム製の頭部固定器具へのアクセスが不可欠です。
- 縦断的研究には、セッション間での厳密なマッピングと標準化が必要です。
- プロトコルでサポートされている範囲内であれば、さまざまな皮質領域、層、および細胞型に適応可能です。
- 精密な頭蓋骨の薄層化が必要であること、および時間の経過とともに骨が再成長する可能性があることが制限となります。
