Name: 二光子 in vivoで間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ二光子顕微鏡を用いたマウス皮質の樹状突起棘イメージング法。間引き頭蓋骨準備により生体内でシナプス構造の動態を長期観察し、神経可塑性研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、図解のためにジェームス·ペルナに感謝します。この作品は、YZに国立精神衛生研究所からの補助金によって支えられて

承認は、手術およびイメージング調査の開始前にホーム機関から取得する必要がある。この原稿に記載された実験は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校施設内動物管理使用委員会からのガイドラインと規則に従って行った。 1。手術<ol><li>すべての手術器具をオートクレーブ徹底的に手術前に70％アルコールでワークスペースを殺菌。 </li><li> KX麻酔溶液（200 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgのキシラジン）の腹腔内（IP）注射によりマウスを麻酔マウスの体重に応じて注：KXの投与量は、健康状態は、歪み、年齢に応じて調整されてもよく、マウスの。最適な用量を決定するために獣医の相談にもお勧めします。 </li><li>マウスの足の指を押し、麻酔の状態を監視するために反射的応答を確認することにより、定期的につま先のピンチテストを実行します。マウスが完全に手術を開始する前に麻酔をかけていることを確認してください。長時間のイメージングセッション中、必要に応じて追加のKXを管理、定期的に、マウスの麻酔状態を確認してください。 </li><li>手術中体温を維持するために、加熱パッドの上にマウスを置く。 </li><li>頭皮を露出させるためにカミソリの刃を使用して、マウスの頭部を剃る。 </li><li>アルコールパッドとベタジン交互で皮膚を拭いて剃毛面積を殺菌。残留髪の切り抜きを削除します。 </li><li>そっとそのため実験中に脱水症状に起因する永久的な損傷を防止し、両眼を潤滑する眼軟膏を適用します。 </li><li>頭皮の正中線に沿ってまっすぐに切開を行い、頭蓋骨の端に向かって横方向に皮膚を移動します。 </li><li>頭蓋骨に付着した結合組織を除去します。 </li></ol> 2。間引き頭蓋骨の準備<ol><li>アイドルマスターに基づいて撮像領域を特定。eotaxic座標注：大血管、ブロックライトの浸透を回避し、画像化された構造をぼかすようにしてください。頭蓋骨は、滅菌生理食塩水で湿っているとき、血管系は最もよく観察される。 </li><li>頭蓋骨の薄い円形領域（0.5〜直径）に高速マイクロドリルを使用してください。むしろ頭蓋骨に対してそれを保持し、押し下げなく、頭蓋骨の表面にドリル平行に移動。外側の緻密骨層と中間海綿骨層の両方になるまでドリルが削除されます（注）。ドリルビットと頭蓋骨の間に長時間の接触を避けるため、過熱による損傷を防ぐため。 </li><li>ドリル薄くなった領域の中心にある顕微刃で内側の緻密骨層を薄くし続ける。均等におおよその厚さの小さな領域（200〜300ミクロン径）に薄くなるまで頭蓋骨に対して押し下げずに頭蓋骨をこすり取る際には、約45度の角度で顕微ブレードを保持するLY、20〜30程度が得られる。による頭蓋骨の自己蛍光を、厚さが二光子顕微鏡下で頭蓋骨の上面と下面との間の距離を走査することによって測定することができる注：20μm未満の頭蓋骨の厚さは、良好な結像品質を提供するが、それはその後の再イメージングセッションで間引き処理を困難にするので、それはお勧めしません。オーバー間伐ないようにするには、頭蓋骨の厚さは、（説明を参照）、手術中に定期的にチェックする必要があります。 </li></ol> 3。固定化<ol><li>丁寧に骨片を除去。 </li><li>オートクレーブ処理された無菌のヘッドプレートの中央開口部の各エッジにシアノアクリレート接着剤の小滴（ 図1参照 ）を配置します。開口部注意の中心に位置して薄くなった地域で頭蓋骨にしっかりとヘッドプレートを保持する：接着剤が薄くなったRを汚染した場合偶然egion、顕微刃で慎重に取り除いてください。 </li><li>優しくヘッドプレートの中央開口部のエッジに頭蓋骨の側面から肌を引き出します。 </li><li>ヘッドプレートはよく頭蓋骨に装着されるまで、約10分待ちます。 </li><li> （ 図1を参照）保持板の2の横方向のブロックにヘッドプレートを配置し、保持板上にマウスを固定化するために、ヘッドプレートの縁の上にネジを締め注：。の間には、皮膚やウィスカーがないことを確認してくださいネジを締める前に、ヘッドプレートとブロック。動物の背中を優しく撫でているときは良いの固定化の準備は解剖顕微鏡下で頭蓋骨の観察可能な動きを示さないはずである。 </li><li> 。未重合接着剤を除去するために生理食塩水でさらさ頭蓋骨をすすぎ注：未重合接着剤は、画像をぼかしや損傷がある目的を顕微鏡としてそれは、残りの接着剤を除去することが重要である&lt;。/李&gt; </ol> 4。イメージング<ol><li> （ 図2参照）、その後のイメージングセッションで画像化された領域を再配置するために使用されているマップ1、のように薄くなった領域と露光され頭蓋骨の血管系の写真を撮る。 </li><li>イメージング顕微鏡下でマウスを置きます。エピ蛍光を使用して10倍の空気目的の下に薄型化エリアの位置を確認し、ビューの中心に最も薄いエリアを移動します。 </li><li>頭蓋骨の上に生理食塩水を一滴を追加し、滅菌水でリンスされた60Xの対物レンズに切り替える。個々の樹状突起棘がはっきりと樹状突起に沿って視覚化された領域を選択します。落射ビューと血管系写真間の血管系を比較することにより、地図上の1対応する領域を特定し、ラベルを付ける。 </li><li>チューン二光子レーザー波長フルオロフォアに記載の方法。例えば、YFPのための920ナノメートル; GFPについて890 nmの;のDsRedとtdTomato 24 1,000 nmの。 </li><li> 2で画像スタックを取得60Xの対物レンズを使用して、z軸に沿って以下の手順。この画像スタックは、約200ミクロン×200ミクロンの領域（512×512ピクセル）をカバーし、（ 図2を参照）、その後のイメージングセッション中に再配置するためのマップ2として使用される。 </li><li> 3倍デジタルズームを使用して、マップ2内の9画像スタックを取得。各画像スタックは、z軸に沿って0.7μmのステップで、70ミクロンX 70ミクロン（512×512ピクセル）のおおよその領域をカバーしています（注）。光毒性を最小限にするために、サンプルで測定した場合、レーザーの強度は40ミリワット以下でなければならない。 </li></ol> 5。復旧<ol><li>イメージングの後、静かに頭蓋骨からヘッドプレートを取り外す。 </li><li>徹底的に頭蓋骨と、残りのすべての接着剤を除去するために、皮膚をきれい注：お肌に残りの接着剤は炎症を引き起こし、頭蓋骨に残っている接着剤は頭蓋骨の浸食となりますしながら、皮膚の治癒が遅くなります新しく成長した骨層にngiogenesis、その後の移転と再結像が困難になる。 </li><li>生理食塩水で数回頭蓋骨と皮膚を洗い流す。 </li><li>無菌手術用縫合糸で頭皮を縫合。 </li><li>別々のケージに加熱パッド上に動物を保管してください。術後疼痛を軽減するためにブプレノルフィンの鎮痛薬（0.1 mg / kg）を皮下投与する。完全に回復した後にホームケージに動物を返します。切開が治癒され、縫合糸が削除されるまで、（少なくとも一日一回チェックしてください）​​密接に動物を監視します。必要に応じてブプレノルフィン鎮痛剤のその後の注射を管理します。 </li></ol> 6。再イメージ<ol><li>繰り返して1.1〜1.8を繰り返します。 </li><li>手順を繰り返し3.1から3.6 </li><li> 1をマッピングするために、血管系のパターンと2をマッピングするために、樹状分岐パターンを比較することで、以前に撮影領域の位置を確認します。 </li><li>再結像は1週間以内に行われた場合、再薄肉の上に新しく成長した骨の薄層を除去するために、ステップ2.3を繰り返す顕微ブレードを使用して祇園。再結像は1週間以上後に行われた場合、ステップ2.2および2.3の両方を繰り返す注：新しく成長した骨層は画質の低下をもたらす元の緻密骨層に比べて少ない縮合型構造からなる。したがって、同じ品質を取得するためには、頭蓋骨以前撮像セッションよりも若干薄くする必要がある。 </li><li>以前は二光子顕微鏡で画像スタックを取っ一致画像スタックを取得する位置及び姿勢を調整する。 </li><li>ステップ4.6のように画像を取得する。 </li><li>繰り返しは、撮影後に5.1から5.5を繰り返します。 </li></ol>

<ol><li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).</li>
<li>Yu, X., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+plasticity+in+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spine plasticity in the motor cortex.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).</li>
<li>Harms, K. J., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+plasticity%3A+looking+beyond+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine plasticity: looking beyond development.</a> Brain research. 1184, 65-71 (2007).</li>
<li>Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+and+long-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines and long-term plasticity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).</li>
<li>Tada, T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.</a> Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature protocols. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Szu, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cortical+window+technique+for+in+vivo+optical+coherence+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462, 915-919 (2009).</li>
<li>Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+motor+learning+induces+coordinated+formation+of+clustered+dendritic+spines+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo.</a> Nature. 483, 92-95 (2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+instability+and+insensitivity+to+modulation+by+sensory+experience+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).</li>
<li>Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+in+microglia+regulates+brain+amyloid+deposition+through+selective+protofibrillar+amyloid-beta+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis.</a> J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+sensory+loss+on+glial+cells+in+mouse+visual+and+auditory+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices.</a> Glia. 60, 541-558 (2012).</li>
<li>Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolus+extravasation+is+an+alternative+mechanism+for+cerebral+microvascular+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization.</a> Nature. 465, 478-482 (2010).</li>
<li>Kelly, E. A., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+imaging+of+mouse+visual+cortex+using+a+thinned-skull+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+glioma+initiation+in+vivo+through+a+polished+and+reinforced+thin-skull+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).</li>
<li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

成功間引き頭蓋骨の準備を取得するには、このプロトコルにはいくつかのステップが重要である。 1）頭蓋骨の厚さ。頭蓋骨は、高密度緻密骨と低密度海綿骨の中間層の2層、サンドイッチ構造を有する。高速マイクロドリルは緻密骨と海綿骨の外側の層を除去するのに適しているが、顕微ブレードは緻密骨の内側の層を薄くするのに最適です。開発中に頭蓋骨の厚さが増加すると剛性ように、成体マウスのイメージングは​​、良好な品質の画像を得るために除去するより多くの骨を必要とする。薄くなった領域は、透明な固体の外観を示し、頭蓋骨の厚さは約20〜30程度である場合に、良好な画像品質を提供します。オーバー間伐は、その後の再イメージングセッションで間引き処理を困難にするように頭蓋骨の厚さは間引き処理中に定期的にチェックする必要があります。 2）薄くなった領域のサイズ。これは、円錐状の空洞が達成され、安定した間引き頭蓋骨の構成を確立することが重要である。適当な大きさに薄くなった領域のアーキテクチャは、大脳皮質の損傷を引き起こし、その後の再イメージングセッションで間伐ができます防ぐことができます。それは、一番上の開口部（直径約0.5〜1.0ミリメートル）よりも小さい薄くなった領域の...

哺乳類の大脳皮質は、知覚と運動制御から抽象情報処理や認知に、多くの脳機能に参加しています。種々の皮質の機能は、個々のシナプスで情報を通信し、交換する異なるタイプのニューロンから構成されている異なる神経回路上に構築。シナプスの構造および機能は、一貫して経験や病状に応じて変更される。成熟した脳では、シナプス可塑性、機能性神経回路の形成と維持に重要な役割を果たして、両方の強さが変化し、シナプスの追加/削除の形をとる。樹状突起棘は、哺乳類の脳における興奮性シナプスの大多数のシナプス後要素である。一定の売上高および棘の形態学的変化は、シナプス結合1-7において変更が良い指標となると考えられている。 二光子レーザー走査マイクロSCOPYは厚く、不透明な準備と、無傷の脳8でのライブイメージングのために適しています、低光毒性を通じて深い浸透を提供しています。蛍光標識との組み合わせでは、2光子イメージングは​​、生きている脳に覗くと、高い空間分解能と時間分解能を有する個々のシナプスにおける構造的な再編成を追跡する強力なツールを提供しています。様々な方法がライブイメージングのために9-13匹のマウスを作製するために使用されている。ここでは、マウスの皮質におけるシナプス後樹状突起棘の構造的可塑性を調べるためのin vivo二光子イメージングの間引き頭蓋骨の調製を記載する。このアプローチを使用して、我々の最近の研究では、蛍光標識された神経細胞のサブセットおよびin vivo標識技術の急速な発展に伴い、トランスジェニック動物の増加可用性を使用した学習運動技能に応じて、樹状突起棘の変更のダイナミックな絵を描かれているが、ここで説明するのと同様の手順を適用することもできますinvestigaへteの他の細胞型および皮質領域、他の操作と組み合わせ、ならびに疾患モデル16-23で使用した。

<table><tbody><tr><td>ケタミン</td><td>バイオニッチファーマ</td><td>67457-034-10</td><td>麻酔用キシラジンと混合</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド研究所</td><td>139-236</td><td>麻酔用ケタミンと混合</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ホスピーラ</td><td>0409-7983-09</td><td>0.9%NaCl注射およびイメージング用</td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72000</td><td>両刃ステンレス鋼のカミソリの刃</td></tr><tr><td>アルコールパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-669-62</td><td>滅菌アルコール調製パッド</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>ヘンリー・シャイン</td><td>102-9470</td><td>ワセリン眼軟膏 滅菌眼潤滑剤</td></tr><tr><td>高速マイクロドリル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-17</td><td>高速マイクロドリルは、コンパクトな骨の外層を薄くし、小さな領域をターゲットにするのに適しています</td></tr><tr><td>マイクロドリルスチールバリ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-14</td><td>直径1.4 mm</td></tr>の<tr><td>顕微手術ブレード</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>顕微手術ブレードは、海綿状骨の密骨と中層の内層を薄くするのに適しています</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9062131</td><td>頭蓋骨にヘッドプレートを固定</td></tr>します <tr><td>縫合</td><td>糸 Havard 装置</td><td>510461</td><td>非吸収性、滅菌シルク縫合糸、6-0モノフィラメント</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>インフィニティ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二光子顕微鏡</td><td>プレーリーテクノロジー</td><td></td><td>ズ ウルティマIV</td></tr><tr><td>10倍対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>NA 0.30、空気</td>60倍対物レンズ オリンパス<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>NA 1.1、IR透過性、水浸</td></tr><tr><td>チタンサファイアレーザー</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>醍醐味HP</td></tr></tbody></table>

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

哺乳類の大脳皮質では、神経細胞がシナプスで非常に複雑なネットワークや情報交換を形成している。シナプス強度、ならびにシナプスの追加/削除の変化は、神経可塑性の構造的基礎を提供する、経験依存的な様式で起こる。大脳皮質で最も興奮性シナプスのシナプス後構成要素として、樹状突起棘はシナプスの良いプロキシであると考えられている。マウス遺伝学および蛍光標識技術、個々のニューロンのシナプスの構造およびそれらの撮影の利点は、無傷の脳内で標識することができる。ここでは、 生体内での経時的蛍光標識後シナプス樹状突起棘に追従する二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、経頭蓋撮影プロトコルを導入する。このプロトコルは、完全な頭蓋骨を保持し、髄膜および皮質の曝露によって引き起こされる炎症作用を回避間引き頭蓋骨の準備を利用する。そのため、画像はSUの直後に取得することが可能rgeryが実行されます。実験手順は、数時間から数年の範囲の様々な時間間隔で繰り返し行うことができる。この調製物の適用はまた、生理学的および病理学的条件下で、異なる皮質領域、層、ならびに他の細胞型を調査するために拡張することができる。

YFP-Hラインマウス25で、黄色蛍光タンパク質は、皮質の表層への先端樹状突起を投影V層錐体細胞のサブセットで表現しています。間引き頭蓋骨の製剤を介して、蛍光標識された樹状セグメントは、繰り返し時間から数ヶ月の範囲の、種々の撮像間隔で二光子顕微鏡で画像化することができる。ここでは、個々の棘だけでなく、糸状仮足は明らかに樹状突起に沿って可視化することができる1ヶ月のマウスの運動皮質での8日間の同じ樹状突起の4時間イメージングの一​​例を示す。通常、画像スタックの深さは約100〜200μmの軟膜表面からである。種々の分析は、これらの画像に基づいて行うことができる。例えば、スパイン形成、脱離および代謝回転は、異なるセッションからの画像を比較することによって定量することができる。棘密度はdendritの長さによってスパインの数で割ることによって計算することができる。ICセグメント。脊椎の運動性および形態の変化も分析することができる。 <img alt="図1" fo:content-widt...

生きている動物のTime-lapse imaging は、無傷の脳の構造的再編成に関する貴重な情報を提供します。ここでは、2光子顕微鏡法により、生きたマウス皮質の蛍光標識シナプス構造の経頭蓋イメージングを可能にする薄鼓頭蓋骨製剤を紹介します。

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

この手順の全体的な目的は、2光子顕微鏡を用いて、生きたマウス皮質における蛍光標識されたシナプス構造の経頭蓋イメージングを可能にすることです。マウスを麻酔させた後、最初に行うステップは頭蓋骨を薄くする処置（thinned skull preparation）です。次に、特製の固定プレートを用いてマウスの頭部を固定します。その後、2光子顕微鏡を用いて、薄くした頭蓋骨越しに画像スタックを取得します。最終的に、以前に撮影した領域を再特定して画像化することで、さまざまな条件下で異なる期間にわたる樹状突起スパインのダイナミクスを追跡することが可能になります。手術の準備として、ケタミンとキシラジンでマウスを麻酔し、足指へのピンチ刺激を行って完全に麻酔されていることを確認します。次に、マウスをヒートパッドの上に置き、カミソリで頭部を剃毛します。アルコール綿で皮膚を交互に拭き、剃毛部位を滅菌し、残った被毛を除去します。また、両眼に眼軟膏を緩やかに塗布します。次に、頭皮の正中線に沿って直線的に切開し、皮膚を頭蓋骨の端に向かって側方に移動させます。その後、頭蓋骨に付着している結合組織を除去し、薄層頭蓋骨標本の作製を開始します。まず、正中線およびbgmaに対する相対的な位置に基づいて、目的のイメージング領域を特定します。次に、血管の状態を観察するために生理食塩水で頭蓋骨を湿らせます。これは、太い血管がある領域で頭蓋骨を薄くすることを避けるためです。血管は光の透過を妨げ、画像の構造をぼやけさせる原因となります。直径0.5〜1 mmの領域を選択した後、高速マイクロドリルを使用して、頭蓋骨の円形領域を薄くします。過熱による損傷を防ぐため、ドリルを頭蓋骨に押し付けるのではなく、頭蓋骨の表面に平行に移動させます。外側の緻密骨層と中間の海綿骨層の両方が除去されるまで、ドリルビットを頭蓋骨の穿孔部位に長時間接触させないようにしてください。次に、マイクロサージカルブレードを約45度に保持し、ドリルで薄くした領域の中心にある内側の緻密骨層をさらに薄くします。頭蓋骨を強く押し付けないようにスクレイピングし、直径200〜300 µm、厚さ約20〜30 µmの均一に薄くなった領域が得られるまで行います。頭蓋骨が十分に薄くなったら、骨の破片を慎重に取り除きます。次のステップは、カミソリの鋭い刃の部分をテープで覆って作成したヘッドプレートを取り付けることです。まず、ヘッドプレートの中央の開口部の各端に、シアノアクリレート接着剤を少量点付けします。次に、ヘッドプレートを薄い領域に中心合わせします。それを頭蓋骨に強く押し付けたまま保持してください。次に、皮膚を頭蓋骨の両側からヘッドプレートの中央開口部の縁に向かってゆっくりと引っ張ります。ヘッドプレートを1〜2分間、そのまま押さえて固定します。その後、ヘッドプレー

two-photon-vivo-imaging-dendritic-spines-mouse-cortex-using-thinned

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す...

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。...

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

ポリッシュと補強薄頭蓋骨（ポート）頭蓋窓と神経膠芽腫（GBM）の細胞注入を組み合わせることによって、我々は、神経膠腫の開始と縦ライブマウスの脳内に注入GBM細胞からの成長を観察することができます。...

イメージンググリオーマ開始<emインビボで&gt;</em&gt;ポリッシュと補強シン頭蓋骨頭蓋窓スルー

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。...

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

シリアルブロックフェイススキャン電子顕微鏡(SBEM)は、マウス海馬の樹状脊椎を画像化し、分析するために適用されます。...

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。...

蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

学ぶ二光子顕微鏡を用いたマウス皮質の樹状突起棘イメージング法。間引き頭蓋骨準備により生体内でシナプス構造の動態を長期観察し、神経可塑性研究に貢献します。

二光子

さらに動画を探す