簡体字を使用した初期の器官形成の理解

本実験の全般的な目的は、無傷の胚の中で特定の遺伝子がどこで発現しているかを示すことです。これは、第2ステップとして、局在化させるRNAを胚内のその場に固定することで達成されます。目的の遺伝子に特異的なアンチセンスRNAプローブを、胚内の標的RNAにハイブリダイズさせます。

このプローブには、通常ジゴゲニンなどのエピトープが含まれており、これを検出することが可能です。次に、アルカリホスファターゼが結合した抗体をRNAプローブ上のエピトープにハイブリダイズさせ、続いて比色染色を行います。胚内のどこにRNAが局在しているかを視覚化することで、呈色反応と胚の解剖学的知見に基づき、目的の遺伝子が正確にどこで発現しているかという結果が得られます。

当研究所のプロトコルが既存のプロトコルよりも優れている主な点は、品質を損なうことなく、より短時間で、かつより少ない試薬で実施できることです。この手法は、組織がどのように規定され、パターン形成されるかなど、胚発生学における重要な疑問に答えることができます。また、この手法はopusの開発に関する知見を提供できるだけでなく、ゼブラフィッシュやマウスの初期胚など、他の多くの小型胚にも適用可能です。

当初の手法は非常に時間を要していたため、私たちはまずこれらの手法の開発に着手しました。品質を損なうことなく手順の効率を高めるため、Edステップを省略するなどの検討を開始しました。胚の固定は段階的に行います。まず、プロセスの全段階を通じて胚をモニタリングできるよう、最終的な胚の保存を含むすべてのステップで使用するガラスバイアルを準備します。

蓋に優れたテフロンシールが付いた透明なバイアルを使用し、油性マーカーで適切な実験情報を記載してラベルを貼ります。処置の過程でラベルが脱落するのを防ぐため、ラベルの上から透明テープを貼ります。アルコールやその他の溶媒を使用するため、プロトコルの本文に従ってMFA固定液を調製してください。

ラベルを貼った各ガラスバイアルに、MFA溶液を3〜4 mL注入します。100%メタノール溶液は-20 °Cで保存してください。カットガラスピペットを作成し、それを用いて胚を固定用のMemphis溶液が入ったガラスバイアルに転送します。

胚培地からの液量転送を最小限に抑えて、胚を加えます。1バイアルあたり20〜30個以下の胚を固定してください。胚をMemphis溶液に入れ、室温のミキサー上で2時間静置します。

パラホルムアルデヒド固定が完了したら、メンフィス溶液を約4 mLの-20 °Cの100% methanolに置換して胚を保存します。プローブ合成反応を準備する前に、DNA水NTPミックスとポリメラーゼバッファーを室温に戻してください。本手順を成功させるために最も重要なステップの一つは、プローブ反応を正確に組み立てることです。

プローブ合成反応を室温で準備します。以下のコンポーネントを、この順序で1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに加えます。テンプレートDNA、反応液の全量が20 microlitersになるように調整した水、NTP mix、RNA inhibitor、RNA polymerase buffer、およびRNA polymerase。その後、転写反応を37 degrees Celsiusで2時間インキュベートします。

2時間をわずかに超えるインキュベーションを行っても悪影響はありませんが、収量もほとんど増加しません。1時間だけインキュベーションした場合、収量は低下しますが、良好なプローブを調製するには十分な量が得られます。転写反応が完了したら、反応混合液から1 µLを取り出し、1% agarose TAEゲルで確認します。残りの反応混合液を...

TEバッファーで調製した1% SDSを80 µL、5 M 酢酸アンモニウムを10 µL、および氷冷エタノールを220 µL加えます。混合液を激しくボルテックスし、RNA品質チェックの結果が出るまで氷上に置いておきます。沈殿させる前に分取しておいた1 µLのRNAに水と標準ローディングダイを加え、臭化エチジウムを含む1%アガロースTAEゲルでRNA電気泳動を行います。

UV透過照明装置を用いてゲル上のエチジウムブロミド標識RNAを観察し、プローブの品質を確認します。上下にスマアリングのない単一のバンドが可視化されるはずです。RNAの品質が確認できたら、氷上に置いておいた残りのRNAをマイクロ遠心機で最大回転数で10～15分間遠心し、沈殿させます。

引き延ばしガラスピペットを用いて上清を除去し、RNAを短時間乾燥させます。続いて、プローブをRNAハイブリダイゼーションバッファーで再懸濁し、15 mLのスクリューキャップ付きポリスチレンチューブに入れて-20°Cで保存します。この手順を開始するには、-20°Cのメタノール中で保存していた胚を取り出し、室温に戻します。

全工程はガラスバイアル内で行います。同一グループ内の異なる胚を異なるプローブで検討する場合は、プローブを添加する直前まで単一のバイアルに保持してください。プローブ添加に向けた準備として、1日目の変動性と労力を軽減するため、本表に概説されているメタノール系列を用いて胚を再水和させます。このステップでは胚が損傷しやすいため、ガラスピペットを使用して各溶液を慎重に除去および添加してください。

液体を移し替える際は、キャップの内側に胚が取り込まれていないか確認してください。各液交換後、胚が容器の壁面や互いに付着していないことを確認するため、静かに撹拌してください。また、RNAハイブリダイゼーションバッファーとプローブを65 °Cに予熱させた後、バイアルをムテーターに装着して胚をロッキングしてください。

プローブ溶液を用いて、胚を65°Cで一晩揺らしながらハイブリダイズさせます。翌日、プローブ溶液を除去し、日付と使用回数を記載した15 mLねじ蓋付きポリスチレンチューブに回収します。プローブ溶液は-20°Cで保存してください。

プローブを除去した後、ここに概説されている一連の洗浄操作を通じて、プローブに対する抗体染色のための胚の準備を行います。温度調整が必要な場合は、胚の入ったバイアルを装着したミューテーターを、適切な温度に設定されたハイブリダイゼーションオーブンに直接移動させてください。胚をブロッキング液でインキュベートしている間に、抗D-dig抗体を加えた適切な容量のブロッキング液を調製し、胚に添加する前に抗体をブロックしておきます。翌日、胚を抗体溶液中で4 °Cで揺動させながら一晩インキュベートします。

抗体溶液を除去し、マレイン酸と塩化ナトリウムを含む溶液であるmabで洗浄します。室温でロッキングを行いながら、少なくとも1230分間の洗浄を行ってください。最後の洗浄液をアルカリホスファターゼ基質に交換します。

室温でオーバーナイトのロッキングを行い、染色反応を進めます。翌日、本表に示す手順に従って溶液を交換し、染色反応を停止させて、胚を保存およびイメージング用に準備します。胚を再水和させた後、MFAで30分間染色液を固定します。

固定後、MFAを除去し、胚を25%methanolで洗浄します。内因性色素の除去が必要な場合は、25%methanolを除去して漂白溶液を加えます。漂白は比較的速く進行するため注意深く観察してください。また、目的とする効果に合わせて漂白度合いを調整することが可能です。

長期保存の場合、胚をメタノール系列で100%メタノールまで脱水します。短期保存およびその後のイメージングを行う場合は、漂白後、胚をPBSに移します。未透明化の胚は、1% arosの背景で観察およびイメージングを行うのが最適です。aros溶液を調製するには、水にarosを加え、arosが溶解するまで沸騰させます。arosが50 °Cまで冷却された後、ペトリ皿に深さ約2 mmまで注ぎます。

arosディッシュの準備ができたら、透明化していない胚をディッシュに入れ、イメージングに進みます。arosは青灰色系の背景を提供するため、胚および染色反応による青色とのコントラストが良好になります。また、胚以外の箇所に注意をそらすような不要な影や反射を拡散させる効果があり、腹側など異なる角度から胚をイメージングする際に有用です。

精密ピンセットを使用して、胚が収まるようにアロスに切り込みを入れます。向きを整えながら、胚をそれらのチャネルに配置します。胚は損傷しやすいため、操作には十分注意してください。

光ファイバー光源を用いて胚を浅い角度から照らし、胚に影を作ることで画像に奥行きを与え、表面構造を判別しやすくします。漂白によって指標となる色素が消失する場合があるためです。強く漂白された胚には、このシャドウイング手法を用います。透明化胚は、脊索、肺、または脳の領域など、胚の深部における染色のイメージングに使用します。

本プロトコルでは、胚内の染色の可視化のために、異なるレベルの脱色を行います。染色が強い場合は、色素をある程度残した軽度の脱色を行うことで、胚のステージ判定と方向確認をより正確に行うことができます。一方、腎臓などの色素沈着が激しい部位に染色がある場合は、より強い脱色を行うことで良好な結果が得られます。

AROベースを加工することで、胚の向きを調整することが可能です。例えば、アロスに細い溝を作ることで、横向きに横たわっているオタマジャクシ期の胚を腹側から観察させることができ、良好な画像を撮影するのに十分な安定性を得られます。この胚は、腹側を上にして位置を固定できる小さな穴に配置されており、これにより目的遺伝子の発現パターンを完全に観察することができました。

内部器官は、未透明化および透明化した胚の両方で観察できます。PAX2で染色された未透明化の不透明な胚では、ステージ34において、視神経柄および神経管を可視化できます。しかし、詳細は鮮明ではありません。胚を透明化することで、視神経柄を含む発現部位の境界がより鮮明になります。

この胚の両眼が視認できることから、透明化の程度が分かります。しかし、透明化した胚でよく見られる問題として、内部の腔に染料が蓄積することがあります。このビデオを視聴することで、より少ない試薬を用いて迅速にホールマウントin situハイブリダイゼーションを行い、高品質な画像を撮影する方法を十分に理解できるはずです。