Name: 簡体字を使用した初期の器官形成の理解その場でハイブリダイゼーションプロトコルでアフリカツメガエル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: 学ぶアフリカツメガエル胚における全胚固定in situハイブリダイゼーションの簡易プロトコル。RNAプローブを用いた遺伝子発現局在の可視化により、初期発生における遺伝子機能の理解を深める。

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著者は、CIHRがSteve Deimlingのフェローシップを支援し、Department of Paediatrics, University of Western OntarioがSteve Deimling、Rami Halabi、Stephanie Groverを支援してくれたことに感謝したいと思います。 この研究は、NSERC助成金R2654A11とNSERC Discovery Accelerator Supplementの支援を受けました

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

著者には開示すべき競合する金銭的利益はありません。

特定の遺伝子の発現パターンを可視化するために、in situハイブリダイゼーションを使用する能力は、 アフリカツメガエル胚の特定の器官または細胞型を同定するための最も一般的に使用される方法のままである。これは、この技術によって提供されるいくつかの利点がある。遺伝子の発現は、これらのセル18のいずれかの明確な境界の前に心臓前駆細胞におけるNkx2.5の発現のためのケースとしてだけでなく、分化のいずれかの組織学的な記号の前に特定の構造を識別することができます。すべての試薬が手に入ると、それはまた、非常にコスト効果的である。効果的に再利用することができる多くの個々のプローブの生成は、目的の遺伝子をコードするプラスミドを得た以外は少し余分な時間とコスト投資が可能である。我々の経験では、プローブは、それぞれの使用が付属して避けられない小さな希釈液にもかかわらず、活動の少ない損失で年に再利用することができる。最後に、少し最適化requiががあります別のプローブを利用する際に赤。 プローブ合成の品質は、...

特定の遺伝子の発現パターンは、特定の臓器や細胞タイプの発達におけるその遺伝子の潜在的な役割を決定する重要な情報です。 簡単に言えば、適切なタイミングと場所で表現されなければ、重要な役割を果たす可能性は低いです。 Xenopusでは、ほとんどの初期胚と同様に、遺伝子の発現を検出するために最も一般的に使用されるアッセイは、標識アンチセンスRNAプローブを用いた全マウントin situハイブリダイゼーションです。 Xenopusの遺伝子発現を評価するための抗体染色の使用は、研究者がXenopusの相同体に交差反応するか、または独自の1-3を生成する抗体(通常は哺乳類タンパク質に対して産生される)を発見するにつれて、より一般的になっています。 しかし、Xenopusの器官形成に関する研究の大部分は、依然としてアンチセンスRNAプローブを利用しています。 抗体を使用する場合、個々の抗体ごとに一次抗体の濃度や固定プロトコルの最適化が必要になることがよくあります。対照的に、in situハイブリダイゼーションのプロトコルは、プローブごとに基本的に不変です。 基本的な概念は比較的単純で、優れた標準プロトコルが確立されています4。 私たちのプロトコルは、元のプロトコル4の合理化されたバージョンであり、初期胚の遺伝子発現パターンの優れた検出を提供します。 胚を固定し、次いで、標識されたアンチセンスRNAプローブの標的mRNAへの高いストリンジェンシー結合を可能にするように溶液および温度を変更することにより、ハイブリダイゼーションのために準備する。 結合していないプローブを洗い流し、次に胚をRNAプローブ上の標識に対する抗体の結合のために準備します。 次に、過剰な抗体を洗い流し、酵素による色反応を使用して、RNAプローブが胚内で結合している場所を特定します。 現在、特定の組織における蛍光タンパク質の発現を促進するXenopusトランスジェニック株が多数存在しており、これらはウッズホールのNational Xenopus ResourceなどのXenopusストックセンターで入手できます。 生きた胚の器官形成を調べる必要がある多くの実験に非常に役立ちますが、このオプションではトランスジェニック系統に別のハウジングが必要です。 
In situハイブリダイゼーションは、初期胚のどこに特定の器官や細胞タイプが形成されるかを明確に示すことができます（図1）。この技術は、単一の胚5の少数の細胞で遺伝子発現を検出できることを考えると、非常に感度が高いです。 しかし、比色染色の強度を用いたin situハイブリダイゼーションは、色反応が線形反応ではないため、定量化可能とは見なされません。 染色強度の定量化は困難ですが、発現の変化はしばしば非常に顕著です。特に、in situハイブリダイゼーションが発現ドメイン6,7のサイズに定量化可能な増加または減少を示す場合。 
全マウントin situハイブリダイゼーションの明らかな利点は、初期発生の研究において重要なアッセイとなっています。 しかし、それは数日にわたって多くのステップを必要とする時間のかかるものです。 このプロトコルは、標準プロトコルの簡易版であり、in situ結果の品質を低下させることなく、いくつかのステップを排除します。 また、この簡素化により、ばらつきの原因が排除され、in situハイブリダイゼーションが最適でない場合のトラブルシューティングが容易になります。 具体的には、胚のプロテイナーゼKおよびRNAse処理の使用を排除しましたが、これは試薬の品質に依存する可能性があり、やり過ぎるとシグナル強度を低下させる可能性もあります。 また、このプロトコルは、複数の試薬の使用を排除するため、ある程度のコスト削減も実現します。 最後に、このプロトコルは、in situハイブリダイゼーション結果の画像のキャプチャを改善するためのいくつかの簡単なガイドラインも提供します。 このプロトコルはXenopus胚での研究に最適化されていますが、少なくとも一部の簡略化は、他の胚系でのin situハイブリダイゼーション研究に適用できる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>Labguakeチューブシェー</td><td>カーVWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>VWRバイアル</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>バイオショップ</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレオシド三リン酸セット、100mM</td><td>ロシュ</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>ジゴキシゲニン-11-UTP</td><td>ロシュ</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Rnase阻害剤(Rnase OUT)</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ</td><td>Fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>羊の血清</td><td>&nbsp;Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロシュ</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BMパープルAp基質</td><td>ロシュ</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-AP2月フラグメントロ</td><td>シュ</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>バイオ<td>ショップ</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Σ</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Σ</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>&nbsp;VWR&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>ロシュ</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>&nbsp;VWR&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素 (30% 溶液)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>シグマ</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td>シグマ</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュアアガロース&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>

簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

器官形成は、器官がどのように特定され、その後、発生中にその特定の形状と機能を獲得するかの研究です。 Xenopuslaevis胚は、その大きなサイズにより、器官形成の最も早い段階で臓器を特定するのに非常に適しているため、器官形成の研究に非常に役立ちます。 現時点では、特定の臓器または原基を同定するために使用される主な方法は、目的の臓器で発現する遺伝子に特異的な標識アンチセンスRNAプローブを用いた全マウントin situハイブリダイゼーションです。 さらに、Xenopusでは遺伝子やシグナル伝達経路を操作することが比較的容易であり、in situハイブリダイゼーションにより、標的臓器の存在や形態の変化をアッセイすることができます。 Whole mount in situハイブリダイゼーションは、多くのステップを伴う数日間のプロトコルです。 ここでは、ルーチンアッセイに適した、使用するステップ数と試薬の数を減らした簡略化されたプロトコルを提供します。 In situハイブリダイゼーションロボットはプロセスを非常に容易にし、その技術をプロセスでいつ、どのように活用するかについて詳しく説明します。 in situハイブリダイゼーションが完了すると、結果の最良の画像をキャプチャすることはイライラする可能性があります。 in situハイブリダイゼーション結果のイメージングを最適化する方法についてアドバイスを提供します。 このプロトコルでは、Xenopus laevisの器官形成の評価が説明されていますが、同じ基本プロトコルがXenopus tropicalisや他のモデルシステムにもほぼ確実に適応できます。

組織特異的プローブの使用は、特定の臓器の開発の状態に関してで優れた情報を提供することができる。以下の例では、胚のステージはNieuwkoopとフェーバーステージング表11に基づいています。 1プローブを使用している場合、私は例（ 図1C）のために、段階28-30で、 心筋トロポニンの分化後に発現する遺伝子を形成し、差別化器官の存在又は大きさはどの段階ポスト分化で評価することができる。数年前、胎生学者は、初期胚12,13の組織学の顕著な知識に基づいて、このような分析を行うことができましたが、その専門知識は、主に胎生の現在の世代のために失われています。なお、この専門知識の損失は任意の研究者が利用可能な特定の組織の識別を行い、in situハイブリダイゼーション技術の信頼性および使用の容易さ、残念と考えることができる。比較的目立たない組織トン彼例えば胚ステージ25（ 図1A）で腺を孵化、鮮やかに特異的な抗体または組織学的技術（ ...

Xenopus laevisの胚は、その大きなサイズと操作の容易さから、初期発生の研究において非常に有用であり続けています。 このモデルシステムにおける特定の臓器の同定に使用できる、全マウントin situハイブリダイゼーションプロトコルの簡略化されたプロトコルが提供されています。

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

本実験の全般的な目的は、無傷の胚の中で特定の遺伝子がどこで発現しているかを示すことです。これは、第2ステップとして、局在化させるRNAを胚内のその場に固定することで達成されます。目的の遺伝子に特異的なアンチセンスRNAプローブを、胚内の標的RNAにハイブリダイズさせます。このプローブには、通常ジゴゲニンなどのエピトープが含まれており、これを検出することが可能です。次に、アルカリホスファターゼが結合した抗体をRNAプローブ上のエピトープにハイブリダイズさせ、続いて比色染色を行います。胚内のどこにRNAが局在しているかを視覚化することで、呈色反応と胚の解剖学的知見に基づき、目的の遺伝子が正確にどこで発現しているかという結果が得られます。当研究所のプロトコルが既存のプロトコルよりも優れている主な点は、品質を損なうことなく、より短時間で、かつより少ない試薬で実施できることです。この手法は、組織がどのように規定され、パターン形成されるかなど、胚発生学における重要な疑問に答えることができます。また、この手法はopusの開発に関する知見を提供できるだけでなく、ゼブラフィッシュやマウスの初期胚など、他の多くの小型胚にも適用可能です。当初の手法は非常に時間を要していたため、私たちはまずこれらの手法の開発に着手しました。品質を損なうことなく手順の効率を高めるため、Edステップを省略するなどの検討を開始しました。胚の固定は段階的に行います。まず、プロセスの全段階を通じて胚をモニタリングできるよう、最終的な胚の保存を含むすべてのステップで使用するガラスバイアルを準備します。蓋に優れたテフロンシールが付いた透明なバイアルを使用し、油性マーカーで適切な実験情報を記載してラベルを貼ります。処置の過程でラベルが脱落するのを防ぐため、ラベルの上から透明テープを貼ります。アルコールやその他の溶媒を使用するため、プロトコルの本文に従ってMFA固定液を調製してください。ラベルを貼った各ガラスバイアルに、MFA溶液を3〜4 mL注入します。100%メタノール溶液は-20 °Cで保存してください。カットガラスピペットを作成し、それを用いて胚を固定用のMemphis溶液が入ったガラスバイアルに転送します。胚培地からの液量転送を最小限に抑えて、胚を加えます。1バイアルあたり20〜30個以下の胚を固定してください。胚をMemphis溶液に入れ、室温のミキサー上で2時間静置します。パラホルムアルデヒド固定が完了したら、メンフィス溶液を約4 mLの-20 °Cの100% methanolに置換して胚を保存します。プローブ合成反応を準備する前に、DNA水NTPミックスとポリメラーゼバッファーを室温に戻してください。本手順を成功させるために最も重要なステップの一つは、プローブ反応を正確に組み立てることです。プローブ

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

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の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

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高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。...

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開発の初期段階での切開およびゼブラフィンチ胚のダウンストリーム解析

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。...

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ゼノプス胚細胞由来粘膜上皮上オルガノイド:生成、培養、高解像度ライブイメージング

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学ぶアフリカツメガエル胚における全胚固定in situハイブリダイゼーションの簡易プロトコル。RNAプローブを用いた遺伝子発現局在の可視化により、初期発生における遺伝子機能の理解を深める。

簡体字を使用した初期の器官形成の理解

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