ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

この手順の全体的な目標は、ウズラ管キメラを手段として、神経皮細胞が頭蓋顔面の発達中に種特異的なパターンを生成するメカニズムを調査することです。これは、最初にステージ9.5のウズラ胚の中部および前後脳領域から神経折り畳みのストリップを解剖して除去することによって達成されます。2番目のステップは、ウズラのドナー神経襞をアヒルの宿主胚に移すことです。

3番目のステップでは、ステージ9.5のアヒル宿主胚の同等の領域を解剖して除去します。最後のステップは、コイル神経折りをアヒル、中脳および前後脳領域に配置することです。最終的に、得られたキメラ胚は、C 2つのハイブリダイゼーションを通じて神経堤を介した遺伝子発現の変化を特定でき、組織学的解析を通じて形態学的変化を明らかにすることもできます。

私が最初にこの方法を思いついたのは、サンフランシスコのオーシャンビーチ上空をブラウンペリカンが飛ぶのを見たときでした。神経堤細胞は、長いくちばしの骨格の骨や軟骨を生じさせるため、種特異的なパターンの源泉であるに違いないと気づきました。茶色のペリカンの卵は見つけられませんでしたが、白い北京ダックを見つけることができました。

サンフランシスコがアジア以外で最大のチャイナタウンを持っていることを考えると、ウズラとアヒルの間の成熟率と形態の違いを利用することによって。この方法は、種固有のパターンの起源を理解するなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます、手術を行うのは、博士研究員であるジェニファー・フィッシュ博士になります私の研究室では、助力は大学院生であるケイト・オビッツになりますパンとバーナーを使用して、ペーストピペットの狭い端をテーパーに沿ったガラスが溶け始めるまで加熱します。炎から取り出し、ピペットが密閉されるまで先端を引っ張ります。

テーパー部分の外径が0.7〜1ミリメートルであることを確認してください。次に、テーパーから約4センチメートルのところで密封された端を切り離します。次に、もう一方の端にあるピペットブローの開放端に約2フィートのゴムチューブを取り付けます。

チューブに息を吹きかけて穏やかな圧力を提供しながら、ピペットの接続部またはもう一方の端を空気が通過しないようにする必要があります。プロパンペンシル、フレームトーチを使用して、テーパーの開始点のすぐ下にあるピペットの片側の楕円形の領域を加熱します。ガラスが外側に曲がり始めたらすぐに、ピペットを炎から取り外し、ゴムチューブにそっと息を吹きかけます。

これにより、ガラスの加熱された部分がソーセージの形をした泡を形成します。圧力がかかりすぎるとガラスの泡がはじけるので、これは避けてください。ピペットの結果として得られる窓は、幅約1センチメートル、長さ1.5〜2センチメートルである必要があります。

次に、先細りの端を上に向け、ガラスの破片がピペットに入るのを防ぐために、チューブにそっと息を吹き込みながら、泡をガラス廃棄物容器にこすり落とします。次に、プロパンの炎を使用して、泡の残りの端を慎重に燃やし、開いている窓の側面をファイヤーポリッシュします。次に、ダイヤモンドチップペンシルを垂直位置に保持し、ダイヤモンドチップペンシルを使用して、テーパーの開始から1センチメートルのピペットのテーパーエンドにスコアを付けます。

鉗子を使用して、スコアリングされたラインでピペットをそっと壊します。先端を取り外すには、解剖顕微鏡で、破損がきれいでギザギザしていないことを確認します。ピペットは、ペンシルを人差し指で開いた窓の先端から約9.5ミリメートルのところにかざすように持ちます。

ピペットのグラスをアルコールバーナーの炎の端に隣接させて保持することにより、ガラスを柔らかくします。鉗子で先端に圧力をかけ、解剖スコープの下でピペットの狭い方の端を60度の角度で曲げます。素早く丁寧に、アルコールバーナーで先端を磨いた。

完成した開口部は丸みを帯びており、遮るものがない必要があります。炎に長時間置くと、先端がくびれて使用できなくなることに注意してください。次に、長さ2.5センチメートルのゴムチューブに70%エタノールを注油します。

ピペットのシャフトの上に下から上にスライドさせて、開いている窓を覆います。次に、2ミリリットルのラテックス電球をピペットの開放端に置きます。内部の空気圧を維持するために、まず、宿主の卵を準備します。

炎で研いだタングステン針でヴィターレ膜を切断し、胚の上に膜を引っ張ります。次に、ドナーの卵子の場合と同様に、卵子をテープで再密封します。ドナー卵子の窓からテープをはがして、ドナー胚の神経折り畳みを切り取ります。

炎を研いだタングステン針を使用して神経管の両側にスリットを入れます。次に、移植片の目的の前部と後部レベルで神経管を横切って切断し、移植片を神経管の残りの部分から切り離します。移植片の前方形状と後方形状など、特定の解剖学的詳細に注意を払い、ドナー組織が適切に配向されます。

ホストに配置するときは、タングステン針が非常に鋭利であることを確認してください。組織を完全に、そして一つで取り除くために、迅速かつ意図的なストロークを使用し、シャーマンピペットを使用してドナー胚から神経折り畳みを取り除きます。できるだけ液体を吸い込まないようにしないと、転写時に組織が浮いてしまう可能性があります。

次に、宿主の卵子の窓からテープをはがし、シャーマンピペットを使用して、移植を受ける神経管の領域に隣接する宿主胚の横にドナーの神経折り畳みを配置します。次に、ドナーの場合と同様に、神経折り畳みを宿主胚の神経管から分離します。ドナー組織と同じサイズの移植片を切除するように注意してください。

この宿主組織を胚からそっと遠ざけます。次に、鈍いタングステン針またはマイクロピペットの丸みを帯びた先端を使用して、ドナーの神経折り畳みを宿主の神経管にゆっくりと移動させ、適切な前方後方および背側の腹側向きを維持します。移植片が側面に沿って押し込まれていることを確認してくださいが、下にある組織を突き刺したり損傷したりしないように注意してください。

滅菌生理食塩水は、宿主胚に慎重かつ穏やかに塗布する必要があります。乾燥の兆候がある場合は、卵子を慎重に再密封してラベル付けし、キメラ胚が目的の段階まで成長できる高湿度のインキュベーターに静かに戻します。分析用。

分析のために、キメラ胚を新しくできた冷たいサラの固定液に集めます。その後、すぐに摂氏4度のロッカーに置き、一晩固定します。これにより、抗ウズラ抗体によるウズラの卵をより高感度に検出することが可能になります。

リアルタイム定量PCRによる遺伝子発現解析のもう一つの重要なステップは、RNAの前に胚と液体窒素を凍結することです。抽出コイルとアヒルは、サイズと形状にかなりの違いがあるため、それらの胚はキメラシステムを作るのに理想的です。C頭蓋顔面の発達を研究する。

具体的には、神経堤細胞の役割を調べるのに有用です。キメラ準胚ドナーウズラ神経堤細胞の顔面骨格をパターン化する際に、宿主のアヒル下顎弓に移動します。アヒルのようなパターンでは、緑色のウズラドナー細胞を腹側から抗ウズラ抗体で観察します。

ステージ12のキメラ胚では、ドナーの神経堤は、ウズラのようなサイズと形状の下顎骨格を生成します。習得すると、各移植は約5分で完了します。これ以上適切に行われると、胚が乾燥のリスクにさらされ、生存率が低下します。

この手順を実行するときは、姿勢を意識し、肩をリラックスさせ、手の位置を良好に保つことが重要です。また、ルーチンを作成し、手術器具と試薬を毎回同じ場所に置くことで、顕微鏡に目を留め、自動化された方法で手を動かすことができます。