多層魚の鱗の特性（

この手順の目的は、X線コンピューター断層撮影（X線CT）、ナノインデンテーション、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、およびエネルギー分散型X線分光法（EDS）を併用した走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、多層構造を持つ魚類鱗の鉱質化構造、化学組成、および機械的特性を明らかにすることです。まず、鱗から軟組織を除去し、鱗を固定・切断した後、段階的な研磨を行うことで、個々の鱗を分析可能な状態に調整します。次に、ダイヤモンド製のベルコビッチ圧子を用いて鱗の断面に沿って空間的に相関させたナノインデンテーションを行い、局所的なナノ機械的特性を測定します。

次に、魚鱗の内層および外層をFTIR顕微鏡で観察し、それぞれの層における主要な官能基を特定します。最終ステップとして、走査電子顕微鏡のEDX検出器を用いて、魚鱗に施したナノインデンテーションと局所的な化学組成との相関性を調べ、異なる層や破断面におけるインデントの画像を撮影します。最終的に、これらの多様な実験手法を組み合わせることで、構造と特性の関係を理解し、鉱質化した魚鱗の天然の設計原理を明らかにします。

バルク統計的ナノインデンテーションなどの他の既存の試験法に対する本手法の主な利点は、化学組成構造と局所的な機械的特性との間に直接的な相関を提供できる点にあります。関心領域において、我々はこの手法を構造バイオマテリアルにおける空間分布、化学組成構造、および機械的特性の研究に適用してきました。また、セメント系材料や多相複合材料をはじめ、マイクロメートルおよびナノメートルスケールで不均一性を示すあらゆる種類の不均一材料への多くの応用が可能です。

魚鱗の短軸の横断面を観察するために、市販のプラスチック製サンプルホルダーを使用して、エポキシ樹脂で封入する際にサンプルの向きを正しく維持しながら、直径32 mmのサンプルモールドに魚鱗を固定します。サンプルをモールドに固定した後、未硬化のエポキシ樹脂をサンプルの上に注ぎます。製造元の指示に従ってエポキシ樹脂を硬化させた後、ダイヤモンドブレード高精度切断機を用いて、サンプルの正中線で封入したサンプルを切断します。

サンプルをナノインデンターにロードした後、ソフトウェアコントロールを使用して試料を最初のインデント位置まで移動させます。この位置から開始し、統計的に有意なデータセットを得るために、15 µm間隔で4列の平行なインデントを行います。次に、ナノインデンターの最大荷重を5 mN、負荷および除荷速度を0.1 mN/s、保持時間を30 s、各列の最小インデント間隔を5 µmに設定します。バッチ処理が完了したら、ナノインデンターを用いて、最初と最後のインデント位置に最大荷重100 mNで基準インデントを作成します。これらはそれぞれ、骨層前のエポキシ樹脂内および骨層後のエポキシ樹脂内に配置される必要があります。

ナノインデンテーション後、さらなる脱水を防ぐため、サンプルをPBS溶液に戻します。サンプルの最も長い辺が検出器と平行になるようにしっかりと固定します。スキャナーの設定後、スチロフォームやパラフィルムなど、X線透過性の材料を使用して、固定したサンプルをスキャナーのステージに固定します。

試料を回転中心に位置するように配置します。スキャン中は、スケール全体が視野に入る最高解像度を選択してください。本事例では7.5 micrometersとなります。データ取得後、X線投影画像を再構成し、断面画像を含むデータセットを作成します。

次に、ソフトウェアを使用して最終的な3Dグレースケール画像を取得します。発泡スチロールやパラフォームによるアーティファクトを除去するため、グレースケールの範囲を適切なレベルに調整します。研磨済み試料上のナノインデントをSEM（走査電子顕微鏡）で観察する場合、インデント面を上にして、両面カーボンテープを用いて試料をSEMスタブに固定します。続いて、試料をSEMチャンバー内に設置し、チャンバー内を低真空モードまで排気します。

作動距離を 3.0 から 5.0 millimeters の間に調整します。高電圧を印加し、試料上の関心領域（本例では anoe 層および骨層に存在する構造）に移動します。次に、加速電圧を 5 kilovolts から 15 kilovolts、ビーム電流を 3.9 nano amps の低電流に設定して画像を取得します。

解像度を向上させるため、低真空反射電子BSE検出器を使用して、少なくとも3つの関心領域から250倍から10,000倍の倍率で画像をキャプチャし、バイオミネラル含有量および密度の変化の同定を補助します。その後、研磨済み試料上の、インデント列の各端にフィデューシャルマークで示されたナノインデンテーショングリッドを含む関心領域に移動します。高電圧が少なくとも15 kilovoltsであることを確認してください。

ビーム電流を少なくとも 3.9 nano amps に設定し、作動距離を 5.0 millimeters 以上にします。次に、EDX で分析する領域の後方散乱電子像をキャプチャします。EDX 分析ソフトウェアを使用してください。

圧痕のラインに沿って化学分析を行う領域を特定しやすくするため、同じ画像をキャプチャします。次に、ライン分析手法を用いて、最初の圧痕から最後の圧痕まで、関心のある圧痕のラインに沿って化学分析を行うためのラインを配置します。化学組成と機械的特性の直接的な空間相関を得るために、ライン上の分析点数を、存在する圧痕数と同じ数に指定します。

ラインの位置決めを行い、ポイントを正しく指定します。ライン分析の完了後、EDXソフトウェアを使用してライン分析を開始します。試料の研磨面上の指定されたラインに沿って得られたポイントスペクトルから、定量化する目的元素を特定します。

関心のある元素が特定されたら、制動放射線などの影響を補正するためにバックグラウンド校正を行います。ソフトウェアのデコンボリューション解析オプションを選択し、指定した直線上の各点における定量解析を行い、各点の化学組成を定量化します。最後に、定量的な化学分析結果を、解析した指定直線の画像と共に保存します。これにより、ナノインデンテーションを用いてanoe層で測定した機械的特性との空間的な相関を容易にします。ナノインデンテーションにより算出された平均弾性率は69.0 giga pascals、硬度は3.3 giga Pascalsでした。

ナノインデンテーションにより、骨層の平均弾性係数は14.3 giga pascals、硬度は0.5 giga pascalsであることが決定されました。anoe層と骨層には、化学組成に定量可能な差異が含まれています。骨層における炭素のスパイクは、低ミネラル化に起因していると考えられ、これにより炭素の増加とBSE像の輝度の低下が生じます。骨層およびENE層のFTIRスペクトルでは、外側のgwe層にヒドロキシアパタイトのシグネチャーが、内側の骨層にコラーゲンのシグネチャーが示されています。

X線計算機断層撮影（CT）により、鱗が重なり合っている部位ではgwe層が骨層を覆っていないことが示されています。明るい灰色のgwe層は密度が高く、より硬く剛性が高い一方、暗い灰色の骨層は密度が低く剛性も低くなっています。ging層の中央付近には明らかなピット（孔）が観察され、その不均一性が示されています。

エッチング処理を施した破断面の低倍率SEM像では、ging層に層状に組織化されたナノ構造が認められ、これはFTIRの結果と相関しています。破断面の高倍率SEM像では、ging層に配向したナノロッドが見られる一方、骨層では発達後に繊維状のナノ構造が観察されます。この手法は、化学組成、構造、および機械的特性の空間分布を研究するためのバイオマテリアルや複合材料に関するさらなる研究への道を開き、また多相複合材料における界面の解析にも寄与しました。さて、このビデオを視聴したことで、構造バイオマテリアルにおいて化学組成を構造および機械的特性と空間的に相関させるための試料作製法および解析手法について、十分に理解できたはずです。

これらの手法は、他の種類の不均一な多相材料の研究にも適用および適合させることが可能です。