Name: 多層魚の鱗の特性（ Atractosteusヘラ）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学ぶ多層魚鱗の構造・化学・機械的特性解析法。ナノインデンテーション、FTIR、X線CT、SEMを用いてAtractosteus spatulaの鱗を空間相関解析し、生体材料の設計原理を解明する手法です。

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著者は、米軍ERDC軍事技術6.1基礎研究プログラムと監督研究プログラムのERDCセンターが提供する、この仕事のための財政支援を承認したいと思います。著者はまた、実験的な作品を支援するためのERDC地盤と構造研究所のコンクリート·材料支店のスタッフと設備を感謝したいと思います。公開する許可はディレクター、地盤＆構造研究所によって付与されました。

1。魚鱗サンプル調製この研究では、スケールは約600ミリメートル、長GAR（A.ヘラ ）からミドル丈で、米国陸軍工兵隊研究開発センター（ERDC）環境研究所（尾番目の列29）から得た。魚の鱗はERDCに従って入手し、国立衛生研究所（NIH）の動物管理指針た。 <ol><li>材料 研究のために取得したスケールの魚に空間的位置を記録します。このようなNIHの動物保護ガイドラインのような生物学的標本を得るための適切な組織または政府のガイドラインを遵守してください。水和を維持し、彼らは、魚から削除されるとミネラル含有量を維持するために、例えば、リン酸緩衝生理食塩水などの適切な媒体中でのスケールを保管してください。ナノインデンテーションデータに影響を与える可能性がある、ミネラルが失われることが長期貯蔵は避けてください。ブラシとT毛メディアを使用ハードスケールからの軟組織を除去するためにweezers。 </li><li>マウントと分割標本 横FTIRを使用して、魚のスケールの短軸の部分（ 図1）とナノインデンテーションを調べると、最初のそのような樹脂と硬化剤からなる2液型エポキシなどの硬い媒体にスケールを取り付けが必要です。そのような55℃未満のピーク温度を有していたこの研究で使用される市販の汎用エポキシ樹脂などの低ピーク温度を有する汎用RT硬化性エポキシを使用</li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig1.jpg" /> A.図1 X線CT画像A.この研究で検討短軸横断面を示すへらスケールナノインデンテーションおよびFTIR [A（前部）、P（後部）、D（背側）、V（腹 ​​側）]を使用してへら 。&lt;/ pの&gt; <ol start="2"><li><ol><li>市販のプラスチック製の試料ホルダーを使用して、32ミリメートルの直径のサンプル型の中で魚のスケールを持ちます。これは、エポキシで取り付けながら、正しい向きにサンプルを保持します。 </li><li>サンプルを金型内に保持されていると、試料上の未硬化のエポキシを注ぎ、その後エポキシは製造者の指示に従って硬化させる。 </li><li>エポキシが硬化した後、セクションは、ダイヤモンドブレード高精度のカットオフを使用して取り付けられた試料は、試料の正中線で見た。 </li><li>検体から破片を除去するための15分間蒸留水中で超音波処理。 </li></ol></li><li>ナノインデンテーションおよびFTIR用研磨 図2に示すように、ナノインデンテーションのために滑らかな平面を入手するには、次の研磨手順とパラメータは研磨製造および試験サンプルとの協議に基づいて提案されている。しかしパラメータが応答に基づいて別の生体材料のために調整する必要があるかもしれませんこのような材料除去率など。研磨工程の間に蒸留水の浴内のサンプルの超音波は、研磨工程粗いから粒子を確実にするために不可欠であるが、その後の細かい研磨工程に導入されていません。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig2.jpg" /> 研磨された短軸横断面Aの図2の画像エポキシに搭載されたヘラスケール 。 <ol start="4"><li><ol><li>潤滑剤として15μmのSiCのパッドと水で粗ポリッシュサンプルは、毎分200回転（rpm）の7 LBFと速度の自動研磨ヘッド力を用いて平面になるまで。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li><li>水130回転のプラテン速度で潤滑剤のための7 LBFの力を利用して6ミクロンのSiCパッド付き中間ポーランド5分。 </li><li> 15分間蒸留水の浴槽に超音波処理のサンプル。 </li><li> 130回転のプラテン速度で5分間7 lbfでの力で水潤滑剤を用いて1μmのSiCのパッドとポリッシュ。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li><li>このような製造業者が50 nmの懸濁液のために示唆している高密度の不織布、低昼寝多孔質ポリウレタンのような、適切な研磨パッドを使用して50nmのコロイダルシリカ懸濁液で最終仕上げ。 5分間の7 LBFの力で130 rpmの速度でポーランド。 </li><li> 15分間蒸留水の浴中で試料を超音波処理する。 </li></ol></li></ol> 2。ナノインデンテーションテスト<ol><li>あたりのテストの各バッチの前にナノインデンテーションシステムを校正ガイドラインを製造しています。キャリブレーションは、ベルコビッチチップとフレーム剛性のためのシステムの面積関数を決定することを含むべきである。また、この段階での顕微鏡への圧子キャリブレーションを実行インデントを確実にするためには、選択された顕微鏡の場所に相関している。 </li><li>ナノインデンターにサンプルをロードし、焦点にサンプルを持って来るためにナノインデンターに光学顕微鏡コントロールを使用します。 </li><li>最初のインデントのための位置に試料を移動するためのソフトウェア·コントロールを使用します。理想的には、これは、スケールの断面の中心線に沿っ硬鱗質層の端部からのエポキシでは約10μmである。 </li><li>インデントの4平行な列を実行し、統計的に有意なデータを得るために離れて15μmの間隔をあけ、この位置から設定してください。 5 0.1 MN /秒のミネソタ、ロードとアンロード速度、30秒の保持時間、および行ごとに5μmの最小インデント間隔の最大負荷にナノインデンターを設定します。インデントの行は硬鱗質面に直交実行するように設定する必要があり、EPOXに約10μmを横断しながら、インデント十分な数のスケールの断面を横切って移動するように指定する必要があります骨の層の過去のy。 </li><li>バッチが完了すると、ナノインデンター、それぞれ硬鱗質層前と骨の層の後にエポキシでなければならない最初と最後のインデントで100 MNの最大荷重と基準インデントを作成している。これらは、インデントの行ごとに、開始点と終了点に相関している。 </li><li>ナノインデンテーションした後、さらに脱水を避けるために、PBS溶液中に試料を置くバック。 </li><li>時間に依存しない材料の応答が観察された場合、オリバー·ファー法13に基づき、弾性率と硬さを決定するために、ナノインデンテーションソフトウェアを使用してください。そうしないと、ホールド·タイムがあまりにも急速にアンロードから見たクリープを克服するために拡張する必要があるかもしれません。 </li></ol> 3。空間的に分解され、ATR-FTIR分光法スライドオンFTIR顕微鏡に装着ATRアクセサリーを使用すると、LAの赤外（FTIR）スペクトルを変換空間的に分解フーリエ変換を収集するための1提案された方法である魚鱗サンプル中のyers。 ATRアクセサリーは、他のFTIR技術では達成可能ではない、非常に小さい（〜10ミクロン2）空間分解能、高品質のスペクトルの収集が可能になります。同じ研磨された試料ナノインデンテーション実験のために調製された（ 図2）は 、これらの実験に使用した。 <ol><li>高品質のスペクトルは、ATR-FTIRのspectromicroscopyから取得されていることを確認するための分析に使用されているFTIR顕微鏡のための適切な表面と寸法のサンプルを選択してください。 </li><li>データを収集するために、FTIR顕微鏡を準備します。顕微FTIR試料を測定するために使用されるように、同一のサンプリング条件でFTIRシグナルのキャリブレーションを必要とする。典型的には、これは、検出器を冷却し、それが安定するための時間を可能にするだけでなく、同​​一の環境条件下で、すべてのバックグラウンドスペクトルとサンプルスペクトルを集める含む。これは、空気中のため、CO 2と水蒸気、特に重要になることができるDramatically FTIRスペクトルに影響を与える。これは、測定器の光学系が位置合わせされることを保証することも重要である。 </li><li>に対してサンプルを減算するために、適切なバックグラウンドスペクトルを収集します。これらの実験のために、研磨され、金被覆顕微鏡スライドを、FTIRのspectromicroscopyの背景として使用した。 </li><li>適切な対物レンズを使用して、サンプルに焦点を当て、分析の対象となる領域を選択します。 </li><li>関心領域が見つかると、それはATR内部反射要素と密接に接触するまで試料を上げ、FTIR顕微鏡対物レンズにATRアクセサリを取り付け、試料スペクトルを収集する。 </li><li> FTIRスペクトルを収集した後、必要に必要な標準的なデータ処理を行う。 </li></ol> 4。X線コンピュータ断層撮影（CT） <ol><li> 1.1節で述べたように、スケールを取得して準備</li><li>スキャナのセットアップ<ol><li>メーカーの仕様に合わせてウォームアップのX線源。 </li><li>それぞれ、X線電圧、50 kVの160μAの電流の設定。 </li><li> 1450ミリ秒の露光時間を設定します。 </li><li> 1.0ミリメートルのアルミフィルタを選択します。 </li><li>試料ローディングの前に、X線源がオフ（暗視野）である場合フラットフィールド補正を行うと（明視野）へ。 </li></ol></li><li>マウントと負荷試験片 彼らがシフトしたり、スキャンの長さ全体を移動しないように、スケールが可能に取り付けられている必要があります。これらのサンプルはまた、X線に対してほぼ透明である材料を使用してマウントする必要があります。発泡スチロールやパラフィルムの組み合わせは、CTステージにスケールを固定するために使用することができる。 <ol><li>最長寸法は、検出器と平行になるように厳密にサンプルをマウントします。 </li><li>スキャナステージに取り付けられたサンプルを固定します。 </li><li>それは、スキャン全体の回転の中心になるようサンプルを置きます。 </li><li>この場合、全体の規模は視野（FOV）の分野であることを可能にする最高の解像度を選択する7.5以下である。 </li></ol></li><li>取得設定 0.25°の回転工程及び15のフレーム平均値と、この研究でスキャンを実行する。低解像度が許容される場合には、ステップサイズを増加させるおよび/または総スキャン時間を短縮するために平均化フレームを減少させる。 </li><li>再構成パラメータ データセットが得られると、断面画像を含むデータセットを作成するためにX線投影画像を再構成する。以下を除いSKYSCANのNReconソフトウェアのデフォルト設定を選択します。 <ol><li> 20個の環アーチファクト補正を変更します。 </li><li> 25パーセント、ビームハードニング補正を変更します。 </li><li>断面画像のレベルを作るために、CS静的回転を調整します。 </li></ol></li><li>画像処理 最終的な3次元濃淡画像を得ることがSKYSCANのCTANソフトウェアを使用してください。発泡スチロールやパラフィルムから成果物を削除するために適切なレベルにグレースケール範囲を調整します。 </li></ol>ナノインデンテーションおよびmicro-/nano-structure特徴付けのために研磨することによって作製された標本を走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて調べた。低真空モードは、標本の脱水及び導電性コーティングの適用の必要性を最小限にするために利用された。局所的な化学分析は、エネルギー分散型X線分光法（EDX）を用いてSEM画像と併せて研磨し試験体で実施した。 EDX分析は、化学的および機械的特性間の相関を提供するために、ナノインデンテーションによって分析された同じ行/グリッド上で行われた。新たに破砕面はまた、魚鱗中に存在するバイオミネラリゼーションの構造の形態および配向に関するより良い情報を提供するために、SEMにより検査した。破断面上にナノスケールの構造を観察するための分解能を向上させるために、試験片をスパッタ金（Au）でコーティングし、高真空モードで画像化した。以下使用手順に関する追加の詳細を提供します。 <ol><li>研磨された表面のSEM画像<ol><li> SEM室内に研磨し、試料を配置し、0.1〜0.5ミリバールのチャンバ圧力と低真空モードにチャンバをポンプ。 </li><li>約5.0ミリメートルの作動距離を調整します。 </li><li>高電圧（HV）を有効にして、硬鱗質と骨のサブレイヤーまたはその他のテーマの間の移行ゾーンを含む試料上の関心領域に移動します。 </li><li> 15 kVのHVは、約3.9 nAのビーム電流で画像を取得します。 </li><li>画像の焦点を、すべての必要なアライメントおよび非点補正の調整を行う。 </li><li>関連の倍率（通常は250倍〜10,000 X）の多孔質骨対バイオミネラル含有量や密度の変化（ すなわち 、密度の高い骨の識別を支援するために低真空反射電子（BSE）検出器を使用しての関心の少なくとも三つの領域から画像を取り込む）。 </li></ol></li><li>破断面のSEMイメージング<ol><li>破断面を上に​​して、両面カーボンテープを使用して90°のSEMスタブにたて破砕片を貼り付けます。 </li><li>破面上のサブナノメートルの厚さの導電層を提供するために、金でコーティングをスパッタ。 </li><li> SEMチャンバ内に試料を置き、高真空モードにチャンバをポンプ。 </li><li> 3.0〜5.0ミリメートルに作動距離を調整します。 </li><li> HVを有効にして、試料上の関心領域に移動します。この場合、関心のある主な分野は、硬鱗質と骨の層に存在する構造であった。 </li><li>分解能を向上させるために、5〜40kVおよび15kVでのHVと0.24 nAののより低いビーム電流で画像を取得します。 </li><li>最初に試料を集中し、予備的なアライメントを行う。 </li><li>より大きい5000 Xに倍率を増加させ、浸漬/超高解像度（UHR）レンズに通常の電界放出レンズに切り替える。 </li><li> UHRアライメントおよび非点補正の調整を行う。 </li><li>少なくとも三つの領域Oから画像をキャプチャする関連の倍率でのFの関心は（通常は5000 X X 250,000）の二次電子（SE）モードで動作させるレンズ検出器（TLD）を介して使用。 </li></ol></li><li> （SEM像と併せて行う）研磨された表面のEDX分析。これらのパラメータは、モーザー14で説明したようにEDX相互作用体積はナノインデンテーション相互作用体積のサイズに類似している材料に依存しており、調整する必要があります。 <ol><li>インデントの各行の最後に基準マークが示すナノインデンテーションのグリッドが含まれて洗練された試料上の関心領域に移動します。 </li><li> HVは、少なくとも15 kVのであることを確認し、ビーム電流は、少なくとも3.9 nAのであり、作動距離は5.0ミリメートル以上である。 </li><li> EDXを用いて分析される領域のBSEイメージをキャプチャします。 </li><li> EDX分析ソフトウェアを使用して、インデントの線に沿って化学分析を実行するためのエリアを見つけるのを助けるために同じ画像を取り込む。 </li><li> 「オンライン分析」技術、POを使用して最初のインデントで始まり、最後のインデントで終わるインデントの注目ラインに沿って化学分析を実行するための行をsition。 </li><li>線に沿って配置される解析点の数を指定します。これは、化学組成と機械的性質との間の直接の空間相関を提供するために存在する分析点とインデントの同じ番号を使用することをお勧めします。 </li><li>線が正しく配置され、点が指定されると、EDXソフトウェアを使用してライン分析を開始する。 </li><li>ライン分析が完了すると、試料の研磨面上の指定された線に沿って得られた点スペクトルから定量化することに関心の要素を識別します。 </li><li>関心対象の要素が識別されると、制動放射放射線および他の効果を説明するためにバックグラウンド·キャリブレーションを行う。 </li><li>クォンタイズために、指定されたラインに沿った各ポイントでの定量的な分析を得るためにソフトウェアのデコンボリューション解析オプションを選択してください各点での化学組成をtify。 </li><li>ナノインデンテーションを用いて測定した機械的特性を有する空間的相関を補助するために分析された指定された行の画像と共に定量化学分析結果を保存する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

先行研究は、石灰化した魚の鱗の機械的性質を示しているので、実験的観点からは、研究者が依存している自然な鉱物化魚の鱗のような生物学的物質を発生して作業する場合、魚のスケールの空間的位置を報告することは重要であることを覚えておく必要がありますスケールが魚4に位置していた場所へ。 鉱化生物学的材料の機械的特性はまた、試料4の水和状態に依存することが示されている。これが適切に乾燥化石のサンプルを使用、公開文献において公開された結果、水和された新鮮なサンプルを比較しようとしているこの技術の有用性を制限する。したがって、長時間の試験時間は、ナノインデンテーション中にサンプルの機械的性質に脱水の影響を最小限に回避する必要がある。材料固有のパイロット研究は実験を確保することをお勧めしますMENTランタイムは、材料の機械的動作を変更しないために十分最小限に抑えられます。湿潤細胞ナノインデンテーションは、試験装置で許可されている場合は、材料の一定の水和状態を維持することが好ましい方法である。 除荷曲線から弾性率を算出し、この研究で使用したナノインデンテーション法では、材料は線形弾性等方性材料として挙動すると仮定しています。技術は、圧子先端の様々な使用することができる。しかし、65.35°の半角を有する三方バーコビッチ先端をこの研究で使用した。このようなキューブコーナー（半角= 35.36°）のような代替のヒントは、この原稿で提示手順に適していますが、キューブコーナー先端はベルコビッチチップ割れが持つよりもはるかに低い負荷で、試料中に生成することができるよりもより深刻であるため、ベルコビッチチップ。 研磨を最小限に抑えるsurfacに滑らかで平坦な表面を得るために不可欠なステップであるE粗さは、ナノインデンテーション結果に影響を及ぼさない。本稿で提示研磨工程は、使用されている研磨の種類に応じて変更が必要な場合がありますの提案した手順である。しかしながら、正確なナノインデンテーション·データを確保するために重要な工程は、表面粗さが最小化されることで、この特定の材料については50nm最終仕上げは、プローブされる押し込み深さで滑らかな表面を得ることが必要であった。 インデントの間隔は、前のインデントから発生する材料変形の影響を受けない正確なナノインデンテーションデータを保証します。本研究では機器のナノインデンターのユーザーマニュアルには、インデントの間隔がベルコビッチ圧子15の最大侵入深さは少なくとも20-30Xであるべきことを示唆した。代替材料の場合、必要​​なインデントの間隔が開いているに前述したように加えられた荷重及び最大押し込み深さに基づいて決定する必要があります文献16,17。さらに、この材料の保留時間は、使用するナノインデンターソフトウェアのオリバー·ファー分析方法を可能にするプローブした異なる材料相について観察された任意のクリープを克服するために選択した。しかし、オーエン18で説明したように、代替の分析方法は、時間依存材料の応答は、適切な保持時間で克服されない場合があり、生物学的材料のために用意されています。 X線CTから高解像度の結果を達成するために、いくつかの設定を最適化する必要がある。本論文では、ユニークなサイズとレイヤード厚みのある魚の規模での使用のためのパラメータの非常に特定のセットの概要を説明します。サンプルサイズが変化すると、これらの設定は、最高品質のデータセットを得るために調整する必要がある。各パラメータを選択するプロセスは、明らかにマシンが使用されているが付属してマニュアルで定義する必要があります。スキャン設定（電圧、電流、露出、フィルタ選択）と復興の設定（リングアーティファクト、ビームハードニング）は、他のサンプルの大きさと形状の様々な対応するように変更する必要があるかもしれません。 X線CTは、スケールが互いに重ならなかった唯一の材料の骨層を覆う硬鱗質層を識別する全体のスケールモルフォロジーの画像を提供した。 X線CTの画像はまた硬鱗質層がスケールにわたって不均一な厚さからなり、完全に硬鱗質層を欠いていてもピット示したことを確認した。 興味深いことに、空間的にSEM / EDXの化学分析に相関ナノインデンテーションデータは、2層の間に鋭い遷移の代わりに離散P.の鉱化魚鱗について観察されたより緩やかな移行を同定senagalus（Bruetら 2）。 ナノインデンテーションの組み合わせ、FTIR、EDX、およびSEMを確認するために、機械的特性、化学分析、および構造情報を提供しエナメル様の形態と化学と硬鱗質として外層。さらに、これらの技術は、材料の骨層として内層を確認した。 結論として、この研究で概説した方法は、A.の鉱化魚鱗を検査する手順および対応する結果を同定しナノ構造と化学組成までバルク構造からヘラ 。

研究者は、構造的な生体材料を調査して、そのような個々の構成要素に比べてはるかに高い靭性や強度などの改善された機械的性質と構造的な生体材料を提供する設計原理を解明しようとしている。 マダイ7のための装甲魚の鱗の設計原理に調査、 ポリプテルス属senagalus 2,6、 ピラルク3、コイ 4、およびAtractosteusヘラ 1は、構造的な応答を研究するために、既存の実験的方法の適用を拡大する必要性を実証しているおよび微細構造の特性、詳細な標準手順は材料や実験のこれらのタイプでは使用できませんので、。 議論異なる装甲魚の鱗のうち、A.ヘラは、中央アメリカ8の歴史的頂点捕食者であり、高いと種であるLY鉱化さに比例します。以前に9述べた同等の大きさの魚に比べて改善されたプレデター防衛システムを取得するために、皮膚の質量のための種を交換する筋肉量。ページバリ10、Aに従ってヘラは白チョウザメ（ シロチョウザメ）以上の種であること大西洋チョウザメ（ チョウザメ属のオクシリンクス ）と北米最大の三淡水魚である。 Aの高度石灰化した魚の鱗ヘラは最近になって研究されている。トンプソンとマッキューン11がガースケールの形態は硬鱗質外層、骨拡散層と、層状骨層からなる三層の組成を有することを示唆した。 A.上の現在の研究ヘラスケールは、拡散または層状骨領域に骨の層を区別していませんが、ただ一つの内部層1,12として骨領域を研究している。 本研究では、中の手続き微細構造、ナノ構造、化学組成、およびA.のスケールの機械的特性の空間分布をvestigating スパチュラ FTIR分光法の結果に基づいて、SEM、X線CT、及びナノインデンテーション技術が提示されている。

<table><tbody><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>ビューラー</td><td>701-501512</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ硬化剤</td><td>ビューラー</td><td>703-501528</td><td></td></tr><tr><td>サンプルカップ</td><td>ビューラー</td><td>20-8180</td><td></td></tr><tr><td>SamplKlips I</td><td>ビューラー</td><td>20-4100-100S</td><td></td></tr><tr><td>高精度カットオフソー</td><td>ビューラー</td><td>アイソメット</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラメット 2002 ソニッククリーナー</td><td>ビューラー</td><td>B2510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>ポリッシャー</td><td>ビューラー</td><td>49-1750-160</td><td></td></tr><tr><td>1,200 グリット (15 &mu;m) SiC ペーパー</td><td>ストルアス</td><td>40400012</td><td></td></tr><tr><td>4,000 グリット (6 &mu;m) SiC 紙</td><td>ストルアス</td><td>40400014</td><td></td></tr><tr><td>50 nm コロイダルシリカ</td><td>ビューラー</td><td>40-10075</td><td></td></tr><tr><td>50 nm 懸濁液用ケモメット研磨パッド</td><td>ビューラー</td><td>40-7918</td><td></td></tr><tr><td>ナノインデンター</td><td>MTS</td><td>G200</td><td></td></tr><tr><td>FTIR 連続顕微鏡</td><td>サーモニコレット</td><td>6700</td><td></td></tr><tr><td>X 線コンピュータ断層撮影</td><td>スカイスキャン</td><td>スカイスキャン1173</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>FEI</td><td>NovaNanoSEM 630</td><td></td></tr><tr><td>EDX</td><td>Bruker</td><td>AXS Xflash検出器4010</td><td></td></tr><tr><td>スパッタコーター</td><td>デントン</td><td>デスクII</td><td></td></tr></tbody></table>

多層魚の鱗の特性（<em&gt; atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、x線ct、ftir、およびsemを用いて

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

このような鉱物化魚の鱗、腹足類の貝殻、ラムの角、枝角、および亀の殻のような保護の生物学的物質の階層アーキテクチャは、将来的に保護材料やシステムの設計をガイドするためのポテンシャルを持つユニークな設計原理を提供します。障害が開始マイクロおよびナノスケールでこれらの材料系のための構造 - 特性の関係を理解することが不可欠です。現在、このようなナノインデンテーション、X線CT、およびSEMなどの実験技術は、これらの材料系1-6の階層的微細構造を有する機械的挙動を相関させる方法を研究者に提供する。しかし、石灰化した生体材料の試料を調製するための、明確に定義された標準的な手順は現在使用できません。本研究では、空間相関化学的、構造的、およびA.多層のスケールの機械的特性をプロービングするための方法ヘラナノインデンテーションを使用して、とのFTIR、SEM、エンERGY分散型X線（EDX）微量分析、およびX線CTを提示する。

図3は 、約800ミクロン、長、短軸横断断面にわたって実施し、空間的に相関nanoinidentation / SEM / EDX分析の平均結果を示す。約60μmの厚さの硬鱗質層では、ナノインデンターは69.0 GPaで3.3 GPaでの硬さの平均弾性率を算出した。ナノインデンターは、約740ミクロ​​ンの厚さの骨の層のための0.5 GPaの14.3 GPaで、硬度の平均率を決定した。 EDXは、典型的には、鉱化スケールに見出される炭素、酸素、カルシウムおよびリンを、決定した。しかし、硬鱗質と骨の層は、化学組成物中の定量化の違いを含んでいた。骨層において観察されたカーボンスパイクはまた、BSE画像全体の明るさで観察された減少を引き起こした炭素のわずかな増加をもたらすものなどの高度に石灰化した領域ではないことに起因し得る。具体的には、硬鱗質層 &#39;、Sは、Caの原子濃度比の平均：1.71のPが1.67の理論比でハイドロキシアパタイトと同様に見えた。骨層の平均のCa：P比は硬鱗質層からの石灰化の量の減少を示す1.51に減少した。 骨層及び硬鱗質層用の図4のFTIRスペクトルは、アミド、カルボン酸、リン酸、及びカルボニルなどの主要な官能基を同定した。具体的には、FTIRは、内側（骨）の層に外側（硬鱗質）層とコラーゲンの署名にハイドロキシアパタイト署名の目視観察を確認した。 3,500-3,000 cm -1に起因する1550〜1,500 cm -1の間のNH伸縮及びNHで曲げのピークは骨の層にアミド基を表す。波数1,470-1,365センチの領域におけるピーク-1のアミド置換アルキル基を表す。さらに、1641センチメートルで延伸独特のC = Oは-1骨層上に観察された。エンドウ3,000-2,500センチ-1からKSはカルボキシル基を表す。骨と硬鱗質両層&#39;スペクトルは1,079.33 CM -1リン酸を延伸することを示すに近い独特のピークを作り出した。 図5のX線CT画像は硬鱗質層はスケールが互いに重なり合う骨層を覆っていないことを捕捉する。濃い灰色の骨層が低密度の少ない硬いのフェーズを示しながら、明るいグレー硬鱗質層は、より密難しく、そして堅い段階を示している。また、X線CT画像は硬鱗質層の厚さの不均一性を識別するのに助け。実際には、明確なピットは全く骨の層をカバーしていない硬鱗質層の中心部に近い観測される。 H 3 PO 4でエッチング破断面図6AのSEM画像は、硬鱗質層用積層パターンで組織化ナノ構造を明らかにした。このナノロッド組織化構造は硬鱗質領域に対してFTIRから得たハイドロキシアパタイトの署名と相関する。 図6Aは、明確に破線で硬鱗質と骨の層の間の遷移を識別する破断面の典型的な低倍率のSEM顕微鏡写真を示す。 図6Bは、H 3 PO 4を用いたエッチング後の破断面の高倍率SEM像を描いている。繊維状ナノ構造は、骨層において観察されている間エッチング後、外側硬鱗質層における配向ナノロッドは明確に識別可能である。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig3.jpg" /> 図3モジュラスおよび硬度データをSEM / EDXの化学組成に空間相関ナノインデンテーションする。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig4.jpg" /> 図4。層（骨の）（硬鱗質）、外側と内側から収集されたFTIRスペクトル。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig5.jpg" /> 図5の外側（硬鱗質）上のピッチングを示した。X線CT画像は、内側（骨の）層を覆う層を形成する。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51535/51535fig6.jpg" /> 図6の典型的な破断面の（A）低倍率のSEM像、（B）は、外側（硬鱗質）中のナノロッドの高倍率の画像と内側の（bにおける繊維ONY）の層が.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51535/51535fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

本稿では、空間相関化学的、構造的、およびナノインデンテーションを用いAtractosteusへらの多層スケール（A.ヘラ ）の機械的特性をプロービングするために使用される方法を提示し、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、走査電子顕微鏡（SEM）およびX-線が断層撮影（X線CT）を計算しました。実験結果は、保護生物学的材料の設計原理を調査するために使用されてきた。

多層魚の鱗の特性（<em&gt; Atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

この手順の目的は、X線コンピューター断層撮影（X線CT）、ナノインデンテーション、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、およびエネルギー分散型X線分光法（EDS）を併用した走査電子顕微鏡（SEM）を用いて、多層構造を持つ魚類鱗の鉱質化構造、化学組成、および機械的特性を明らかにすることです。まず、鱗から軟組織を除去し、鱗を固定・切断した後、段階的な研磨を行うことで、個々の鱗を分析可能な状態に調整します。次に、ダイヤモンド製のベルコビッチ圧子を用いて鱗の断面に沿って空間的に相関させたナノインデンテーションを行い、局所的なナノ機械的特性を測定します。次に、魚鱗の内層および外層をFTIR顕微鏡で観察し、それぞれの層における主要な官能基を特定します。最終ステップとして、走査電子顕微鏡のEDX検出器を用いて、魚鱗に施したナノインデンテーションと局所的な化学組成との相関性を調べ、異なる層や破断面におけるインデントの画像を撮影します。最終的に、これらの多様な実験手法を組み合わせることで、構造と特性の関係を理解し、鉱質化した魚鱗の天然の設計原理を明らかにします。バルク統計的ナノインデンテーションなどの他の既存の試験法に対する本手法の主な利点は、化学組成構造と局所的な機械的特性との間に直接的な相関を提供できる点にあります。関心領域において、我々はこの手法を構造バイオマテリアルにおける空間分布、化学組成構造、および機械的特性の研究に適用してきました。また、セメント系材料や多相複合材料をはじめ、マイクロメートルおよびナノメートルスケールで不均一性を示すあらゆる種類の不均一材料への多くの応用が可能です。魚鱗の短軸の横断面を観察するために、市販のプラスチック製サンプルホルダーを使用して、エポキシ樹脂で封入する際にサンプルの向きを正しく維持しながら、直径32 mmのサンプルモールドに魚鱗を固定します。サンプルをモールドに固定した後、未硬化のエポキシ樹脂をサンプルの上に注ぎます。製造元の指示に従ってエポキシ樹脂を硬化させた後、ダイヤモンドブレード高精度切断機を用いて、サンプルの正中線で封入したサンプルを切断します。サンプルをナノインデンターにロードした後、ソフトウェアコントロールを使用して試料を最初のインデント位置まで移動させます。この位置から開始し、統計的に有意なデータセットを得るために、15 µm間隔で4列の平行なインデントを行います。次に、ナノインデンターの最大荷重を5 mN、負荷および除荷速度を0.1 mN/s、保持時間を30 s、各列の最小インデント間隔を5 µmに設定します。バッチ処理が完了したら、ナノインデンターを用いて、最初と最後のインデント位置に最大荷重100 mNで基準インデントを作成します。これらはそれぞれ、骨層前のエポキシ樹脂内および骨層後のエポキシ樹脂内に配置される必要があります。ナノインデンテーション後、さらなる脱水を防ぐため、サンプルをPBS溶液に戻します。サンプルの最も長い辺が検出器と平行になるようにしっかりと固定します。スキャナーの設定後、スチロフォームやパラフィルムなど、X線透過性の材料を使用して、固定したサンプルをスキャナーのステージに固定します。試料を回転中心に位置するように配置します。スキャン中は、スケール全体が視野に入る最高解像度を選択してください。本事例では7.5 micrometersとなります。データ取得後、X線投影画像を再構成し、断面画像を含むデータセットを作成します。次に、ソフトウェアを使用して最終的な3Dグレースケール画像を取得します。発泡スチロールやパラフォームによるアーティファクトを除去するため、グレースケールの範囲を適切なレベルに調整します。研磨済み試料上のナノインデントをSEM（走査電子顕微鏡）で観察する場合、インデント面を上にして、両面カーボンテープを用いて試料をSEMスタブに固定します。続いて、試料をSEMチャンバー内に設置し、チャンバー内を低真空モードまで排気します。作動距離を 3.0 から 5.0 millimeters の間に調整します。高電圧を印加し、試料上の関心領域（本例では anoe 層および骨層に存在する構造）に移動します。次に、加速電圧を 5 kilovolts から 15 kilovolts、ビーム電流を 3.9 nano amps の低電流に設定して画像を取得します。解像度を向上させるため、低真空反射電子BSE検出器を使用して、少なくとも3つの関心領域から250倍から10,000倍の倍率で画像をキャプチャし、バイオミネラル含有量および密度の変化の同定を補助します。その後、研磨済み試料上の、インデント列の各端にフィデューシャルマークで示されたナノインデンテーショングリッドを含む関心領域に移動します。高電圧が少なくとも15 kilovoltsであることを確認してください。ビーム電流を少なくとも 3.9 nano amps に設定し、作動距離を 5.0 millimeters 以上にします。次に、EDX で分析する領域の後方散乱電子像をキャプチャします。EDX 分析ソフトウェアを使用してください。圧痕のラインに沿って化学分析を行う領域を特定しやすくするため、同じ画像をキャプチャします。次に、ライン分析手法を用いて、最初の圧痕から最後の圧痕まで、関心のある圧痕のラインに沿って化学分析を行うためのラインを配置します。化学組成と機械的特性の直接的な空間相関を得るために、ライン上の分析点数を、存在する圧痕数と同じ数に指定します。ラインの位置決めを行い、ポイントを正しく指定します。ライン分析の完了後、EDXソフトウェアを使用してライン分析を開始します。試料の研磨面上の指定されたラインに沿って得られたポイントスペクトルから、定量化する目的元素を特定します。関心のある元素が特定されたら、制動放射線などの影響を補正するためにバックグラウンド校正を行います。ソフトウェアのデコンボリューション解析オプションを選択し、指定した直線上の各点における定量解析を行い、各点の化学組成を定量化します。最後に、定量的な化学分析結果を、解析した指定直線の画像と共に保存します。これにより、ナノインデンテーションを用いてanoe層で測定した機械的特性との空間的な相関を容易にします。ナノインデンテーションにより算出された平均弾性率は69.0 giga pascals、硬度は3.3 giga Pascalsでした。ナノインデンテーションにより、骨層の平均弾性係数は14.3 giga pascals、硬度は0.5 giga pascalsであることが決定されました。anoe層と骨層には、化学組成に定量可能な差異が含まれています。骨層における炭素のスパイクは、低ミネラル化に起因していると考えられ、これにより炭素の増加とBSE像の輝度の低下が生じます。骨層およびENE層のFTIRスペクトルでは、外側のgwe層にヒドロキシアパタイトのシグネチャーが、内側の骨層にコラーゲンのシグネチャーが示されています。X線計算機断層撮影（CT）により、鱗が重なり合っている部位ではgwe層が骨層を覆っていないことが示されています。明るい灰色のgwe層は密度が高く、より硬く剛性が高い一方、暗い灰色の骨層は密度が低く剛性も低くなっています。ging層の中央付近には明らかなピット（孔）が観察され、その不均一性が示されています。エッチング処理を施した破断面の低倍率SEM像では、ging層に層状に組織化されたナノ構造が認められ、これはFTIRの結果と相関しています。破断面の高倍率SEM像では、ging層に配向したナノロッドが見られる一方、骨層では発達後に繊維状のナノ構造が観察されます。この手法は、化学組成、構造、および機械的特性の空間分布を研究するためのバイオマテリアルや複合材料に関するさらなる研究への道を開き、また多相複合材料における界面の解析にも寄与しました。さて、このビデオを視聴したことで、構造バイオマテリアルにおいて化学組成を構造および機械的特性と空間的に相関させるための試料作製法および解析手法について、十分に理解できたはずです。これらの手法は、他の種類の不均一な多相材料の研究にも適用および適合させることが可能です。

characterization-multi-layered-fish-scales-atractosteus-spatula-using

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多層魚の鱗の特性（

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