ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのStrep-Tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製

こんにちは。フィンランドのヘルシンキ大学のChristina McKennanです。特定のタンパク質複合体を特性解析する上での課題の一つは、その分子組成を決定することです。そのためには、細胞内環境から複合体を単離および精製するための手法を開発する必要があります。

微生物研究の分野において、我々は植物ウイルスと宿主の相互作用を研究しており、そのため、感染中に形成される様々なウイルスリポヌクレオタンパク質複合体に関心を持っています。これまで、我々はアフィニティータグを用いた精製法を用いて、これらの複合体の研究に成功してきました。その中で、Twin-Strepタグが最も優れたタグの一つであることが証明されました。

しかしながら、本手法の使用において、収率が低いといったいくつかの制限が観察されたため、私たちはこの方法を改善したいと考えました。こんにちは、マタです。ここから実験プロトコルをご案内します。まず、本手法の概要について説明します。

twin-strepタグ付きタンパク質とその生理的な結合パートナーとの間の特異的な複合体を精製するために、Strep-Tactin macro prepビーズを使用します。緑色に示されているのはStrepタグ付きのテトラマーであり、青色がtwin-strepタグ付きタンパク質、オレンジ色がその結合パートナー、そして赤色が2つのStrepタグを表しています。

標準的な手法では、グレーで示されている未結合のタンパク質を洗浄によって除去します。結合した複合体は、ピンク色で示されているビオチンを用いて競合的に溶出させます。しかし、この手法を用いた際、結合した複合体の溶出が不完全であり、Strep-Tactinビーズから脱離できたのはごく一部であることが観察されました。

これにより、標的タンパク質の回収率が低くなります。さらに解析を困難にする要因として、S-D-Sを用いた変性溶出を行うことで標的タンパク質の回収率を向上させることができます。変性したTwin-Strep-tagベイトタンパク質の周囲にミスセルが形成されます。

その結合パートナーおよび解離したstrept actinモノマーの周囲に存在します。サンプルをさらに質量分析で解析する必要がある場合、放出されたstrept actinによるサンプルの汚染は許容できません。このサンプル汚染の問題を克服するため、我々はstrep tachinテトラマーを化学架橋によってあらかじめ安定化させる手法を開発しました。

得られた架橋樹脂を用いて、ベイトタンパク質およびその結合パートナーを精製します。SDSによるサンプル溶出で高いタンパク質回収率を確保し、樹脂の化学的架橋により、放出されたstreptタグによるサンプルの混入なく、streptタグ付きベイトタンパク質とその結合パートナーを溶出させます。2 mgのBS3架橋剤を含む密閉したマイクロチューブを室温で平衡化させます。

ピペットチップの先端を切り落とし、レジン転送用の準備をします。Strep-TactinおよびMacro-Prepレジンを短時間激しく振盪して再懸濁し、直ちに懸濁液600 µLをCoStar Spin-Xフィルターカラムに移し、4,000 RPMで30秒間遠心分離します。室温で450 µLのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。このステップの目的は、一次アミンを含むTrisを、非反応性のリン酸で置換することです。

フロースルーを廃棄します。チューブを数回反転させて内容物を混合します。遠心分離と洗浄のステップを2回繰り返し、レジンを430 µLのPBS pH 8に残します。

最後の遠心分離後、100 µLのMilli-Q水を含むピペットチップで、マイクロチューブのフォイルに穴を開けます。緩やかにピペッティングを行い、BS3パウダーを水に溶解させます。BS3が完全に溶解したら、直ちに溶液20 µLをSpin Xカラムに加えます。内容物が適切に混合されるようにしてください。

コラムを室温で30分間回転させ、レジンがBS three溶液と十分に混合されるようにします。反応を停止させるため、塩酸でpH 7.5に調整した3 MのTrisを6 µL加えます。コラムを室温でさらに15分間回転させた後、4,000 RPMで30秒間遠心分離します。

室温で、架橋樹脂を450 µLのTween 20含有トリス緩衝生理食塩水（TBS）に懸濁させ、流出液を捨てます。遠心分離と洗浄の手順をさらに2回繰り返します。最後のステップで、樹脂を450 µLのTBSに再懸濁させます。樹脂懸濁液を新しいチューブに移し、カラムに残った樹脂をさらに450 µLのTBSで再懸濁させ、同じチューブに移します。

樹脂をカラムからチューブに最大限に回収するため、前述の工程をもう一度繰り返します。樹脂懸濁液が入ったチューブを室温で10分間静置し、液量を600 µLに調整します。余分なTBSを除去することで、樹脂はすぐに使用できる状態となり、また凍結させずに4 °Cで保存することも可能です。

本手法は、あらゆるTwin-Strepタグ融合タンパク質およびその関連複合体の精製に適しています。タンパク質は動物、植物、または細菌由来であり、全細胞溶解物または濃縮された細胞小器官画分のいずれからでも単離可能です。本例では、ウイルス感染植物の核画分から、ジャガイモウイルスAのTwin-Strepタグタンパク質VPG Proを単離します。まず、結合バッファーに含まれる1 mLのベイトタンパク質サンプルを、4 °Cで13,000 RPMで10分間遠心分離することから開始します。

内因性のビオチン化タンパク質がstrep tactおよびレジンに結合するのを最小限に抑えるため、上清を新しいチューブに移します。Avadonを最終濃度100 µg/mLになるように加え、内容物が十分に混合されるようにします。4 °Cで15分間回転混和させます。

架橋樹脂をボルテックスで再懸濁し、カップピペットチップを用いて、樹脂懸濁液 50 µL をベイトタンパク質サンプルが入ったチューブにすぐに加えます。そのまま 4 °C でさらに 30 分間回転混合させます。サーモミキサーを 55 °C に設定し、溶出ステップで使用する Elu バッファー 500 µL を予め加熱しておきます。4 °C、2000 RPM で 1 分間遠心分離します。

上清を廃棄し、あらかじめ冷却した洗浄バッファー1(wash buffer 1) 1 mLで樹脂を洗浄します。4 °Cで5分間回転させます。遠心分離と洗浄のステップを計3回繰り返します。

樹脂を250 µLの洗浄バッファー2に再懸濁し、樹脂懸濁液を新しいSpinxカラムに移します。チューブに残っている樹脂をさらに250 µLの洗浄バッファー2で再懸濁し、同じカラムに移した後、4°C、2000 RPMで3分間遠心分離します。カラムを新しい2 mLのドルフィンノーズチューブに移し、ろ液を廃棄します。

直ちに次の溶出ステップに進みます。あらかじめ加熱した溶出バッファー150 µLをspinxカラムに加えます。サーモミキサーを用いて55 °Cで5分間、1400 RPMで振盪しながらインキュベートします。室温で4,000 RPMで1分間遠心分離し、カラムを廃棄します。

精製された標的タンパク質はこれでさらなる解析に使用でき、-20°C以下で保存可能です。画像から、ビオチンを用いたStreptactin Macro-Prepレジンからのタンパク質溶出は、SDSを用いた溶出に比べて不完全であることがわかります。ウェスタンブロットのシグナル強度の違いは、これら2つの溶出手法で得られたタンパク質収量の差を反映しています。SDSによる溶出はビオチンによる溶出よりもはるかに効率的ですが、放出されたStreptactinによってサンプルが汚染されることになります。

画像は、StreptactinマクロプレップレジンからのSDS溶出物（EIT）の銀染色ゲルを示しており、左側のレーンには遊離したStreptactinが存在し、右側のレーンには存在しないことがわかります。左側のサンプルは非架橋レジンから溶出させたものであり、右側のサンプルはBS3で架橋したレジンから溶出させたものです。これらの結果に基づき、BS3による架橋が、SDS溶出時のレジンからのStreptactinの遊離を抑制すると結論付けられます。

この例では、BS3で架橋されたStrept actin macro prep resinを用いて、ベイトタンパク質であるVPG PROとその結合パートナーを精製しました。精製サンプルの分注液を質量分析にかけ、タンパク質の同定を行いました。ネガティブコントロールにおいて特定のバンドが見られないことは、プルダウンの特異性を裏付けています。

下のバンドはベイトタンパク質であるVPG PROに相当し、上のバンドは質量分析によって同定されたその結合パートナーであるNIB replicateに相当します。ここまで、化学架橋を用いることで、strep tact inレジンからの溶出および変性に伴う制限をどのように克服できるかについて説明しました。この手法は、タンパク質-タンパク質複合体の精製に加えて、ホルムアルデヒドで可逆的に架橋されたものを含む、核酸を含むタンパク質複合体の精製にも利用可能です。

最後に、この方法はstrep tech膜タンパク質の精製に使用できます。界面活性剤を用いて可溶化します。これらの疎水性タンパク質を溶液中に保持するためには、界面活性剤が必要です。

しかしながら、それらの存在によって、strep-taneの放出に伴うサンプルのコンタミネーションが生じる可能性があります。穏やかなビオチン溶出を用いる場合であっても、レジンの架橋によってサンプルコンタミネーションの問題を解決できると考えています。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功を願っております。