Name: ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのStrep-Tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: 学ぶツインStrepタグ融合タンパク質の精製法。BS3架橋したStrep-Tactin樹脂を用いて、ウイルスリボ核タンパク質複合体を高速かつ高純度に分離し、質量分析による解析も可能にする革新的な手法です。

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我々は感謝SiniがMiettinen、みんなPöllänenとたるRautavesiの技術サポートを認める。私たちは、HEKに録音機器を提供するためのツインStrepタグ、GFPとペッカEvijärviを発現する293細胞を提供するためのヘルカNurkkalaに感謝します。この作品は、フィンランド·アカデミーによって資金を供給された、数字138329、134684と258978を付与します。

ビスのStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂の1。架橋（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3） <ol><li>室温にBS3架橋剤の2ミリグラムを含む1密封されたマイクロチューブを平衡化させます。注意：BS3は、危険な物質である。保護手袋、ゴーグルを着用してください。 </li><li>再懸濁のStrep-Tactinのメタクリル樹脂（100 mMトリス - 塩酸、pH8.0の50％懸濁液、1mMのEDTA、150mMのNaCl）による簡単な激しく振盪し、すぐにピペットチップを用いてスピンカラムに懸濁液600μLを転送最後に切り落とした。 </li><li>室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、カラムにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）450μlのを追加します。 </li><li>完全にPBSでトリス緩衝液を交換し、最後の遠心分離後のpHを8.0に調整のPBS 430μlに樹脂を残すように、前のステップ2を複数回繰り返します。 </li><li> 100を含むピペットチップでBS3とマイクロチューブの箔を穿刺1、超純水のL。優しく上下にピペッティングし、水中でBS3の粉末を溶解し、すぐにスピンカラムに溶液20μlを加える。架橋反応におけるBS3の最終濃度は〜1.2 mMである。 </li><li>室温で30分の列を回転させます。樹脂はBS3溶液と適切に混合されていることを確認してください。 </li><li>反応をクエンチし、3Mのトリス-HCl、pH7.5中の6μlを添加し、室温でさらに15分間、カラムを回転させる。 </li><li>室温で30秒間1500×gで遠心分離する。フロースルーを捨て、トリス450μlの中で架橋した樹脂を再懸濁トゥイーン20（TBST）で緩衝生理食塩水。遠心分離を繰り返して、手順をさらに2回洗う。最後のステップでは、TBSを450μlの樹脂を再懸濁。 </li><li>カットオフ末にピペットチップを使用して、新しいチューブに樹脂懸濁液を転送します。 TBS系の別の450μLでカラムに残った樹脂を再懸濁し、同じチューブに移す。繰り返し目もう一度チューブにカラムからの樹脂の最大転送を確保するための電子最後のステップ。 </li><li>チューブを室温で10分間放置し、過剰のTBSを除去して600μlの体積を調整してみましょう。樹脂は、そのまま使用することができます（推奨）または凍結することなく、4℃で保存することができます。 </li></ol> 2。架橋のStrep-Tactinのポリメタクリレート樹脂にツイン·Strepタグbaitタンパク質と会合した複合体の結合<ol><li> 4℃で10分間、17,000×gで、結合緩衝液中のベイトタンパク質サンプルの遠心分離機1 mlの上清を新しいチューブに移す。 </li><li> 、連鎖球菌-Tactinの樹脂に対する内因性ビオチン化タンパク質の結合を最小限に100μg/ mlのの最終濃度にアビジンを追加し、4℃で15分間回転させるには<ol><li>ステップ1.10から架橋された樹脂は4℃で長期間保管した場合、400×gでのfoでの遠心分離によって樹脂を回収4℃でR 1分、上清を廃棄し、TBST 1mlで樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返し、洗浄は、まずTBSTで、その後TBSで2回、繰り返します。 4℃で1分間400×gでチューブを遠心分離し、過剰のTBSを削除して元のボリュームに調節してください。 </li></ol></li><li>ボルテックスにより架橋された連鎖球菌-Tactinの樹脂を再懸濁します。すぐに切断されたピペットチップを用いてベイトタンパク質試料を含むチューブに樹脂懸濁液50μlを添加し、4℃でさらに30分間回転させる</li><li>待っている間、55℃にサーモを設定し、ステップ3.1で使用するために、溶出緩衝液500μlを予熱。 </li><li> 4℃で1分間400×gで遠心分離上澄み液を捨て、あらかじめ冷却洗浄バッファー＃1の1ミリリットルで4℃で5分間ローテーター上樹脂を洗浄。遠心分離を繰り返して、手順3回洗浄する。最後のステップでは、洗浄バッファー＃2の250μlの樹脂を再懸濁。 </li><li> TR<html>新鮮なスピンカラムに樹脂懸濁液をansfer。洗浄バッファー＃2の別の250μlのチューブ内に残った樹脂を再懸濁し、同じ列に移す。 </li><li> 4℃で3分間400×gで遠心し、フロースルーを捨て、新鮮なイルカ鼻2ミリリットルチューブにカラムを移す。以下の溶出ステップにすぐに進んでください。 </li></ol>特定のタンパク質複合体の3。溶出<ol><li>ステップ2.4​​からのスピンカラムに予熱した溶出バッファー150μLを加える。 </li><li> 1,400 rpmで振とうし、55℃で5分間サーモミキサー中でインキュベートする。 </li><li>室温で1分間1500×gで遠心分離する。 </li><li>列を捨て、≤-20℃で精製された標的タンパク質を保存する</li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;">のNa 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaClを</td><td style="width:299px;"> 137 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">塩化カリウム</td><td style="width:299px;"> 2.7 mMの</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> （セクション1.4のpH 8.0）、特に明記しない限り、pHを7.4に調整した</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">トリス生理食塩水（TBS）にバッファリングされた</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH7.4の</td><td style="width:299px;"> 50 mMの</td></tr><tr height="20"><td hei<html> GHT = &quot;20&quot;スタイル= &quot;高さ：ULは幅：299px;&quot;&gt;のNaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mMの</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">トリスはトゥイーン20（TBST）で緩衝化生理食塩水</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH7.4の</td><td style="width:299px;"> 50 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaClを</td><td style="width:299px;"> 150 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トゥイーン20 </td><td style="width:299px;"> 0.1％（v / v）の</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">結合バッファー</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH8.0の</td><td style="width:299px;"> 25 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaClを</td>X; &quot;&gt; 550 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaFを</td><td style="width:299px;"> 5 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0.5 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">グリセロール</td><td style="width:299px;"> 10％（v / v）の</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0.1 mMの</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">洗浄バッファー＃1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH8.0の</td><td style="width:299px;"> 25 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaClを</td><td style="width:299px;"> 500 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaFを</<html> TD&gt; <td style="width:299px;"> 5 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0.4 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> IGEPAL CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0.2％（v / v）の</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">グリセロール</td><td style="width:299px;"> 5％（v / v）の</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0.1 mMの</td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;">洗浄バッファー＃2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH8.0の</td><td style="width:299px;"> 25 mMの</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaClを</td><td style="width:299px;"> 150 mMの</td></tr><tr height="20">2 &quot;高さ=&quot; 20 &quot;スタイル=&quot;高さ：ULは幅：597px; &quot;&gt;溶出バッファー</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;">トリス-HCl、pH8.0の</td><td style="width:299px;"> 25 mMの</td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1％（w / v）の</td></tr></tbody></table> 表1本研究で用いたバッファ。

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

上記のプロトコルは、ビオチンまたは強力な変性剤を含まない任意の適切な緩衝液中の目的とそれに関連する複合体のいずれかの二Strepタグベイトタンパク質を精製するために使用することができる。プロトコルの現在のバージョンでは、結合および洗浄は、高い塩および非イオン性界面活性剤の存在下で比較的ストリンジェントな条件下で行われる。これはより少ないバックグラウンドをもたらすが、壊れやすいタンパク質複合体は、これらの条件下で解離してもよい。このような低い親和性複合体を維持するために、塩濃度を低下させることができ、非イオン性界面活性剤は、緩衝剤を結合および洗浄から減少又は省略することができる。 ツインStrepタグシステムの主な利点はあっても、バッチ中の標的タンパク質およびその複合体の効率的な一段階精製を可能にする、操作されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）1〜2小（3kDa）タンデムタグの高親和性であるモード。なぜならツインStrepタグの強い結合のストレプト-Tactinのために、樹脂は、より高い標的タンパク質純度をもたらす高い界面活性剤および/または塩濃...

近年では、Strepタグ技術は、プロテオミクスと構造生物学などの生物医学研究の多くの分野で広く使用されるようになった。ショートStrepタグペプチドに組換えタンパク質の融合に依存するこのタンパク質精製技術は、ストレプト-Tactinの、改良されたペプチド結合能を有するストレプトアビジンの遺伝子操作された変異体を担持するアフィニティーマトリックスの出現により成熟した図1、図2ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、組換えタンパク質のより効率的な浄化を保証する、単一のStrepタグを含有するものよりストレプ-Tactinのマトリックスに対して高い親和性を示し、そしてそれに関連付けられた結合パートナー。しかし、連鎖球菌-TactinのにツインStrepタグタンパク質の高い親和性はまた、その欠点を持っています。過剰のビオチンを有するこのようなタンパク質の競合的溶出は、標的タンパク質の収率の低下につながる、不完全であってもよい。 M鉱石効率的な代替は、SDSで溶出されていますが、プロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinのとの望ましくないサンプル汚染につながる。本論文では、最初に化学架橋した後、得られる架橋樹脂からツインStrep-tag IIタグタンパク質およびそれに関連する複合体を溶出させるために、SDSを使用してのStrep-Tactinの樹脂結合型四量体を安定化させることにより、この制限を克服するための技術を提供します。したがって、十分なタンパク質収量、それによって、質量分析によるさらなる分析を可能にする、ストレプト-Tactinの試料汚染することなく達成することができる。 この方法は、表面に露出SIIIタグ3又は二Strepタグ（アミノ酸配列WSHPQFEK（GGGS）3 WSHPQFEKそれぞれSAWSHPQFEK（GGGS）2 GGSAWSHPQFEK）を有する任意の組換え融合タンパク質の精製に適している。タンパク質は、動物、植物または細菌起源のものとすることができ、全細胞のいずれかから単離することができる溶解物または濃縮された細胞小器官画。例として、ここでは、PVAに感染したベンサミアナタバコ植物の核画分からのジャガイモウイルスA（PVA）4のSIIIタグ化タンパク質のVPg -プロの精製を説明します。以前に以下の改変を、5に記載のように、核画分を単離した細胞をホルムアルデヒドで処理しなかった、酪酸ナトリウム、5 mMのフッ化ナトリウムとのすべてのバッファに置換し、完全プロテアーゼ阻害剤は、PMSFで置換し、抽出におけるトリトンX-100濃度バッファ＃2は0.3％に低下した（v / v）で（抽出緩衝液＃3）ショ糖クッションを通した遠心分離により得られた核ペレットを、予め冷却した結合緩衝液1.45中に再懸濁し、4℃で1.5時間回転SIIIタグ化ベイトタンパク質と会合した複合体（ベイトタンパク質試料）を含有する得られた核抽出物（セクション2を参照）、以下に記載されるプロトコルに従って処理した。

<table><tbody><tr><td>ビス(スルホスクシンイミジル)サブレート(BS3)、No-Weigh形式、8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com 注意:危険物質。深刻な呼吸器、皮膚、目の炎症を引き起こします。保護手袋と目の保護具を着用してください.</a</td></tr><tr><td>>Strep-Tactin MacroPrep 樹脂 (50% 懸濁液)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Spin-X 遠心分離管フィルター、酢酸セルロース膜、細孔サイズ 0.45 &mu;m、非滅菌</td><td>Costar(コーニング)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Dolphin-nose tubes</td><td>コスター(コーニング)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのstrep-tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（bs3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

操作されたストレプトアビジン（のStrep-Tactinの）を有する樹脂上Strepタグ融合タンパク質のアフィニティー精製は、生理学的条件下でタンパク質複合体の単離のために広く用いられる方法となった。ツインStrepタグまたはSIIIタグを指定StrepタグIIの2つのコピーを含有する融合タンパク質は、より効率的なタンパク質精製を可能にする、単一のStrepタグを含有するものと比較してのStrep-Tactinのための高い親和性の利点を有する。しかし、この利点は、ビオチンとのツインStrepタグタンパク質の溶出は低タンパク質の回収につながる、不完全になる可能性があるという事実によって相殺される。回収率は劇的にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で変性溶出を使用することによって改善することができるが、これは下流のプロテオーム解析を用いたアッセイ互換性がなくなり、樹脂から遊離のStrep-Tactinの混入をサンプリングするために導く。この制限を克服するために、我々は、ストレプト-Tactinの方法により、樹脂結合型四量体を開発した第ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）で処理し、得られた架橋樹脂との架橋は、単一のバッチ精製段階における標的タンパク質複合体を精製するために使用される共有結合によって安定化される。ストレプト-Tactinのを汚染の不在は、質量分析による下流のタンパク質分析を可能にしながら、SDSによる効率的な溶出は、優れたタンパク質回収を確実にします。概念実証として、我々はここではウイルスに感染したNの核からSIIIタグ付きウイルスタンパク質のVPg-Proを精製するためのプロトコルを記述BS3と架橋したストレプト-Tactinのポリメタクリレート樹脂を用いてベンサミアナタバコ植物 。同じプロトコルは、目的の任意の二Strepタグタンパク質を精製し、その生理学的結合パートナーを特徴付けるために使用することができる。

精製手順を模式的に一緒に他の既存の精製方法に伴う問題の表現と、 図1に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> 図1精製手順の概略図。ワークフローは、共有結合架橋樹脂に二Strepタグベイトタンパク質と会合した複合体の結合を、BS3との架橋を介して樹脂結合されたストレプト-Tactinのテトラマーの安定化を含む、1％SDS、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC-MS/MS）によるそれらの分析と特異的に結合したタンパク質複合体の溶出を、変性、非結合タンパク質を洗浄した。ベイトタンパク質の二つの赤い球はツインStrepタグを示している。他の精製方法の限界は、挿入図に示されている右側のボックス。彼らは、ストレプト-Tactinの1％SDSで...

この方法は、ツインのStrepタグ融合タンパク質と共有結合的にビス（スルホスクシンイミジル）（BS3）で架橋された修正されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）樹脂上での具体的な複合体の効率的な精製方法が記載されている。この方法は、速い速度の利点は、良好な標的タンパク質の回収および高純度を有し、質量分析によるその後の分析に対応している。

ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのStrep-Tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

こんにちは。フィンランドのヘルシンキ大学のChristina McKennanです。特定のタンパク質複合体を特性解析する上での課題の一つは、その分子組成を決定することです。そのためには、細胞内環境から複合体を単離および精製するための手法を開発する必要があります。微生物研究の分野において、我々は植物ウイルスと宿主の相互作用を研究しており、そのため、感染中に形成される様々なウイルスリポヌクレオタンパク質複合体に関心を持っています。これまで、我々はアフィニティータグを用いた精製法を用いて、これらの複合体の研究に成功してきました。その中で、Twin-Strepタグが最も優れたタグの一つであることが証明されました。しかしながら、本手法の使用において、収率が低いといったいくつかの制限が観察されたため、私たちはこの方法を改善したいと考えました。こんにちは、マタです。ここから実験プロトコルをご案内します。まず、本手法の概要について説明します。twin-strepタグ付きタンパク質とその生理的な結合パートナーとの間の特異的な複合体を精製するために、Strep-Tactin macro prepビーズを使用します。緑色に示されているのはStrepタグ付きのテトラマーであり、青色がtwin-strepタグ付きタンパク質、オレンジ色がその結合パートナー、そして赤色が2つのStrepタグを表しています。標準的な手法では、グレーで示されている未結合のタンパク質を洗浄によって除去します。結合した複合体は、ピンク色で示されているビオチンを用いて競合的に溶出させます。しかし、この手法を用いた際、結合した複合体の溶出が不完全であり、Strep-Tactinビーズから脱離できたのはごく一部であることが観察されました。これにより、標的タンパク質の回収率が低くなります。さらに解析を困難にする要因として、S-D-Sを用いた変性溶出を行うことで標的タンパク質の回収率を向上させることができます。変性したTwin-Strep-tagベイトタンパク質の周囲にミスセルが形成されます。その結合パートナーおよび解離したstrept actinモノマーの周囲に存在します。サンプルをさらに質量分析で解析する必要がある場合、放出されたstrept actinによるサンプルの汚染は許容できません。このサンプル汚染の問題を克服するため、我々はstrep tachinテトラマーを化学架橋によってあらかじめ安定化させる手法を開発しました。得られた架橋樹脂を用いて、ベイトタンパク質およびその結合パートナーを精製します。SDSによるサンプル溶出で高いタンパク質回収率を確保し、樹脂の化学的架橋により、放出されたstreptタグによるサンプルの混入なく、streptタグ付きベイトタンパク質とその結合パートナーを溶出させます。2 mgのBS3架橋剤を含む密閉したマイクロチューブを室温で平衡化させます。ピペットチップの先端を切り落とし、レジン転送用の準備をします。Strep-TactinおよびMacro-Prepレジンを短時間激しく振盪して再懸濁し、直ちに懸濁液600 µLをCoStar Spin-Xフィルターカラムに移し、4,000 RPMで30秒間遠心分離します。室温で450 µLのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。このステップの目的は、一次アミンを含むTrisを、非反応性のリン酸で置換することです。フロースルーを廃棄します。チューブを数回反転させて内容物を混合します。遠心分離と洗浄のステップを2回繰り返し、レジンを430 µLのPBS pH 8に残します。最後の遠心分離後、100 µLのMilli-Q水を含むピペットチップで、マイクロチューブのフォイルに穴を開けます。緩やかにピペッティングを行い、BS3パウダーを水に溶解させます。BS3が完全に溶解したら、直ちに溶液20 µLをSpin Xカラムに加えます。内容物が適切に混合されるようにしてください。コラムを室温で30分間回転させ、レジンがBS three溶液と十分に混合されるようにします。反応を停止させるため、塩酸でpH 7.5に調整した3 MのTrisを6 µL加えます。コラムを室温でさらに15分間回転させた後、4,000 RPMで30秒間遠心分離します。室温で、架橋樹脂を450 µLのTween 20含有トリス緩衝生理食塩水（TBS）に懸濁させ、流出液を捨てます。遠心分離と洗浄の手順をさらに2回繰り返します。最後のステップで、樹脂を450 µLのTBSに再懸濁させます。樹脂懸濁液を新しいチューブに移し、カラムに残った樹脂をさらに450 µLのTBSで再懸濁させ、同じチューブに移します。樹脂をカラムからチューブに最大限に回収するため、前述の工程をもう一度繰り返します。樹脂懸濁液が入ったチューブを室温で10分間静置し、液量を600 µLに調整します。余分なTBSを除去することで、樹脂はすぐに使用できる状態となり、また凍結させずに4 °Cで保存することも可能です。本手法は、あらゆるTwin-Strepタグ融合タンパク質およびその関連複合体の精製に適しています。タンパク質は動物、植物、または細菌由来であり、全細胞溶解物または濃縮された細胞小器官画分のいずれからでも単離可能です。本例では、ウイルス感染植物の核画分から、ジャガイモウイルスAのTwin-Strepタグタンパク質VPG Proを単離します。まず、結合バッファーに含まれる1 mLのベイトタンパク質サンプルを、4 °Cで13,000 RPMで10分間遠心分離することから開始します。内因性のビオチン化タンパク質がstrep tactおよびレジンに結合するのを最小限に抑えるため、上清を新しいチューブに移します。Avadonを最終濃度100 µg/mLになるように加え、内容物が十分に混合されるようにします。4 °Cで15分間回転混和させます。架橋樹脂をボルテックスで再懸濁し、カップピペットチップを用いて、樹脂懸濁液 50 µL をベイトタンパク質サンプルが入ったチューブにすぐに加えます。そのまま 4 °C でさらに 30 分間回転混合させます。サーモミキサーを 55 °C に設定し、溶出ステップで使用する Elu バッファー 500 µL を予め加熱しておきます。4 °C、2000 RPM で 1 分間遠心分離します。上清を廃棄し、あらかじめ冷却した洗浄バッファー1(wash buffer 1) 1 mLで樹脂を洗浄します。4 °Cで5分間回転させます。遠心分離と洗浄のステップを計3回繰り返します。樹脂を250 µLの洗浄バッファー2に再懸濁し、樹脂懸濁液を新しいSpinxカラムに移します。チューブに残っている樹脂をさらに250 µLの洗浄バッファー2で再懸濁し、同じカラムに移した後、4°C、2000 RPMで3分間遠心分離します。カラムを新しい2 mLのドルフィンノーズチューブに移し、ろ液を廃棄します。直ちに次の溶出ステップに進みます。あらかじめ加熱した溶出バッファー150 µLをspinxカラムに加えます。サーモミキサーを用いて55 °Cで5分間、1400 RPMで振盪しながらインキュベートします。室温で4,000 RPMで1分間遠心分離し、カラムを廃棄します。精製された標的タンパク質はこれでさらなる解析に使用でき、-20°C以下で保存可能です。画像から、ビオチンを用いたStreptactin Macro-Prepレジンからのタンパク質溶出は、SDSを用いた溶出に比べて不完全であることがわかります。ウェスタンブロットのシグナル強度の違いは、これら2つの溶出手法で得られたタンパク質収量の差を反映しています。SDSによる溶出はビオチンによる溶出よりもはるかに効率的ですが、放出されたStreptactinによってサンプルが汚染されることになります。画像は、StreptactinマクロプレップレジンからのSDS溶出物（EIT）の銀染色ゲルを示しており、左側のレーンには遊離したStreptactinが存在し、右側のレーンには存在しないことがわかります。左側のサンプルは非架橋レジンから溶出させたものであり、右側のサンプルはBS3で架橋したレジンから溶出させたものです。これらの結果に基づき、BS3による架橋が、SDS溶出時のレジンからのStreptactinの遊離を抑制すると結論付けられます。この例では、BS3で架橋されたStrept actin macro prep resinを用いて、ベイトタンパク質であるVPG PROとその結合パートナーを精製しました。精製サンプルの分注液を質量分析にかけ、タンパク質の同定を行いました。ネガティブコントロールにおいて特定のバンドが見られないことは、プルダウンの特異性を裏付けています。下のバンドはベイトタンパク質であるVPG PROに相当し、上のバンドは質量分析によって同定されたその結合パートナーであるNIB replicateに相当します。ここまで、化学架橋を用いることで、strep tact inレジンからの溶出および変性に伴う制限をどのように克服できるかについて説明しました。この手法は、タンパク質-タンパク質複合体の精製に加えて、ホルムアルデヒドで可逆的に架橋されたものを含む、核酸を含むタンパク質複合体の精製にも利用可能です。最後に、この方法はstrep tech膜タンパク質の精製に使用できます。界面活性剤を用いて可溶化します。これらの疎水性タンパク質を溶液中に保持するためには、界面活性剤が必要です。しかしながら、それらの存在によって、strep-taneの放出に伴うサンプルのコンタミネーションが生じる可能性があります。穏やかなビオチン溶出を用いる場合であっても、レジンの架橋によってサンプルコンタミネーションの問題を解決できると考えています。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功を願っております。

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