高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

この手順の全体的な目標は、未修飾および高リン酸化タウタンパク質種の凝集動態をモニタリングおよび比較することです。これは、まずzippers支援触媒システムによって未修飾および高リン酸化タウタンパク質を生成することによって達成されます。2番目のステップは、2つの異なる機器のいずれかに適したアグリゲーションアッセイを設定することです。

タウ凝集プロセスは、2つの異なるチオの蛍光によって監視されます。フラビンは死に、フラビン S とフラビン T. 最後のステップは、凝集曲線をプロットして比較することです。最終的に、結合から凝集したTA種へのチオフラビン蛍光の動力学的変化を使用して、in vitroでのタウ細動の高リン酸化依存性増強を示します。

こんにちは、JOVの記事へようこそ。ハイパーリン酸化タウタンパク質を用いたin vitroアグリゲーションアッセイ。私の名前はミンコで、実験は途中で行われ、デモンストレーションが行われます。

そして、このプロトコルでは、先月中に行われた適度に新しい集約バッファです。使用直前に、DIOを1ミリモルに3エトール加えるには、Aフィルター付きテオフラビン茶またはSストック溶液も必要でした。Heinストック溶液は、マイナス20°Cで保存でき、タオルタンパク質はマイナス80°

タオルを氷の上で引っ張り、一貫性を保つために必要に応じて凝集バッファーを使用してその濃度を調整します。凝集バッファーと20, 800 Gでタオルを4°Cの10分間回転させます。次に、仰臥位を別のチューブに移し、凝集反応を組み立てる時が来るまで氷上に保ちます。

凝集混合物を1.5ミリリットルのマイクロセントリチューブにセットします。表によると、1アリコートの反応物には100マイクロリットルで十分です。反応数に基づいて総量を計算し、ピペッティングエラーを考慮して10%増やします。

コショウは、必要に応じてラオン酸または凝集バッファーに置き換えることができます。反転によって反応を混合し、植生なしで摂氏37度に移します。24時間ごとに、反応液に1ミリモルのDTTを補充し、蛍光を測定するための還元環境を確保します。

スペクトル蛍光計を約10分間ウォームアップします。これにより、コンピュータソフトウェアでの測定の一貫性が向上します。計測器コントロールセンターにあるリアルタイム表示モードを選択します。

励起波長はスリットを2ナノメートルにして450ナノメートル、発光波長はスリットを5ナノメートルにして510ナノメートルに設定します。次に、装置コントロールセンターに戻り、一定波長分析を選択します。上部フレームの add キーを押して、一連の波長を追加します。

標準誤差の獲得パラメータを 1 に、最大試行回数を 3 に設定します。次に、[追加]をクリックします。次に、[移動]をクリックしてデータ表示ウィンドウを開きます。

次に、データ表示ウィンドウで、[開始アクト]をクリックして新しいサンプルダイアログボックスを開き、サンプルタイプに[不明]を選択します。次に、98で100マイクロリットルごとに測定を行うように反応を準備します。凝集緩衝液のマイクロリットル、および3ミリモルのtheofフラビンSまたはTの2マイクロリットルは、良好な混合を確保するために混合物を数回ピペットでピペットします。

1つの混合物の200マイクロリットルすべてをFA 3 qveに移し、所定の位置にロードします。次に、舐めてランして蛍光データを収集します 獣医から溶液を取り除いた後、蒸留水で3回すすぎ、気流で乾燥させます。このアッセイには、イオン反応中の蛍光色素が含まれているため、連続測定が可能であり、自動マットウェルプレートリーダーで行うのに適しています。

通常のforパラメータも、手動操作の速度によって制限されます。凝集混合物を96ウェルの不透明な黒板にセットします。360マイクロリットルの井戸容量では、各タイムポイント測定に200マイクロリットルで十分です。

ピペッティングで各反応をよく混合します。96ウェルプレートを摂氏37度でインキュベートし、24時間ごとにDTTの補助1ミリモルを追加し、各時点で還元環境を確保します。測定を行うには、少なくとも10分前にコンピューターソフトウェアでマルチモードマイクロプレートリーダーとコンピューターの電源を入れてください。

温度を摂氏37度に設定し、蛍光強度モードを選択します。次に、励起波長を450ナノメートルに、発光波長を5ナノメートルと10ナノメートルに設定します。96ウェルプレートをドローに挿入し、読み取りキーを押します。

測定を行った後、データを分析する前にすぐにプレートをインキュベーターに戻してください、このアッセイ用のコンパクトな分光光度計を使用して連続モードアッセイを実行できます。凝集混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにセットします。200マイクロリットルの反応は、時点を測定するのに十分です。

チューブを反転させて混ぜます。反応を摂氏37度または室温で設定し、24時間ごとに1ミリモルのDTTを追加して測定します。ノーダイターミナルアッセイの場合と同様に、ウロメーターとソフトウェアをセットアップします。

混合物全体を獣医に移し、サンプルコンパートメントのサンプルホルダーに配置し、蓋を閉めます。「run」をクリックして、適切な時間間隔で蛍光データを収集します。この間隔が30秒や60秒など短い場合は、最後の時点に達するまで、測定の合間にQ獣医を機械に置いたままにしても問題ありません。

反応を獣医からそのサンプルチューブに戻し、完了したらチューブをインキュベーターに戻します。組換えタウとP talを使用して、前に指示されたように獣医を傾けます。蛍光色素の有無にかかわらず、タウおよびp talを含むアミロイドタンパク質凝集体に結合する際のフラビンtおよびsの強い蛍光発光を利用して、タウおよびp talの凝集の動態を比較するために2つの異なるプロトコルが確立されました。

凝集反応では、高リン酸化によるタウ凝集の増強が一貫して見られました。通常、Tとp tal ligaは、フラビンを含む有意なスローダウンが発生する前に、最初の30分以内に急速に上昇します。凝集反応中のTは、凝集速度の大幅な遅延を引き起こします。

テオフ・フラウィウスのsとtは、160分間反応した後、高原に接近した。一方、バイオフラビンsは、凝集の顕著な減速を引き起こさなかった。この手順に続いて、神経変性におけるアイソフォームまたは他の凝集傾向タンパク質への追加の中枢神経系、ライキンをアッセイを用いて行うことができ、その開発後の病因におけるタンパク質化の寄与を理解する

この技術は、現場での研究のために高リン酸トップタンパク質PAの方法を準備し、私たちの治療法と医薬品開発を探求するための多数の病気です。