Name: 高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ 高リン酸化タウタンパク質のインビトロ凝集アッセイ手法。チオフラビン蛍光を用いて凝集動態を測定し、アルツハイマー病の分子メカニズム解明と治療薬スクリーニングの基盤を築きます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、国立老化研究所(AG039768)からMHKへの支援を受けました。 楽器を提供してくださったトーマス・シャーキー博士とホンガオ・ヤン博士、技術支援を提供してくださったショーン・ワイズ博士とヤン・ウー博士に感謝します。

試薬の調製<ol><li>集計バッファを準備し（20mMトリス、pH7.4中、100mMのNaCl、1mMのEDTA）。ヶ月間、室温で安定して保管してください。サプリメント1mMのは、使用前に（DTT）をジチオスレイトール。 NOTE：HEPESベースの緩衝液（10mM HEPES、pH7.5で、0.1mMのEDTA、5mMのDTT）もまた、タウ凝集に類似の結果を生成する。 </li><li> 0.22μmの無菌フィルターユニットによりチオフラビンTまたはチオフラビンS原液（凝集緩衝液に溶解3mMの、）、およびフィルタを準備します。ヶ月間、アルミホイルで安定したカバーチューブで-20℃で保存。 </li><li> （300μM、集計緩衝液に溶解）をヘパリン原液を準備します。 -20°Cで保存し、ヶ月間安定。 </li><li> （水に溶解し、1M、）ジチオスレイトール（DTT）の株式を準備します。 1.5ミリリットルチューブに小分けし。 -20℃で保管してください。凝集アッセイの前に、室温で1 M溶液を解凍する。この1,000倍在庫から、脱イオン水で100 mMの作業ストックの一定分量を準備。氷の上のままに直前まで。 </li><li> ℃の冷凍庫-80℃からタウを削除します。氷上で解凍します。集約緩衝液で所定濃度にタウを調整します。予め形成された大きな凝集体を除去し、4℃で10分間20800×gでマイクロ遠心スピン。このプレ紡糸工程は、タンパク質調製物の各バッチの後続の蛍光測定の一貫性を増大させる。別のチューブに上清を移し、凝集反応を組み立てるために準備ができるまで氷上に残す。 </li></ol> 2.無色素、ターミナルアッセイ注：このアッセイの凝集反応は、蛍光色素の不存在下で行われる。すべての成分を混合した後、反応物を所定の時間点まで進行させる。アリコートを凝集反応から取り出しのThTまたは蛍光読み取りの前に結合アミロイドTHSと混合される。凝集反応の初期体積は、必要とされる時点の数に依存する。このアプローチは、のrequありタウタンパク質を大量にIREが簡単で高速であり、蛍光光度計またはマルチウェルプレートリーダー（説明を参照）で行うことができる。以下は、蛍光定量化のためのISA SPEX FluoroMax-2コンパクトな分光蛍光光度計を使用して、ステップバイステップの操作です。 <ol><li> 表1のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、100μlの反応に必要な成分を表す。特定の実験のために必要な時点に基づいて、全体の集計ミックス量を調整します。ピペット操作エラーの余地を与えるために、各コンポーネントの追加の10パーセントを追加します。ここに示されている典型的な反応を含むヘパリンはアラキドン酸または集約バッファで置き換えることができる。反応混合物を1 mMのDTTを加える。全反応が1日以上続いた場合、還元環境を確保するために新鮮なDTT、毎日（1 mm）を補う。 </li><li>混合するチューブを数回転倒。プラ37℃のインキュベーターや水浴中CEの各反応。攪拌はタウ凝集のために必要とされていません。 </li><li>蛍光を測定する前に、（コンピュータその後、第1ランプ）分光蛍光をオンにします。 注：すぐに使用することができ、キセノンアークランプ。しかし、最良の結果を得るためにマシンが蛍光を読む前に約10分間のウォームアップすることができます。 </li><li>コンピュータ上のソフトウェアを起動します。 <ol><li> 510 nmの（5 nmのスリット）に計測器制御センターの実時間表示モード 、（2 nmのスリット）450nmの設定励起波長と発光波長を選択してください。閉じるリアルタイム表示モードウィンドウは計測器制御センターに戻ります。 </li><li> 一定の波長の分析を選択して、Enterキーを押して波長セットを追加するには、上部フレームで&gt;&gt;キーを追加します。 1〜3と最大トライアルへの標準誤差の集合取得パラメータ、[ 追加]をクリックします。 データ表示を開くために！GOをクリックします。窓。 </li><li> データ表示 ] ウィンドウで、 新しいサンプル]ダイアログボックスを開くには[スタート] ACQをクリックします。 サンプルタイプのために「不明」を選択します。 </li></ol></li><li>すべての100μlの集約混合物に、98μlの集計バッファとT.ピペットを数回混合する3 mMのチオフラビン2μlを添加する。 </li><li>キュベット（FCA3、外装寸法は、wxlxh = 12.5ミリメートルX 12.5ミリメートルX 45ミリメートル）の混合物全体を転送します。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。 </li><li>キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。 </li></ol>と色素3.をSpectraMax M2プレートリーダーで継続モードアッセイ注：このアッセイは、蛍光色素のThTまたはTHSがaggregaに含まれているという点で、以前のものとは異なるション反応。これは、反応の同じセットの連続測定を可能にする。なぜなら反応の反復使用のために、この方法は、より良好な自動マルチウェルプレートリーダー（スペクトラマックスM2の動作を次のように）で行われる。定期的な蛍光光度計も動作しますが、高速の集約反応の測定の頻度が原因の動作の説明書性質のため、多少制限されている。 <ol><li> 表2のように96ウェルプレート中で凝集ミックスを設定する（96ウェル黒色固体プレート、ウェル容量360μlを、平底）の各列は、一のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す時間点測定。数回ピペッティングしてよく混ぜる。実験の過程を通して、毎日新鮮な1mMのDTTを補足する。 </li><li> 37℃で96ウェルプレートをインキュベートする。 </li><li>蛍光測定の前に、各時点で、マルチモードマイクロプレートリーダー及びコンピュータの電源を入れる。 MAのための十分な時間を許可する背骨は、約10分間安定させる。 </li><li>コンピュータ上のソフトウェアを起動します。 37℃に温度を設定し、蛍光強度（FI-トップリード）モード、510 nmで450 nmおよび放出波長に設定励起波長を選択します。 </li><li>引き出しに96ウェルプレートを挿入し、測定を開始するために、READキーを押します。 </li><li>お読みになった後、プレートを取り外して、37℃のインキュベーターに戻し、それを返す。データ分析とプロットするためのExcelスプレッドシートにデータをコピーして貼り付け。 </li></ol> 4と染料、継続モードアッセイコンパクト分光蛍光光度計で<ol><li> 表3のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す。 </li><li>混合するチューブを数回転倒。 </li><li>分光蛍光光度計の電源を入れ、手順2.3と2.4のようにソフトウェアを設定する。 </li><li>混合物全体tを転送OAキュベット。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。 </li><li> 実行]をクリックし、データを記録することにより、適切な間隔で読み続ける。凝集は、高周波数（ 例えば 、毎30または60秒）で監視する場合には、いずれかの測定が終了するまで機械キュベットおよび反応のまま、または反応またはキュベットを交換するのに十分な時間がある場合。 </li><li>キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。 </li></ol>

開示するものは何もありません。

このプロトコルは、リン酸化依存速いタウ凝集速度論を検出する別のアッセイ条件と楽器を示しています。端末アッセイでは、蛍光色素ThTを、各時点でのマスターミックスから除去された反応の一部に加えられる。アミロイド結合誘起蛍光次に26で測定される。第有する染料モードでは、タウ凝集は、タウ凝集体の成長のリアルタイム自動評価に適したこの種の反応をレンダリングのThTまたはTHSの存在下で行われる。これらの各メソッドには、長所と短所を持っています。 ターミナルモードの反応がタウ凝集のために必要な唯一のこれらの成分を用いて行われる。希釈し、チオフラビンTとの反応を混合して大幅に本質的に蛍光定量反応を停止させ、蛍光の増加速度を遅くする。従って、この方法は、また手動操作と互換性があります。しかし、反作用理由nは事実上のThT添加により終了し、タウ多量の凝集曲線をプロットするために必要とされ得る。この方法のための別の潜在的な注意点は、反応混合物への頻繁なアクセスは、微生物またはタンパク質分解汚染、またはタンパク質の酸化を導入することができるということである。対照的に、と染料モードの...

アルツハイマー病（AD）は、タウオパチーとして知られる神経変性疾患の大規模なコレクションの一つである。典型的な病理学の基礎となるタウオパチーは、ニューロン、アストロサイトとミクログリア1-4で神経原線維変化、NFTの、です。 NFT密度は、認知機能障害3,5及びニューロン損失6と相関する。 NFTはまっすぐまたは対らせんフィラメント（PHF）7,8を形成（以下、「P-タウ」とも呼ばれる）は、主に過剰リン酸化タウタンパク質が含まれています。タウは、ニューロンのシグナル伝達および輸送9,10に必須である軸索輸送を促進すると考えられ、微小管関連タンパク質である。各タウ分子は、正常な脳で2〜3リン酸を含むが、タウオパチー患者11内の複数の折り目によってホスホリル含有量が増加する。複数のキナーゼは、GSK3β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β）及びCDK5（サイクリン·ドなどのタウの過剰リン酸化に貢献する可能性があるペンダントキナーゼ5）12,13が、病理学的リン酸化のための直接の引き金は、とらえどころのない14のまま。微小管結合モチーフまたは周辺の異常なリン酸化は、微小管15からタウを解離し、p-タウは、最終的にNFT介在物に重合させることができる直鎖または対らせんフィラメントにオリゴマー化する細胞体コンパートメントにタウ誤局在を引き起こす。タウの過剰リン酸化、NFT形成、及び神経変性の間の緊密な提携は、p-タウのもつれがアポトーシスおよび他の細胞毒性反応を誘発するため、タウオパチーの神経変性16,17のための根本的な原因であることが流行しているという仮説につながった。この前提に基づく薬物スクリーニングと初期の臨床試験は、18を立ち上げてきた。しかし、この仮説は19,20挑戦に直面している。例えば、サンタクルスらは、トランスジェニックマウスの認知機能は、変異体の発現を抑制することにより改善することができることを示したのNFTは、既存のタウ分子21から形成するために続けていても、人間のタウ、。 ショウジョウバエモデルでは、NFTは、基礎となる神経細胞22,23を保護するために有毒な細胞質ゾルタウを隔離することが示された。明らかに、NFTの病因の役割は、もしあれば、大いにタウオパチー治療薬の開発の方向性に影響を与えます。 いくつかのβシート好ましい蛍光色素、電子顕微鏡法、光散乱分光法24-27の結合によって示されるように、高濃度では、組換えまたは正常な脳のタウタンパク質は自然に、ゆっくり、 インビトロでの PHF様構造へと重合する。追加ヘパリンまたはアラキドン酸、人間の脳に豊富脂肪酸は、大幅にタウisoform-と誘導物質の濃度依存マナー28-32でPHFの形成を促進する。興味深いことに、過リン酸化タウは、AD脳から精製またはインビトロリン酸化反応A に網羅して調製より速くggregatesと、より効率的に26,33-35。これらの結果は、p-タウの病理学的役割とよく一致している。 p-タウの凝集に基づくインビトロシステムは、このようにADの薬物スクリーニングのための強力なツールとして機能することができる。 タウ凝集およびADの進行神経変性、ならびにAβ斑をターゲットに医薬品開発の最近の失敗、AD 36-38のもう一つの重要な組織学的マーカーの間に密接な関連性を考えると、タウ凝集を制御する薬を発見するの関心が高まっている。実際、いくつかのグループがすでに一次アッセイとして体外タウ凝集反応に使用して、異なるスループットで薬物スクリーニングを開始しました。多くの化学物質は、 インビトロ 39-42 でタウ凝集阻害または逆転活性を示すことが見出された。しかし、現在のすべてのタウ凝集レギュレータスクリーンは蛍光体の主要な病理学的なマークをミス修正されていないタウを使用ylation、ADの治療におけるこれらの化合物を使用しての特異性および有効性の懸念を高める。 生化学的特性およびADの薬物スクリーニングのための凝集アッセイの開発の大きな障害の一つは、病態生理学的に関連した高リン酸化タウタンパク質の十分な量の産生である。タウの1N4RアイソフォームとGSK-3βキナーゼはEに共発現されているジッパーアシスト触媒反応システムを用いて、 大腸菌は、ロイシンジッパー融合タンパク質として、私たちは、この課題を克服している（。隋ら 、提出され、タウとp-タウの最終製品については、図1を参照してください。また、p-タウの予備質量分析の特性評価のための43を参照）。タウの異なるリン酸化部位に特異的な9抗体のパネルから、陽性シグナルは、8つの位置で見られた（データは示さず）。以下では、集約運動Dを区別できるプロトコルおよびインストルメンテーションを記述する変更されていないタウとpタウ種間ifferences。これらのアッセイは、26アミロイド結合の際に、チオフラビンT（THT）またはチオフラビンS（THS）の蛍光の増加（タウ凝集体）を測定した公開されたプロトコルから変更された。最初の「端末」は、無色素のアプローチは、凝集反応が組み立てられ、アミロイド色素の非存在下でインキュベートした。異なる時点で、各反応のアリコートを除去し、タウ凝集体を結合するためのThTの凝集を停止し、可能にするためのThT含有緩衝液の等量。蛍光は、IAP FluoroMax-2蛍光光度計で測定される。第二」の色素「継続的なモニタリングアッセイでは、ThTのまたはTHSは凝集反応に含まれる。蛍光は、手動で、実験全体を通じて連続的に測定またはマルチプレートリーダーを使用することができる。加えて、我々は継続的な測定MOにおける集計のためのタウおよびp-タウの近生理的濃度を使用するアッセイを説明デ。リン酸化の効果は容易に検出可能のままである。以下では、ステップバイステップの操作手順を説明し、これらのアッセイの代表的な結果が表示されます。各アプローチの長所と短所のいくつかの議論だけでなく、潜在的な薬剤スクリーニングアプリケーションが続きます。 高濃度では、タウは自然にアミロイド様構造へと集約されます。しかし、実験室で、タウ線維化は、典型的には、ヘパリン（平均分子量6,000グラム/モル）及びアラキドン酸のような誘導因子によって促進される。ここに示した例には、30μMのヘパリンが含まれています。タウアミロイド凝集体の形成を、チオフラビンT（ThTの）またはチオフラビンS（THS）のアミロイド結合性から生じる蛍光によりモニターされる。 （;：485 nmの発光ピークを450nm励起）タウ凝集体に結合すると、ThTの蛍光の赤いシフトを示す。 THSは、一方では、アミロイドは結合の前に510ナノメートル（450nmで励起）で弱い発光を有するが、このfluorescenc電子は、このような凝集したタウ44とアミロイドタンパク質の存在下で有意に増加する。両方の色素は、タウおよびp-タウ凝集を検出するのに適しています。ためのThTの強力かつ比較的広い発光ピーク（ 図2参照）から、510 nmでの蛍光単位でわずか30％の減少がある。いずれかの染料を使用する際の便宜のために、我々は、タウ凝集をモニターするために、励起/発光波長（ すなわち 、450nmの/ 510 nm）の同じ組み合わせを使用する。 タウ凝集は、アッセイの目的とタウタンパク質の可用性に応じて、染料の存在下または非存在下で行うことができる。反応の両方のモードを以下に示します。単一のサンプル蛍光光度計（ISA-SPEX FluoroMax-2）と、マルチプレートリーダー（スペクトラマックスM2） - 加えて、我々は2つ​​の異なる機器の動作を実証する。読者は彼らの特定のニーズや機器の可用性に合わせて、これらのプロトコルを適応させることができるはずです。

<table><tbody><tr><td>トリズマ&nbsp;base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MAL-7581-06</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>チオフラビン T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td>暗所に保管</td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892</td><td>暗黒</td></tr><tr><td>ヘパリン</td>に保管 <td>Σ</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>ISA SPEX FluoroMax-2</td><td>Horiba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス抗タウモノクローナル抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB3494</td><td>&ndash に格納されています。80度;ハ</td></tr></tbody></table>

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

アルツハイマー病は、神経原線維変化(NFT)の形で過剰リン酸化タウタンパク質のニューロン沈着物によって現れるタウオパチーとして知られる神経変性疾患の大きなグループの一つです。 NFTの密度は、認知障害やその他の神経変性疾患の症状とよく相関しているため、タウ凝集ベースの治療法の開発が進められています。 しかし、これまでのところ、タウ凝集アッセイでは、病理学関連のリン酸化マークがない組換えタウまたは合成タウを使用しています。 ここでは、組換えの高リン酸化タウを被験者とする2つのアッセイについて説明します。 これらのアッセイは、高リン酸化タウ凝集体の動態または安定性を調節できる化合物のハイスループットスクリーニング用にスケールアップできます。 アルツハイマー病やその他のタウオパチーの新規治療法は、高リン酸化タウアイソフォームを使用して発見できる可能性があります。

組換えtauおよびp-タウ（ 図1）を使用して、我々は、タウを含む、タンパク質凝集体をアミロイドへの結合の際のThTとTHSの強い蛍光発光を利用して、タウの凝集およびp-タウの動態を比較するために2つの異なるプロトコルを設立及びp-タウ（ 図2）。凝集反応における蛍光色素の有無にかかわらず、我々は過剰リン酸化（ 図3-5）でタウ凝集の一貫した強化を観察した。この刺激は、ヘパリンとは無関係である（データは示さず）。 （ 図3、図5）、p-タウは、実験の過程を通して、より高い蛍光単位を示すと大幅に減速する前に、最初の30分以内に速い速度での典型的な反応、タウおよびp-タウオリゴマー化で。凝集反応でのThTを含めると凝集速度（ 図4）の有意な位相差を生じさせる。両方のアイソフォームに近づいPLAT反応が開始した後に160時間をEAU。 THSは、他の一方で、アグリゲーション（ 図5）のかなりの減速を引き起こすことはありません。 <p ...

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

本手順の全体的な目的は、未修飾および過剰リン酸化されたtauタンパク質種の凝集速度論をモニターし、比較することです。まず、ジッパー支援触媒システムを用いて未修飾および過剰リン酸化tauタンパク質を生成します。次に、2種類の異なる装置のいずれかに適した凝集アッセイをセットアップします。tau凝集プロセスは、2種類の異なるチオフラビン染料であるチオフラビンSおよびチオフラビンTの蛍光によってモニタリングします。最終ステップは、凝集曲線をプロットして比較することです。最終的に、凝集したTA種への結合に伴うチオフラビン蛍光の速度論的変化を用いて、in vitroにおけるtau線維化の過リン酸化依存的な促進を示します。こんにちは。JoVEの論文へようこそ。本動画では、過リン酸化タウタンパク質を用いたin vitro凝集アッセイについて解説します。私はMinkoです。実験の実施とデモンストレーションはwayが行います。本プロトコルでは、過去1ヶ月以内に調製した十分に新鮮な凝集バッファーが必要です。使用直前に、1 mMのDIO three etolを添加してください。また、ろ過済みのThioflavin Tのストック溶液も必要です。ストック溶液はともに-20°Cで保存可能であり、タンパク質は-80°Cで保存してください。氷上でタオルを回収し、一貫性を保つために凝集バッファーを用いて必要に応じて濃度を調整します。凝集バッファーを加え、4°C、20,800 Gで10分間遠心分離します。その後、上清を別のチューブに移し、凝集反応を開始するまで氷上で保持します。1.5 mLのマイクロ遠心チューブに凝集混合液を調製します。表に基づき、反応液1アリコートあたり100 µLが必要です。反応数に基づいて総量を算出し、ピペッティング誤差を考慮して10%増量してください。必要に応じて、Pepper inをラオニック酸または凝集バッファーに置き換えることができます。反応液を転倒混和し、振盪せずに37 °Cでインキュベートします。24時間ごとに1 mMのDTTを補充し、蛍光測定のための還元環境を維持してください。スペクトラ・フルオリメーターを約10分間ウォームアップしてください。これにより、コンピュータソフトウェアにおける測定の整合性が向上します。機器コントロールセンターにあるリアルタイム表示モードを選択してください。励起波長を450 nanometersに、スリット幅を2 nanometersに設定し、蛍光波長を510 nanometersに、スリット幅を5 nanometersに設定します。次に、装置コントロールセンターに戻り、定波長解析（constant wavelength analysis）を選択します。上部フレームの追加キーを押して、波長セットを追加します。標準誤差の取得パラメータを1に、最大試行回数を3に設定します。次に、「add」をクリックします。続いて、「go」をクリックしてデータ表示ウィンドウを開きます。次に、データ表示ウィンドウで「start act」をクリックして新しいサンプルのダイアログボックスを開き、サンプルタイプに「unknown」を選択します。その後、測定用の反応液を調製します。凝集バッファー 98 µL に対し、3 mM の flavin S または T を 2 µL 加え、合計 100 µL とします。混合液を数回ピペッティングし、十分に混合させます。1つの混合液200 µLすべてをFA 3 cuvetteに分注し、所定の位置にセットします。次に、Runをクリックして蛍光データを収集します。cuvetteから溶液を取り出した後、蒸留水で3回洗浄し、エアストリームで乾燥させます。このアッセイでは、イオン反応に蛍光色素が含まれているため連続測定が可能であり、自動マルチウェルプレートリーダーを用いて行うことが推奨されます。パラメータの定期的な調整も有効ですが、手動操作の速度による制限があります。96ウェル不透明黒色プレートに凝集ミックスを調製します。1ウェルあたりの容量が360 µLであるため、各タイムポイントの測定には200 µLで十分です。ピペッティングにより、各反応液を十分に混合します。96ウェルプレートを37 °Cでインキュベートし、各タイムポイントで還元状態を維持するため、24時間ごとに1 mMのDTTを追加します。測定を行う際は、コンピューターソフトを操作し、マルチモードマイクロプレートリーダーとコンピューターを少なくとも10分前に起動させておきます。温度を37 °Cに設定し、蛍光強度モードを選択します。次に、励起波長を450 nm、蛍光波長を510 nmに設定します。96ウェルプレートをドロワーに挿入し、リードキーを押します。測定後、データを分析する前にすぐにプレートをインキュベーターに戻してください。本アッセイでは、小型分光光度計を用いて連続モードでのアッセイを行うことができます。凝集混合物を1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに調製します。1つのタイムポイントを測定するには、200 microliterの反応液で十分です。チューブを転倒混和します。反応系を37 °Cまたは室温で設定し、測定を行う際は24時間ごとに1 mMのDTTを補充してください。尿量計とソフトウェアを、no die terminal assayと同様にセットアップします。混合液全体をキュベットに移し、サンプルコンパートメント内のサンプルホルダーに設置して蓋を閉じます。[Run]をクリックし、適切な時間間隔で蛍光データを収集します。この間隔が30秒または60秒のように短い場合は、最終タイムポイントに達するまでQキュベットを装置内に設置したままでも問題ありません。反応液をキュベットからサンプルチューブに戻し、完了後、チューブをインキュベーターに戻します。リコンビナントtauおよびp talを用いて、前述の指示通りにキュベットを洗浄してください。蛍光染料の有無にかかわらず、tauやp talを含むアミロイドタンパク質凝集体に結合した際のフラビンTおよびSの強い蛍光放出を利用して、tauとp talの凝集速度論を比較するために、2つの異なるプロトコルが確立されました。凝集反応において、過剰リン酸化によるtau凝集の一貫した促進が認められました。通常、Tおよびp tauレベルは最初の30分以内に急速に上昇し、その後、フラビンの影響を含め、顕著な速度低下が起こります。凝集反応におけるTは、凝集速度を著しく遅延させます。Theof Flavian sとtは、いずれも160分間の反応後にプラトーに達しました。一方で、Bio flavin sは凝集の顕著な鈍化を引き起こしませんでした。本手順に従い、本アッセイを用いて、中枢神経系の他のアイソフォームや、神経変性疾患におけるinのような他の凝集しやすいタンパク質に対しても、開発後の病態形成におけるタンパク質化の寄与を理解するための解析を行うことが可能です。このハイパーリン酸タンパク質PA調製法は、治療法や創薬の開発に向けた、当該分野における数多くの疾患の研究に活用されます。

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、生物学的サンプルから単離されたタンパク質凝集体の播種活性を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)フローサイトメトリーアッセイを示しています。タウレポータータンパク質を発現する哺乳類細胞を、タウシードを含むリポソーム形質導入複合体とインキュベートします。これらのシードはレポータータンパク質の凝集を媒介し、フローサイトメーターでFRET陽性シグナルを生成します。...

タウシード誘導レポータータンパク質凝集を検出するためのFRETフローサイトメトリー技術

このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。...

ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

このビデオは、アミロイドβ(Aβ)凝集体によるニューロン成長円錐の崩壊のin...

神経成長円錐崩壊に対する凝集アミロイドβのin vitro評価

このビデオでは、黄色蛍光タンパク質(YFP)でタグ付けされた変異型ヒトタウタンパク質をコードするレンチウイルスをヒト神経細胞に形質導入し、タンパク質凝集を研究するプロセスを示しています。ウイルスの侵入から変異型タウの発現までのステップを概説し、ニューロンに目に見える細胞質タウ凝集体が形成されるまでのステップを概説しています。...

タウタンパク質凝集解析のためのヒトニューロンのレンチウイルス媒介形質導入

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

ひと死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の強化のため、省略された分別のプロトコルを説明します。...

人間の死後脳から洗剤不溶性タンパク質凝集体の濃縮

本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ...

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

本稿で説明したタウ凝集アッセイは、生体内でタウの折りたたみと集計の予想される機能を模倣します。...

体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。...

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

このプロトコルは、ヒトの神経細胞培養が変異型ヒトタウのためのコーディングをコードするレンチを用いて形質導入される手順を詳述する。形質導入培養物は、タウ凝集体および関連する病理を表示する。...

ヒトニューロンのレンチウイルス媒介性形質導入を用いたタウ凝集を研究するための in Vitro モデル

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。...

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

学ぶ 高リン酸化タウタンパク質のインビトロ凝集アッセイ手法。チオフラビン蛍光を用いて凝集動態を測定し、アルツハイマー病の分子メカニズム解明と治療薬スクリーニングの基盤を築きます。

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

さらに動画を探す