高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて
2015年1月2日
非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。
この手順の全体的な目標は、未修飾および高リン酸化タウタンパク質種の凝集動態をモニタリングおよび比較することです。これは、まずzippers支援触媒システムによって未修飾および高リン酸化タウタンパク質を生成することによって達成されます。2番目のステップは、2つの異なる機器のいずれかに適したアグリゲーションアッセイを設定することです。
タウ凝集プロセスは、2つの異なるチオの蛍光によって監視されます。フラビンは死に、フラビン S とフラビン T. 最後のステップは、凝集曲線をプロットして比較することです。最終的に、結合から凝集したTA種へのチオフラビン蛍光の動力学的変化を使用して、in vitroでのタウ細動の高リン酸化依存性増強を示します。
こんにちは、JOVの記事へようこそ。ハイパーリン酸化タウタンパク質を用いたin vitroアグリゲーションアッセイ。私の名前はミンコで、実験は途中で行われ、デモンストレーションが行われます。
そして、このプロトコルでは、先月中に行われた適度に新しい集約バッファです。使用直前に、DIOを1ミリモルに3エトール加えるには、Aフィルター付きテオフラビン茶またはSストック溶液も必要でした。Heinストック溶液は、マイナス20°Cで保存でき、タオルタンパク質はマイナス80°
Cで保存可能です。タオルを氷の上で引っ張り、一貫性を保つために必要に応じて凝集バッファーを使用してその濃度を調整します。凝集バッファーと20, 800 Gでタオルを4°Cの10分間回転させます。次に、仰臥位を別のチューブに移し、凝集反応を組み立てる時が来るまで氷上に保ちます。
凝集混合物を1.5ミリリットルのマイクロセントリチューブにセットします。表によると、1アリコートの反応物には100マイクロリットルで十分です。反応数に基づいて総量を計算し、ピペッティングエラーを考慮して10%増やします。
コショウは、必要に応じてラオン酸または凝集バッファーに置き換えることができます。反転によって反応を混合し、植生なしで摂氏37度に移します。24時間ごとに、反応液に1ミリモルのDTTを補充し、蛍光を測定するための還元環境を確保します。
スペクトル蛍光計を約10分間ウォームアップします。これにより、コンピュータソフトウェアでの測定の一貫性が向上します。計測器コントロールセンターにあるリアルタイム表示モードを選択します。
励起波長はスリットを2ナノメートルにして450ナノメートル、発光波長はスリットを5ナノメートルにして510ナノメートルに設定します。次に、装置コントロールセンターに戻り、一定波長分析を選択します。上部フレームの add キーを押して、一連の波長を追加します。
標準誤差の獲得パラメータを 1 に、最大試行回数を 3 に設定します。次に、[追加]をクリックします。次に、[移動]をクリックしてデータ表示ウィンドウを開きます。
次に、データ表示ウィンドウで、[開始アクト]をクリックして新しいサンプルダイアログボックスを開き、サンプルタイプに[不明]を選択します。次に、98で100マイクロリットルごとに測定を行うように反応を準備します。凝集緩衝液のマイクロリットル、および3ミリモルのtheofフラビンSまたはTの2マイクロリットルは、良好な混合を確保するために混合物を数回ピペットでピペットします。
1つの混合物の200マイクロリットルすべてをFA 3 qveに移し、所定の位置にロードします。次に、舐めてランして蛍光データを収集します 獣医から溶液を取り除いた後、蒸留水で3回すすぎ、気流で乾燥させます。このアッセイには、イオン反応中の蛍光色素が含まれているため、連続測定が可能であり、自動マットウェルプレートリーダーで行うのに適しています。
通常のforパラメータも、手動操作の速度によって制限されます。凝集混合物を96ウェルの不透明な黒板にセットします。360マイクロリットルの井戸容量では、各タイムポイント測定に200マイクロリットルで十分です。
ピペッティングで各反応をよく混合します。96ウェルプレートを摂氏37度でインキュベートし、24時間ごとにDTTの補助1ミリモルを追加し、各時点で還元環境を確保します。測定を行うには、少なくとも10分前にコンピューターソフトウェアでマルチモードマイクロプレートリーダーとコンピューターの電源を入れてください。
温度を摂氏37度に設定し、蛍光強度モードを選択します。次に、励起波長を450ナノメートルに、発光波長を5ナノメートルと10ナノメートルに設定します。96ウェルプレートをドローに挿入し、読み取りキーを押します。
測定を行った後、データを分析する前にすぐにプレートをインキュベーターに戻してください、このアッセイ用のコンパクトな分光光度計を使用して連続モードアッセイを実行できます。凝集混合物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにセットします。200マイクロリットルの反応は、時点を測定するのに十分です。
チューブを反転させて混ぜます。反応を摂氏37度または室温で設定し、24時間ごとに1ミリモルのDTTを追加して測定します。ノーダイターミナルアッセイの場合と同様に、ウロメーターとソフトウェアをセットアップします。
混合物全体を獣医に移し、サンプルコンパートメントのサンプルホルダーに配置し、蓋を閉めます。「run」をクリックして、適切な時間間隔で蛍光データを収集します。この間隔が30秒や60秒など短い場合は、最後の時点に達するまで、測定の合間にQ獣医を機械に置いたままにしても問題ありません。
反応を獣医からそのサンプルチューブに戻し、完了したらチューブをインキュベーターに戻します。組換えタウとP talを使用して、前に指示されたように獣医を傾けます。蛍光色素の有無にかかわらず、タウおよびp talを含むアミロイドタンパク質凝集体に結合する際のフラビンtおよびsの強い蛍光発光を利用して、タウおよびp talの凝集の動態を比較するために2つの異なるプロトコルが確立されました。
凝集反応では、高リン酸化によるタウ凝集の増強が一貫して見られました。通常、Tとp tal ligaは、フラビンを含む有意なスローダウンが発生する前に、最初の30分以内に急速に上昇します。凝集反応中のTは、凝集速度の大幅な遅延を引き起こします。
テオフ・フラウィウスのsとtは、160分間反応した後、高原に接近した。一方、バイオフラビンsは、凝集の顕著な減速を引き起こさなかった。この手順に続いて、神経変性におけるアイソフォームまたは他の凝集傾向タンパク質への追加の中枢神経系、ライキンをアッセイを用いて行うことができ、その開発後の病因におけるタンパク質化の寄与を理解する
ために。この技術は、現場での研究のために高リン酸トップタンパク質PAの方法を準備し、私たちの治療法と医薬品開発を探求するための多数の病気です。
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概要
この研究では、in vitroアッセイを用いて、未修飾および過リン酸化されたタウタンパク質の凝集動態を調査しています。結果は、アルツハイマー病の進行を理解する上で重要な、過リン酸化依存性のタウ線維化の促進を強調しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- アルツハイマー病研究
背景
- タウタンパク質は神経細胞の微小管の安定化に重要です。
- タウの過リン酸化は神経変性疾患と関連しています。
- タウ凝集の理解は治療戦略の開発に不可欠です。
- in vitroアッセイはタウ凝集の動態に関する洞察を提供できます。
研究目的
- 未修飾および過リン酸化されたタウタンパク質の凝集動態を比較すること。
- タウ凝集に影響を与える可能性のある化合物をスクリーニングする方法を確立すること。
- タウ線維化における過リン酸化の役割を解明すること。
使用した方法
- ジッパー支援触媒システムを用いて未修飾および過リン酸化されたタウタンパク質を生成すること。
- 異なる機器に適した凝集アッセイを設定すること。
- チオフラビン染料の蛍光を用いてタウ凝集をモニタリングすること。
- 凝集曲線をプロットし比較して、動態の変化を評価すること。
主要な結果
- 過リン酸化されたタウは未修飾タウと比較して、より速い凝集動態を示します。
- 蛍光測定はタウ線維化速度と相関しています。
- この研究は、タウ調節化合物の将来のスクリーニングのための枠組みを提供します。
- 結果はアルツハイマー病の分子メカニズムの理解に貢献します。
結論
- 過リン酸化はタウ凝集動態を著しく促進します。
- in vitroアッセイはタウタンパク質の挙動を研究するのに効果的です。
- 将来の研究は、これらの知見に基づいて治療介入を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay enables direct evaluation of hyperphosphorylated tau aggregation kinetics, a key pathological driver in Alzheimer's disease and related tauopathies. By using disease-relevant, post-translationally modified tau, the method improves target validation confidence and supports early de-risking of therapeutic hypotheses. It provides a scalable, quantitative platform for screening compounds that modulate tau fibrillation, aligning with preclinical target engagement and lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the therapeutic hypothesis that hyperphosphorylation drives pathogenic tau aggregation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of modified and unmodified tau to isolate phosphorylation-dependent effects.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking a defined molecular modification to measurable fibrillogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses thioflavin S and T fluorescence to quantitatively monitor aggregation kinetics in real time.
- Operational Value: Compatible with microplate readers and spectrophotometers, enabling scalable, reproducible measurements.
- Assay Readiness: Supports high-throughput adaptation for compound library screening against hyperphosphorylated tau.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses recombinant hyperphosphorylated tau to model disease-relevant protein conformation.
- Preclinical Relevance: Provides a mechanistic readout for target engagement in neurodegeneration programs.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of compound effects on tau aggregation before cellular or in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic de-risking and enabling hit identification in screening cascades. Its quantitative output supports go/no-go decisions based on target-specific biochemical activity.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that hyperphosphorylation enhances tau fibrillation, a core mechanism in tauopathy pathogenesis.
- Screening: Generates dose-responsive, kinetic data suitable for evaluating compound effects on aggregation rates.
- Analytics: Produces fluorescence-based aggregation curves that allow comparison of lag time, growth rate, and plateau values.
- Translational Research: Connects biochemical target modulation to disease-relevant protein pathology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biochemical assay platform for tau-targeted programs across multiple targets and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating the impact of tau hyperphosphorylation on aggregation.
- Operational Value: Standardized reagent preparation and instrument settings ensure reproducibility across labs and timepoints.
- Strategic Value: Improves prediction of target modulation efficacy, reducing failure risk in later preclinical stages.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of compounds based on target-specific biochemical activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and aggregation assay design.
- Dependent on access to fluorimeters or microplate readers with configurable excitation/emission settings.
- Necessitates standardized reagent preparation, including fresh aggregation buffer and DTT supplementation.
- Must account for variability in protein aggregation behavior across batches and storage conditions.
- Limited to in vitro systems; does not capture cellular clearance, seeding, or neurotoxicity mechanisms.
