BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

本実験の全般的な目的は、燃料の簡便さを実証し、放射励起放出イベントによる赤色光子の発生を観察することである。これは、生物発光細菌と発光ナノ粒子を組み合わせて燃料を生成することで達成される。次に、生物発光プレートリーダーを用いて、得られた燃料から生じる赤色光子を観察する。その結果、生物発光細菌と量子ドットを同一溶液内で保持することで、相当量の赤色光子を生成できることが示される。

赤色光子フラックスの増加が観察されたことに基づき、本手法の意義は、個々のコロニーから開始する場合に文献でしばしば報告されているNCE常在性侵入転移またはBrettのパラダイムに疑問を投げかける方向へと広がります。標準的な培養プレート上の個々のコロニーから、発光細菌のオーバーナイト培養を開始してください。

ここでは、実験当日にVibrio Fisher Eyeを使用しました。新鮮なサブカルチャーを開始し、600 nmでの光学密度（OD600）が1～1.5に達するまで培養します。同等の結果を得るために、強力なシグナルを産生する同様の増殖段階にある細菌を使用してください。

それぞれから100 µLずつ分注し、5 µLの蛍光プローブ（QD 7 0 5）または生理食塩水と混合します。次に、この混合液を895 µLの生理食塩水とともに標準的な分光光度計用キュベットに加えます。充填したキュベットを個体用バイオルミネッセンスイメージング装置に設置し、適切なフィルターセットを用いて測定を行います。

ここでは、さまざまな距離での燃料の測定を行うために、710から730ナノメートルの放出フィルターを使用しました。2つの小型プラスチック製分光光度計用キュベットに、生理食塩水で全量を1ミリリットルとした、50マイクロリットルのQD 705または97.2マイクロリットルの非蛍光性48ナノメートルポリスチレン微粒子を充填します。これにより、2つの実体の全量あたりの固体表面積を同等にすることが可能です。

標準的な黒色テープまたは光を遮断できるその他の不透明な材料で3番目のqveを包み、光源qveを準備します。veteの反対側に2つの同一の光学窓を慎重に作成します。新鮮なサブカルチャーから得られたVibrio fiiまたはその他の培養液を1 mL分注して光源veteに加え、光の混入を抑えるために黒い紙などの不透明な材料で覆います。

次に、あらかじめ充填したキュベットをイメージャー内の光源の両側に直接配置します。全光および710〜730 nanometerの放出フィルターなどの適切な放出フィルターを用いて、3つのキュベットをそれぞれ10秒、30秒、30秒の露光時間で可視化します。450〜480 nanometerの励起および710〜730 nanometersの放出で蛍光画像を取得し、QD 705の位置を確認します。

両方の外部Q Vetを、中央Q Vetから同等の距離だけさらに離して再配置します。その後、蛍光画像を可視化して取得し、最終的な対面距離が3 cmになるまでこのプロセスを繰り返します。容量を小さくした2本のキュベットのうち、一方にfluoro fourまたは目的の蛍光ナノ粒子を含む1 mLの溶液を、もう一方に陰性対照として非蛍光ナノ粒子を含む生理食塩水を満たします。

新鮮なVibrio FIIまたはその他の発光細菌の1 mL分注量を、反対側に物理的に等しい2つの光学窓を備えた、遮光された3路キュベットに加えます。遮光されたキュベットを、黒い紙などの不透明な物質で、短くかつ等しい距離で覆います。この遮光されたQキュベットの両側に、容量を減らした2つのキュベットを配置し、適切なフィルターの下で視覚化します。ここでは0.7 cmの距離を用いました。QD705の他の蛍光についても、細菌を用いて同様に繰り返します。

細菌のみの場合と比較して、赤色光子の数が大幅に増加していることが観察されます。吸収体が存在しない場合、対照燃料は長距離にわたって発生することがあります。この距離依存性は、逆二乗則によって特徴づけることができます。

点光源について。フローラの細菌膜への標的化は、生成される燃料信号の総量にほとんど、あるいは全く影響を与えないと考えられます。この状況において、標的化された燃料は、数回の洗浄工程後でも維持されます。

このビデオを視聴することで、放射励起放出イベントから赤色光子を生成するための手段として、複数のモダリティで燃料を再構成する方法を十分に理解できるはずです。