Name: BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶFUEL技術による赤色光子生成法。発光細菌と蛍光ナノ粒子を組み合わせ、放射励起発光イベントを観察する。距離依存性や標的化効果を評価し、従来の蛍光パラダイムに挑戦する新手法を理解できる。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、JD、ああ（（SLS）は、EU-FP7プログラム「オートメーション」、ゲーテカルノープログラム11（JD、CS、CSに）ニューヨークのパスツール財団からの財政支援のために感謝の意を申し上げますAR、RT、SLS）およびRT、SLSのプロジェクトIMNOS（）、コニー·メーヴ慈善財団（SLS）、分子イメージングの欧州マスターズ（それを）、 地方イル=ド=フランスプログラム MODEXA（SLS）、ゴマ（SLS）とDimMalInf（SLS、RT）、Biologie-サンテアンANRプログラムグランデヴェスドゥアベニールインフラNationales： フランスLifebioImaging（FLI）フランス生活イメージング（RT、SLS）、 フランスバイオイメージング （JD、SLS）とパスツール研究所、パリ。さらに、著者らは、試薬について、ホセ·Bengoecheaとハーバートシュバイツァーに感謝したいと思います。さらに、著者らは、抗体を生成したシンディフェーブルに感謝したいと思います。

1。試薬<ol><li>購入またはそのようなルクス ABCDE 21を発現する改変大腸菌（Escherichia coli）などの発光細菌や適切な培養培地を開発し、 ビブリオフィ、フォトバクテリウム属、肺炎桿菌22。 </li><li>標準レシピによると、生理食塩水（0.9％NaCl）で、文化メディアソリューションを準備します。E.大腸菌とK.肺炎連鎖球菌は、37℃、およびV.でルリアベルターニ（LB）中で増殖させた。 22℃で、0.5MのNaClを添加したLB中でシャリとフォトバクテリウム属</li><li>購入又はQ-トラッカーなどの蛍光プローブ705（40nmの直径、QD705と称する）を取得する、Q-トラッカ800（40nmの直径、QD800と称する）、蛍光（40nmの直径）と非蛍光ポリスチレン微小球（ 48 nmの直径）、および従来の蛍光染料。 </li><li>細菌の標識に必要な試薬を準備します。 </li><li>へのアクセスを確保発光波長と露光時間の広い範囲の下でシグナルを検出することができるようなIVISスペクトルなどの全動物生物発光イメージャ。生物発光の測定が可能なプレートリーダーは、ここに記載した実験のほとんどは十分です。 </li></ol>燃料の2。基本的な要約<ol><li>標準的な培養プレート上の個々のコロニーから開始し、発光細菌の一晩培養を開始します。ここでは、V.シャリを使用した。 </li><li>実験日は、新鮮なサブカルチャーを開始し、1〜1.5のOD 600が達成されるまで、それらが進行することができます。比較可能な結果を​​生成するために、それらが強いシグナルを生成する同様の増殖状態の細菌を使用するのが最適である。これは、OD 600を一定に保つことによって確保することができる。 </li><li> 5 QD705の液または生理食塩水（PS）のいずれかとのそれぞれから、100μLのアリコートを結合してから、スタンダにPSの895μlに追加番目の分光学キュベット。 IVISスペクトラムに充填されたキュベットを置き、適切なフィルターセットの下で測定を行う。ここで、710〜730 nmの発光フィルターを使用した。 </li></ol> 3燃料以上の様々な距離<ol><li> 1ミリリットルPSの総容量QD705を50μlまたは非蛍光48 nmのポリスチレン微小球の97.2μlのいずれかとの2減少した体積（1ミリリットル）プラスチック測光キュベットを埋める。これは、2つのエンティティ間の総体積あたりの同じような固体の表面積を保証します。 </li><li>標準的な黒のテープや光を遮断することができるいくつかの他の不透明材料と第三のキュベットを包むことにより、光源のキュベ​​ットを準備します。慎重にキュベットの両側に二つの同一の光学窓を用意。 </li><li>光源キュベットのいずれかの側に直接、以前に満たされたキュベットを配置します。 Vの1ミリリットルの分量を追加シャリや他の文化（ すなわち発光大腸菌やフォトバクテ S光源キュベットに新鮮なサブカルチャーからのp）と任意の光汚染を低減するような黒い紙などの不透明材料、でそれをカバーしています。 </li><li>それぞれ、10,30、および30秒の露光時間で、例えば、全光線および710〜730 nmの発光フィルターなどの適切な発光フィルター下で3キュベットを可視化する。 </li><li>中央キュベットから同等の更なる距離で両方の外部キュベットの位置を変更し、再度可視化する。 3センチメートルの最終対面（還元ボリュームキュベットの中心）の距離が達成されるまで繰り返します。各ステップにおいて、QD705の場所を検証するために蛍光画像（450〜480 nm励起、710〜730 nmの発光）を取得する。 </li></ol> 4。潜在的な燃料ペアの調査<ol><li>他の中のネガティブコントロールとして非蛍光ナノ粒子蛍光体または1の関心の蛍光ナノ粒子のいずれかを含有する1ミリリットル溶液を用いて2削減量キュベットを記入し、PSまたはPS。目の中に電子作業は、表1に概説されるように潜在的な市販のFUELフルオロフォア及び蛍光ナノ粒子の種々検討した、ここに示された。 </li><li>新鮮Vの1ミリリットルの分量を追加反対側に位置する2つの物理的に同等の光学ウィンドウが格納されているブラックアウトサードキュベットにシャリや他の発光細菌。黒一枚の紙のような不透明な物質でキュベットをカバーしています。 </li><li>短いが等距離の場所で2削減量のブラックアウトキュベットのいずれかの側のキュベットし、適切なフィルタの下に視覚化する。ここで、0.7センチの距離を用いた。他の蛍光体で繰り返します。 </li></ol> 5。ターゲットFUEL <ol><li>発光細菌に特異的なビオチン化抗体を調製する。 Kに具体的な例については、ここでは一次抗体肺炎連鎖球菌 （α-Kpを）はEZ-リンクスルホ-NHS-LC-ビオチンを含有する溶液を用いてビオチン化した。 </lI&gt; <li> 2分間の遠心分離（1500×g）での下で脱塩カラムを用いて抗体から過剰の試薬を除去。 </li><li>タンパク質濃度を決定し、HABAアッセイによる抗体のビオチン化の程度を決定するための標準的なブラッドフォードアッセイを使用する。 </li><li> Abおよび最終的に16のビオチン残基の置換の最終度で、その結果、40μlのα-KP抗体で100μL（1×PBSに溶解した10ミリメートル、）混合することにより、α-KP-ビオビオチン化抗体（AB）のバッチを取得10mgの溶液のタンパク質濃度-1。 </li><li>複数使用することで、一晩、文化を複製、適切なプロトコル、以下、上記の抗体を用いて洗浄した細菌をターゲットにしています。 <ol><li>具体的には、Kを洗う1X PBS中で、肺炎 、および4のODに1X PBS中に再懸濁（ 約 4×10 8 CFUミリリットル-1 OD -1）。 </li><li>各反復のために、100μlのPBSインキュベート、α -KP抗体（制御用10μlのα-KP-biotBまたは10μLのPBS）と30℃で90分間、100μlの細胞1X PBS中で細胞を3回洗浄し、196μlのPBSに懸濁します。 </li></ol></li><li> QD705ストレプトアビジンコンジュゲートで細胞を標識し、2つの等価ボリュームに分割する。 </li><li>一つの解決策を3回洗浄した後、適切な音量にそれを懸濁します。 </li><li>黒色96ウェルプレートの各ウェルに洗浄し、洗浄されていないソリューションを100μlを配布します。得られた全光の下で発光、490から510 nmであり、710から730 nmのフィルターを測定します。フルオロフォア濃度は、450〜480 nmの励起および710〜730 nmの発光を用いて決定することができる。 </li></ol>

<ol><li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li>
<li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%3A+progress+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%3A+Official+Journal+of+the+Society+for+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li>
<li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262(2012).</li>
<li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28BRET%29+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li>
<li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li>
<li>So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li>
<li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li>
<li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li>
<li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence%3A+Broadening+the+scope+of+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li>
<li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li>
<li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria%3A+general+cell+morphology+and+envelope+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li>
<li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+gel%3A+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li>
</ol>

著者は、経済的利益を競合宣言する。 JD、SB、KLRとSLSは、欧州特許EP10290158.4に貢献し、世界知的所有権機関特許出願WO/2011/117847。

FUELの基本的な実証は、蛍光ナノ粒子または量子ドットで発光細菌を混合することによって簡単に達成することができる。 2つのエンティティが物理的に分離され、任意の効率的なRETの距離を超えて残ることになる。より困難なインビトロおよびインビボの両方FUEL信号の最適化である。 in vitroの条件下では、とし、光吸収体の存在の有無の両方、通常は過剰蛍光体のほかには、燃料の応答を最大にするために十分である。しかし、高濃度ではそのような静的または衝突消光などの現象は、蛍光信号の損失につながることができます。独立して、発光源と蛍光体の濃度を変えることにより希釈系列を実行すると、所望の濃度を最適化するのに役立つ。 インビボ濃度下FUELの確立および最適化は、はるかに困難であり、ケースバイケースで対処する必要がある。なお、共を作成することは困難である蛍光実体が発光源によって光学的にアクセスすることができますndition。このように、二つの部分の直接の共注射で開始すると、最適条件下でFUELの成功に関する情報を提供することができる。 標準プロトコルは、Alexaのシリーズや量子ドットなどの蛍光実体で標識する細菌や真核細胞のために存在する。多くの場合、これは減少し、細胞生存率または変化した代謝活性のような望ましくない影響をもたらすことができる抗体を用いた表面機能化や活性化を必要とします。これを克服するために、蛍光標識を最大にしながら細胞の摂動を最小限に抑える必要な抗体または活性化剤の最適量を決定することが重要である。 QDの使用は、それらの特徴的な広い励起スペクトル、狭波長可変発光スペクトル、広いストークスシフトの可能性が有利である。しかし、QDは、細胞傷害性であることができ、いくつかのケースでは望ましくないことがある。 <pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt; FUELは、多くのBRET実験13中に存在する、発光および蛍光種々の供給源にも適用可能である現象である。今まで、FUELから生じる光子は非特異的相互作用もしくは不十分に設計されたBRET実験から得られた不幸なバックグラウンド信号との積とみなした。それは我々が、この不要な信号の有用性を識別することができた、ここで実証実験の種類だけである。図示の実施例において、発光細菌は、蛍光実体の多種多様の標準蛍光応答を誘発することができる拡散励起源として作用する。さらに、実質的により作動距離のために、それはFUELがBRETが発生することなく構成することができるが、一般にBRET FUELからの寄与なしに観察することができないと結論しても安全である。重要なことに起因する標的要件の欠如のために、FUELはBRET及びcの間に存在する空間的な間隙を覆うために使用することができるonventional全動物のイメージング技術。

このようなウイルス1、2、3、細菌、または小型哺乳類などの生物の遺伝子改変は、4誘導または構成的に発現する生物発光のいずれかに、非常に成功しており、広く5-7実証されています。生物発光は、天然に存在する試薬を含むインビボでの化学発光反応は、外部光源を必要とせずに、光を生成するという利点を有する。このように、生物発光イメージング、蛍光イメージング8から求めた自己および非特異的シグナルの共通の欠点に悩まされない。任意の検出された信号が意図源のみから由来するので、その結果、生物発光は、有意な信号対雑音比を有する。多くのモデルは、in vitroおよびin vivo用途9用のPhotorhabdusルミネセンスからルクスオペロン（480と490との間に中心発光極大）を悪用しているが、小さなmammでの使用ALSは、撮像条件の性質そのものに問題があった。ヘモグロビンのような光吸収体の存在を浸透していると、このような組織および骨のような薬剤を、散乱が強く、黄色の波長3、青に影響を与える。設計ホタルルシフェラーゼ（617nmで発光極大）の発現は、最近開発され、取り込まれ、大幅に光吸収10を克服し、ツールを提供するが、それでも散乱効果が適用されてきた。 これに応答して、赤色シフト生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）11-13を用いて、650〜900 nmの最小化吸収と散乱の領域の所望の光学窓に発信された信号を複数の試みがなされてきた。信号検出を強化するためのツールと​​して、受容体としてのドナーを追加しました蛍光団として生物発光源を使用していますBRETは、限られた成功を発見した。この現象の精液例として、「自己発光量子ドット4; （SIQDs）14で構成されてウミが外部ポリマー-リジン層に結合されたルシフェラーゼをウミ修正 市販の量子ドット（QD）。基質添加後、得られた生物発光反応は、赤色光子の有意な産生を生成し、量子ドットからの蛍光発光を誘導する。しかし、これらのSIQDsは、生理学的に関連するイベントのin vivo可視化への適用が限られている。この限定された適用性は、SIQDsが遺伝的にエンコードできないため、ポリマーシェルの二次変性を必要とすることから、臓器、細胞または関心のある遺伝子に二重のプローブをリンクすることの難しさに起因する可能性が高い。それらの適用性を改善するために、ルシフェラーゼは、発光コアに直接結合されている他のSIQDsは、最近15を採用してきた。 SIQDコンセプトからさらに発展、より適切BRETシステムは、内にウミホタルルシフェラーゼを付加することによって達成された675 nmの460 nmのからの実質的なレッドシフトを生成しながら、具体的マウスの腫瘍を標的にすることができた色素16を 、docyanine。非放射エネルギー移動を受けることが、BRETは、蛍光カウンターパートと同じ主な制約に従います。ドナー発光とアクセプターの励起スペクトルと2の部分の間の作動距離との間に強いスペクトルの重なりがなければならない程度である必要がありますフェルスター半径（5月14日Nmは二回フェルスター半径17の実効的な最大距離で、ドナー·アクセプターペアによって異なります）。この距離依存性が大きく検出を強化する手段としてBRETを用いて観察することができるイベントの種類を制限する。 最近、新しいアプローチは、in vitroおよびin vivo条件下での両方で識別され、実証された。 BRET、発光（燃料）から18、19、未結合の励起によって蛍光の基礎をオフに構築</suP&gt;また、発光と蛍光成分との間に強いスペクトルの重なりを必要とします。しかしながら、BRETは異なり、FUELは、発光源から出射された光子が続いてフルオロフォア量子収量に応じて赤色にシフト光子を放出する光学的にアクセス可能なフルオロフォアによって吸収される完全放射過程である。 BRETに似て、このアプローチはまた、光吸収体の存在下での撮像の制約を克服するために使用することができる。得られた赤色シフトは、減衰の減少と光散乱効果の減少に検出された信号の全体的な増加および特異性を提供する。 FUELは、 ルクスオペロン及び量子ドット18,19を発現する生物発光大腸菌の間で発生することが報告されている。 SIQDsに実験的に類似しているが、根本的な違いが存在する：燃料中の発光源がFOを可能にする蛍光団、物理的に拘束されることにのために、それは必要ありません発光プローブの遺伝子コード化をrを。による発光細菌および量子ドット間のFUELの検出に成功すると、この技術は表面的（皮膚）および深部組織（肺、肝臓）、例えば黄色ブドウ球菌および肺炎連鎖Klebsielliaなどの感染の両方に適用可能であることが可能である。 その実験的有意性の報告以来、FUELは、許容可能な発光性、蛍光対を予測するために使用することができ、そのアプリケーションが、量子収量などの光物理学的特性の同定における使用を含むように拡張されている強固な数学的モデル20を含むように進化してきた。我々は、燃料の基本的な技術のいくつかの下に説明します。まず、（μm）と短く、基本的にBRETから燃料を区別し、長さ（cm）作動距離、両方の上にこの現象の証拠を示す。第二に、我々は、フルオロフォアおよび蛍光性ナノ粒子の多種多様を調べることによって可能FUEL対を拡張。 THIRdは、FUELアプリケーションは、標的化および非標的化FUEL対を比較することにより調べた。

<table><tbody><tr><td><>em>luxABCDEオペロンを表現する<emEscherichia coli</td><td></td><td></td><td>Jos&eacute; A. Bengoechea の許可を得て提供されました Herbert P. Schweizer</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145は血清型K2参照株</td></tr><tr><td>Luria Bertani(LB)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>標準成長培地</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>ライフサイエンス</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>ライフサイエンス</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>ライフサイエンス</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>ライフサイエンス</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>ライフサイエンス</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>ライフサイエンス</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>非蛍光マイクロスフェア</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Pink microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8887</td> 直径 <td>40 nm</td></tr><tr><td>Yellow microspheres</td><td>Life Sciences</td><td>F8888</td> 直径 <td>40 nm</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABAアッセイキット&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford アッセイ</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

bret歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

ルミネセンス（FUEL）から未結合の励起による蛍光は、 インビトロおよびインビボで増加信号およびコントラスト強調を生成する放射励起発光プロセスである。燃料株式生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）と同じ基本的な原則の多くはまだ大幅に発光源と蛍光エンティティ間の許容可能な作動距離が異なっている。 BRETを効果的に2倍のフェルスター半径、一般的に14未満程度の最大値に制限されている間、燃料は光吸収体が存在しない場合にミクロンまでの距離で、あるいはCM発生する可能性があります。ここでは、現象の背後にある、関連する原則を見直すことで、燃料の基礎と応用を拡張し、フルオロフォアおよび蛍光ナノ粒子の多種多様なシステムの適合性を実証する。さらに、抗体標的燃料の有用性が検討されている。ここに示す例は、FUELはapplを利用することができるという証拠を提供するBRETが不可能なications、BRET、伝統的な動物全体のイメージングの間に存在する空間的空白を埋める。

関連する原則を調査し、フルオロフォアおよび抗体標的条件は多岐との互換性を実証することによって発光（燃料）から未励起によって蛍光の基礎と応用性を拡大しています。

BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

本実験の全般的な目的は、燃料の簡便さを実証し、放射励起放出イベントによる赤色光子の発生を観察することである。これは、生物発光細菌と発光ナノ粒子を組み合わせて燃料を生成することで達成される。次に、生物発光プレートリーダーを用いて、得られた燃料から生じる赤色光子を観察する。その結果、生物発光細菌と量子ドットを同一溶液内で保持することで、相当量の赤色光子を生成できることが示される。赤色光子フラックスの増加が観察されたことに基づき、本手法の意義は、個々のコロニーから開始する場合に文献でしばしば報告されているNCE常在性侵入転移またはBrettのパラダイムに疑問を投げかける方向へと広がります。標準的な培養プレート上の個々のコロニーから、発光細菌のオーバーナイト培養を開始してください。ここでは、実験当日にVibrio Fisher Eyeを使用しました。新鮮なサブカルチャーを開始し、600 nmでの光学密度（OD600）が1～1.5に達するまで培養します。同等の結果を得るために、強力なシグナルを産生する同様の増殖段階にある細菌を使用してください。それぞれから100 µLずつ分注し、5 µLの蛍光プローブ（QD 7 0 5）または生理食塩水と混合します。次に、この混合液を895 µLの生理食塩水とともに標準的な分光光度計用キュベットに加えます。充填したキュベットを個体用バイオルミネッセンスイメージング装置に設置し、適切なフィルターセットを用いて測定を行います。ここでは、さまざまな距離での燃料の測定を行うために、710から730ナノメートルの放出フィルターを使用しました。2つの小型プラスチック製分光光度計用キュベットに、生理食塩水で全量を1ミリリットルとした、50マイクロリットルのQD 705または97.2マイクロリットルの非蛍光性48ナノメートルポリスチレン微粒子を充填します。これにより、2つの実体の全量あたりの固体表面積を同等にすることが可能です。標準的な黒色テープまたは光を遮断できるその他の不透明な材料で3番目のqveを包み、光源qveを準備します。veteの反対側に2つの同一の光学窓を慎重に作成します。新鮮なサブカルチャーから得られたVibrio fiiまたはその他の培養液を1 mL分注して光源veteに加え、光の混入を抑えるために黒い紙などの不透明な材料で覆います。次に、あらかじめ充填したキュベットをイメージャー内の光源の両側に直接配置します。全光および710〜730 nanometerの放出フィルターなどの適切な放出フィルターを用いて、3つのキュベットをそれぞれ10秒、30秒、30秒の露光時間で可視化します。450〜480 nanometerの励起および710〜730 nanometersの放出で蛍光画像を取得し、QD 705の位置を確認します。両方の外部Q Vetを、中央Q Vetから同等の距離だけさらに離して再配置します。その後、蛍光画像を可視化して取得し、最終的な対面距離が3 cmになるまでこのプロセスを繰り返します。容量を小さくした2本のキュベットのうち、一方にfluoro fourまたは目的の蛍光ナノ粒子を含む1 mLの溶液を、もう一方に陰性対照として非蛍光ナノ粒子を含む生理食塩水を満たします。新鮮なVibrio FIIまたはその他の発光細菌の1 mL分注量を、反対側に物理的に等しい2つの光学窓を備えた、遮光された3路キュベットに加えます。遮光されたキュベットを、黒い紙などの不透明な物質で、短くかつ等しい距離で覆います。この遮光されたQキュベットの両側に、容量を減らした2つのキュベットを配置し、適切なフィルターの下で視覚化します。ここでは0.7 cmの距離を用いました。QD705の他の蛍光についても、細菌を用いて同様に繰り返します。細菌のみの場合と比較して、赤色光子の数が大幅に増加していることが観察されます。吸収体が存在しない場合、対照燃料は長距離にわたって発生することがあります。この距離依存性は、逆二乗則によって特徴づけることができます。点光源について。フローラの細菌膜への標的化は、生成される燃料信号の総量にほとんど、あるいは全く影響を与えないと考えられます。この状況において、標的化された燃料は、数回の洗浄工程後でも維持されます。このビデオを視聴することで、放射励起放出イベントから赤色光子を生成するための手段として、複数のモダリティで燃料を再構成する方法を十分に理解できるはずです。

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、蛍光信号からのラマン分離する超高速全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を利用したラマン及び蛍光信号を分離することができます。...

共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。...

二分子蛍光相補

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。...

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

ここでは私たちはドナーとアクセプターフルオロフォアサイト間のプロテアーゼ切断部位を導入する改良された発光共鳴エネルギー移動（LRET）方法を記載している。この修​​飾は、タンパク質精製せずに膜タンパク質の研究を可能にする、目的の膜タンパク質から生じる特定のLRET信号を得ることを可能にする。...

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

このプロトコルは、ルテニウム錯体を化学発光発光源として使用する新しい術中イメージング技術を説明しています。これにより、in...

生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術

この記事では、オープンソースの安価なsmfBoxを使用して、スイッチオンからアライメント、フォーカス、データ収集と分析まで、個々の生体分子を自由に拡散して、個々の正確なFRET測定を行うためのステップバイステップの手順を説明します。...

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

インビボフェルスター共鳴エネルギー移動測定に対して標準の共焦点レーザー走査顕微鏡を設定し、その後データ評価を行うためのプロトコルが提供されています。...

植物細胞におけるフェルスター共鳴エネルギー移動測定

このプロトコルは、生細胞中のCRAFキナーゼと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するためのBRETベースのアッセイを説明しています。このプロトコルでは、細胞の調製、BRET排出量の読み取り、およびデータ解析の手順を概説しています。また、アッセイ最適化のための適切なコントロールとトラブルシューティングの特定を含む結果の例も示します。...

生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ

学ぶFUEL技術による赤色光子生成法。発光細菌と蛍光ナノ粒子を組み合わせ、放射励起発光イベントを観察する。距離依存性や標的化効果を評価し、従来の蛍光パラダイムに挑戦する新手法を理解できる。

BRET歩：バインドされていない励起による蛍光発光から（燃料）

さらに動画を探す