Name: Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ アクチン結合タンパク質Aip1pの動態を、R256H変異アクチンを発現する酵母で可視化する方法。全反射蛍光顕微鏡を用いて、変異アクチンが細胞骨格ダイナミクスに与える影響を解析する技術です。

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著者は、元PB1996クローンするための有用な議論と技術的なアドバイスのためのピーター·ルーベンスタイン、デビッドPellmanに感謝します。この作品は、ダイムの月からの助成金や子供のためのライドからの資金によって支えられている。

1。PB1996プラスミドへのクローニング<ol><li>デザインと注文DNA標的配列に隣接し、選択した親プラスミド中のユニークな制限部位を含むオリゴヌクレオチド製造会社からのプライマー。注：この場合、プライマーは、AIP1配列の5 &#39;末端に400塩基対を増幅するように設計した。 XhoI制限部位は、約20bpのAIP1配列の前にプライマーに組み込んだ、とXmaI AIP1は、標的配列の後に約20塩基対を含めた。クローニングに用いたプラスミドは、蛍光用3XGFPタグ、酵母株選択のためのURA遺伝子、および細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含むPB1996であった。 </li><li>裏酵母一倍体株からゲノムDNAを精製する。注：クローン作成プロセスの図については図1を参照してください。 </li><li>いずれかの専用の制限部位とAip1p遺伝子を増幅するために二つのプライマーおよび酵母ゲノムDNAを用いた標準的なPCR反応を実行D。推奨されるプロトコルをメーカーごとに別々の反応において制限酵素でPCR産物およびPB1996プラスミドを消化する。この場合のXmaIおよびXhoIで1時間37℃で添付の緩衝液で使用した。 </li><li>消化されたDNA断片を分離するために、0.8％アガロースゲル電気泳動を実行する。 1ウェル内に、低いDNA質量ラダーをロードして、別々のウェルに、各々の消化から全反応をロードします。色素の先端がゲルの終わり近くになるまで、約1時間、100ボルトでゲルを実行します。 UV光下でゲルを視覚化し、タンパク質のセグメントに対応するセグメントと切断プラスミドを精製した。 </li><li>消化AIP1セグメントとPB1996プラスミドを連結。製造元のプロトコルを用いてDH5α細胞中に製品を変換（2分間42℃で、氷、熱ショックで30分間、100μlの細胞を有する10μlのDNA、37℃で2時間SOC培地中で増殖）と、培養プレート上にプレートつまり、この場合のLB +で、選択のための抗生物質を含んでAmpプレート。液体培養で1コロニーを選択し、成長する。新たに設計されたプラスミドを精製する。 </li></ol> 2。変異酵母株の生成<ol><li>アクチン対立遺伝子変異酵母株を構築するために削除された半数体酵母株を使用してください。注意：この株は染色体アクチン遺伝子を欠いており、野生型酵母をコードするプラスミドが含まれているこの場合、親株は、ピーター·ルーベンスタイン（アイオワ大学）からの寛大な贈り物だったと建設はCook ら 20により記述されていた。アクチンとウラシル。 </li><li>突然変異誘発の21のベースプラスミドとしてのTrp +選択とのPRSコードするプラスミド野生型酵母のアクチンを使用してください。 </li><li>アクチンにミスセンス変異を設計するのPRSプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行う。 <ol><li>アクチンにおけるR256H変異について、彼の256のArg 256を変更するために、プライマー5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3」を作る。標準の突然変異誘発を実行ステップ2.2からのプラスミドを用いたPCR反応。 </li><li> DH5α細胞中にPCRから、変異アクチンプラスミドを変換します。プラスミドDNAを単離し、変異を確認するために、アクチン遺伝子を配列決定する。 </li></ol></li><li>ステップ2.1からの半数体酵母株に変異酵母のアクチンをコードするプラスミドを変換します。 </li><li>文化TRP-プレート上の形質転換細胞は変異酵母アクチンプラスミドを含むのTrp +を含む酵母を選択した。 </li><li> 5 - フル酸（5-FOA）を含有するプレート上TRP-プレートから継代培養細胞による野生型アクチンと（2.1で説明）ウラシルをエンコードし、元のプラスミドを欠いた細胞を選択する。 5-FOAは、機能的URA3遺伝子を発現賛否株で、毒性型、5 - フルオロウラシルに変換される。段階的に選択した後に成長した細胞のみが、変異アクチンプラスミドが含まれています。 </li><li>新しい酵母株からのプラスミドDNAを精製する。アクチン遺伝子変異体が存在する保証するために、プラスミドを配列決定。このS使用さらなる研究で訓練。このプロセスを図2に図解されている。 </li></ol> 3。酵母細胞にプラスミドの変換<ol><li>酵母染色体への組込みを可能にする制限酵素でAip1p-GFPプラスミドを消化する。 NOTE：制限部位は、蛍光タグ、目的の遺伝子、および選択マーカーを含むシーケンスブロックの外でなければならない。この場合、37℃で8μlのDNAを、1時間に伴う10倍の緩衝液1μlでのHpaI制限酵素の1μlを使用する</li><li>文化S. 30℃でのホイールのYPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース）中の5mlの一晩ウラシル（裏株）を合成することができない（工程2.5からの） セレビシエ細胞千X gでダウン5分間の細胞の1ミリリットルを紡ぐ。 </li><li>プレートの混合物を作る。のddH 2 Oで43 mlの1 MトリスpH7.5、5mlの250mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）2 mlを添加することにより10XTEを作る0を追加20mlの1XTEに酢酸リチウムの0.204グラム、次いで8ポリエチレングリコール（PEG）（MW〜3,300）のg及びフィルター滅菌し。 </li><li>ステップ3.2でスピンダウンした細胞から上清を除去し、残りの液体中の細胞を懸濁します。懸濁した細胞を、10 mg / mlのサケの精巣キャリアーDNAの2を添加する。ステップ3.1渦から消化したプラスミドDNAの10を添加する。プレートと渦の0.5ミリリットルを追加します。 1 M DTTおよび渦の20を添加する。 </li><li> 25℃で6〜8時間にわたって混合物をインキュベート熱は、10分間42℃の水浴中の細胞に衝撃を与える。彼らは、裏板に沈降してきたマイクロ遠心管の底部からの細胞のプレートを100μl。 2〜3日間、またはコロニーが形成されるまで30℃で培養する。 </li><li>外裏板に個々のコロニーと連勝を選択します。注：これらの細胞は、成長を考慮して、染色体に組み込まAIP1-GFPおよび裏遺伝子を有するプラスミドを含んでいる。次いで、これらの細胞をmicroscoで使用されるPY。 </li></ol> 4。全反射蛍光顕微鏡を用いてAip1pタンパク質運動の可視化<ol><li> 30℃で一晩ホイールにYPD中で組み込まAip1p-GFPで酵母細​​胞の培養を育てる9ミリリットルの浦のメディアへのサブカルチャー一晩培養物1ミリリットルを。それらが対数増殖期にあることを確実にするために、30℃でシェーカー上でさらに3〜4時間、細胞を増殖させる。 </li><li>ガラス顕微鏡スライドに細胞の3μLを加え、カバースリップを追加します。細胞は5分間スライドに解決することができます。ステージプレートの金具でスライドを置きます。 </li><li>客観的な油浸100X TIRFとデジタルCCDカメラを用いて全反射蛍光（TIRF）顕微鏡（488ナノメートル）でAip1p-GFPタンパク質を観察します。 SlideBook 5.0ソフトウェアを使用して、（取得された画像の個々のフレームは、 図2Aに示されている）5コマ/秒の速度で20秒間の画像を得る。 <ol><li> Cに集中するのエル、オープンSlideBook 5.0ソフトウェアとフォーカスコントロールにアクセスするには、ツールバーにフォーカスウィンドウのボタンをクリックします。 [スコープ]タブを選択し、100X-TIRF目的を選択します。上のランプの電源を入れ、15％、ランプバーをスライドさせます。 2×2にビンの設定を変更します。明視野にフィルタを変更してください。 </li><li>顕微鏡、コンピュータの画面上で見られるように焦点に細胞を持って来るためにファインフォーカスダイヤルを使用しています。 </li><li>ランプをオフにし、フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用して、ライブフィルタを変更し、TIRFM]ボタンをクリックします。 </li><li>顕微鏡の右側ポートに接続されたTIRFM照明に、Onにレーザ発光を回す。 </li><li>フォーカスウィンドウ内のストリーム]タブを選択し、録音を開始してから、明視野]ボタンをクリックして次のチェックボックスをオンにします。 </li><li> TIRFM照明に、レーザーの入射角を調整するマイクロメータを回す。これは、AIP1-GFP病巣からの蛍光発光を最適化し、バックグラウンド蛍光を最小化するために使用される細胞とスライド。 </li><li>所望の画像が表示されたら、[スタート]を押し​​ます。 20秒後、停止ボタンをクリックします。画像を保存します。メインメニューバーの[ファイル]タブの下で、名前を付けて保存するスライドを選択し、ファイルの場所と名前を入力します。 </li></ol></li><li>画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用してください。蛍光Aip1p病巣の動きとレートを追跡するために、マクロプラ​​グイン「手動トラッカー」を使用してください。 0.2秒の時間間隔のパラメータを変更します。 <ol><li>追加トラックの選択を使用して、四から八結合フレームを通じて、個々の蛍光タンパク質を選択し、追跡します。終了トラックコマンドを使用して、各フレーム間のタンパク質の動きの速度が結果ウィンドウに表示されます。 </li><li> Microsoft Excelスプレッドシートを使用して、各フレーム間の平均速度を決定する。目的の各細胞株のためのAip1p運動の平均速度を計算するための値を使用します。 NOTE：Aip1p運動の速度および平均非線速度の散布図は、 ふぃぎゅに示されている図2（b）再。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

病原性の変異による検査において細胞骨格と実用性のダイナミクスを可視化するための効果的な戦略は、ここに記載されている。高度な画像診断法は、細胞膜の近くにタンパク質の細胞内の動きを理解するための新しい機会を作成しました。全反射蛍光顕微鏡（TIRF）は、生きた細胞内の機能研究のための高感度の技法である。 TIRFはカバーガラスと、水性媒体の屈折率の差によるエバネッセント場を作成する角度のついた励起レーザーを使用しています。エバネッセント場のエネルギーは、フルオロフォアを励起するが、カバーガラスと水の間の界面の距離と共に指数関数的に減少する。これは、信号対雑音比及びカバースリップ/媒体界面上記50-250ナノメートルから強力な分解能と高い信号が得られる。これらの資質は、全反射顕微鏡を少なくして、生きた細胞内の単一分子レベルでの細胞骨格タンパク質を可視化するための強力なツールを作る光毒性および他の技術24に対して強化されたコントラスト- 26。 細胞骨格は、細胞のニーズに適応するために協調して取り組んで多数のタンパク質が含まれます。コフィリンによる...

アクチンは細胞骨格を構成する支配的なタンパク質であり、細胞分裂、細胞小器官の動き、細胞の運動性、収縮、およびシグナリングを含む重要な細胞プロセスに参加しています。過去10年間で、アクチンにおける疾患の原因となる変異は、筋障害の冠動脈疾患1-7に、障害の範囲につながる6ヒトアクチンアイソフォームの各々で発見されました。アクチン変異が疾患につながるそれによってプロセスが解明され続けています。酵母モデルは、単一の本質的なアクチンアイソフォーム、遺伝従順とアクチン配列及び機能の高い保存性の利点により、アクチン機能の変​​異の生化学的効果を研究するためのゴールドスタンダードのまま。研究では、個々のアクチン変異がドミナントネガティブ効果8との分子の特定の機能不全につながることを示している。たとえば、のLys-118残基に影響を与え、γ-非筋アクチンにおける難聴の原因となる変異はによって規制を変えるアクチン結合タンパク質ARP2 / 3 9。研究は、しばしば、インビトロで用いるタンパク質の分析：タンパク質相互作用。細胞中のタンパク質の局在化結合細胞生物学上のアクチン変異の効果の調査、特に、アクチンは限られている。 生体内での酵母細胞骨格の研究では、従来、倒立蛍光顕微鏡10からの固定された細胞の画像に依存しています。これらの実験は、アクチン細胞骨格の形態学についての基礎的なデータを提供しました。調査は複雑なので、細胞骨格網11,12を可視化する三次元共焦点イメージングを組み込んでいる。この撮影は、豊かさとアクチンパッチやフィラメントの相対的な位置の定量化を可能にします。薄いセクションの電子線トモグラフィーは保存細胞内構造13と比較して密な線維状のネットワークの形態画像に使用されてきた。混雑した携帯S小断面のペースは、この技術を用いて微粒子を詳細に調べることができる。イメージング研究は、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて生細胞に拡張されている。光退色およびバックグラウンド蛍光を緩和することができる場合には、タイムラプスイメージングは、細胞骨格タンパク質の動力学および環境条件11,14に対する応答として調べることができる。これとは別に、 インビトロでのアクチンフィラメントのダイナミクスの可視化は、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法を導入することにより進めた。広視野顕微鏡法と比較して、TIRFが減少バックグラウンド蛍光と個々のフィラメント15,16を監視するための造影という利点を有する。これらの特性により、TIRF顕微鏡法は、原形質膜17,18で細胞構造を監視するために、細胞生物学者によって適合されている。細胞骨格の変化を含む細胞事象、、することができます低光毒性、最大コントラスト、最小のバックグラウンド蛍光19でリアルタイムに可視化すること。 より良いセル、全反射顕微鏡およびタンパク質のタグ付けに動き、ローカリゼーション、および細胞骨格タンパク質のターンオーバーにアクチン変異の影響を理解するために使用された。ここで、 サッカロミセス·セレビシエにおける細胞骨格アクチン動態における臨床的に関連する突然変異の効果を研究するための方法が記載されている。具体的には、アクチン結合タンパク質、Aip1pの局在化および運動は、アクチンにおけるR256H変異を発現する細胞中で可視化し、定量した。これらの技術は、in vitro生化学的研究で補完し、タンパク質相互作用や機能をより深く理解することを可能にする。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルー</td><td>アムレスコ</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA、サケ精巣</td><td>からの一本鎖Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>警告!有害な刺激</td></tr><tr><td>真菌/細菌 DNA キット</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>低 DNA 質量ラダー</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>NE バッファー #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Any kit will work</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>2015/01/</td><td></td>06</tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD メディア</td><td>LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>メディア</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>どんなPCRマシンでも使えます</td></tr><tr><td>TIRF顕微鏡</td><td>オリンパス IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浜松 ORCA-Rカメラ</td><td>浜松</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aip1pダイナミクスはアクチンにおけるr256h変異によって変更される

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

アクチンの変異は、多くの場合、細胞骨格の機能を変更する特定の分子変化によるヒト疾患の範囲を引き起こす。本研究では、全内部蛍光を用いて、蛍光タグ化タンパク質のイメージングは​​（TIRF）顕微鏡法は、細胞骨格の力学の変化を視覚化し、定量化するために使用される。 TIRF顕微鏡および蛍光タグの使用はまた、アクチンの突然変異によって引き起こされる細胞骨格の力学の変化の定量化を可能にする。この技術を用いて、生細胞中の細胞骨格機能の定量化は、常に時代のタンパク質機能のインビトロ研究で補完する。一例として、アクチン残基R256に影響するミスセンス変異は、このアミノ酸は、相互作用の調節に重要な役割を果たしている示唆して3つのヒトアクチンアイソフォームが同定されている。細胞骨格アクチンの運動に突然変異R256Hの効果は酵母モデルを用いて検討した。アクチン脱重合にコフィリンを補助することが知られているタンパク質、AIP1があったN-末端緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識しTIRF顕微鏡法を用いてインビボで追跡した。野生型および変異株の両方でAip1pの移動速度を定量化した。 R256H変異型アクチンを発現する細胞では、Aip1p運動は制限され、移動速度が1.60に比べR256H細胞で0.88±0.30ミクロン/秒（野生型細胞で測定されたほぼ半分の速度では±0.42、野生型細胞ではミクロン/秒、P &lt;0.005）。

画像への方法は、細胞内の細胞骨格タンパク質のダイナミクスを提示されている。アクチン結合タンパク質、Aip1pは、GFPでタグ付けされた。タグ付けされた生成物をコードするプラスミドのデザインを図1に示す。プラスミドは、次いで酵母細胞に形質転換した。蛍光の発現はAip1p、細胞内でのタンパク質の挙動の可視化を可能にしたタグ付けされた。 Aip1pは、一般的にエンドサイトーシス22のサイトで、アクチンパッチに局在する。 図2Aに示すように、Aip1pの動きを定量化するために、50以上の蛍光Aip1p病巣は、10以上の細胞中で追跡した。平均速度は、各蛍光Aip1p領域（ 図2Bを参照）を算出した。野生型細胞では、Aip1pの動きは、セル間での範囲であり、それ以降表示されなくなります。野生型細胞におけるAip1pの移動の平均速度は1.60±0.42ミクロン/秒である。 cyのアクチンの異常な形態を有することが知られてR256H変異アクチンを発現する細胞、23 toAllでは、変更されたAip1p表現型を...

アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。

Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

この手順の全体的な目的は、変異型アクチンアイソフォームを発現する酵母におけるアクチン結合タンパク質の移動を可視化することです。これは、まずプラスミドを作製し、アクチン相互作用タンパク質またはIP1P遺伝子に3x GFP（緑色蛍光タンパク質）をタグ付けすることで達成されます。次のステップは、野生型または変異型アクチンのみを発現する酵母株を作製することです。次に、GFPタグ付きA IP one Pプラスミドを野生型または変異型酵母株に形質転換します。最終ステップでは、野生型および変異型酵母細胞におけるタグ付きA IP one Pの移動をイメージングし、解析します。最終的には全反射照明法を用います。蛍光顕微鏡または全反射照明（TIRF）顕微鏡を用いて、R256H変異型アクチンを発現している酵母では、野生型アクチンよりもAIP1Pの移動速度が遅いことを示します。この手法は、結合パートナーの相対的な時間的移動など、細胞骨格分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法を着想したのは、野生型株とは異なり、変異型酵母株からAIP1Pを欠損させると致死的な結果になることを発見した時でした。共焦点顕微鏡などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、コントラストの向上とイメージング速度の向上です。一般的に、この手法に不慣れな方は、調整可能な項目が多く、画像品質の判断が主観的であるため、個々の実験に合わせて顕微鏡の設定を最適化することに苦労する場合があるかもしれません。本プロトコルは、テキストプロトコルの指示に従い、A IP one PGFPプラスミドと変異酵母株の作製から開始し、制限酵素でプラスミドを消化して酵母染色体培養への組み込みを可能にします。ウラシルを合成できない調製済みのS-C-V-C-A細胞を、5 mLのYPD培地にて30 °Cの回転装置で一晩培養します。細胞懸濁液1 mLを1000 ×gで5分間遠心分離します。次に、テキストプロトコルの指示に従ってプレート混合液を作成し、フィルター滅菌を行い、細胞から上清をデカンテーションで除いた後、残った液体で細胞を再懸濁します。10 mg/mL のサモン精巣キャリアDNAを 2 µL 加えます。次に、消化したプラスミドDNAを 10 µL 加えてボルテックスし、0.5 mL のプレートを加えて再度ボルテックスします。最後に、1 M の DI 3-etol を 20 µL 加えてボルテックスします。混合液を25 °Cで6〜8時間インキュベートした後、42 °Cのウォーターバスで10分間、細胞にヒートショックを加えます。マイクロ遠心チューブの底に沈殿した細胞懸濁液を100 µL取り、minus U プレートに播種します。30 °Cで2〜3日間、またはコロニーが形成されるまでインキュベートします。個々のコロニーを選択し、minus.ATEプレートにストリークします。顕微鏡観察の準備として、これらの細胞は、A IP one GFPとUroGenが染色体に組み込まれたプラスミドを保持しています。A IP one PGFPを組み込んだ酵母細胞の培養物を、YPD培地を用いて30 °Cで一晩、回転ディスク（wheel）上で培養します。一晩培養した培養液1 mLを、9 mLのマイナスUra培地に継代します。細胞をさらに3〜4時間、30 °Cのシェーカーで培養し、対数増殖期にあることを確認します。次に、3 µLの細胞をガラス製顕微鏡スライドに滴下し、カバーガラスをかけます。細胞がスライド上に沈降するまで5分間静置してください。スライドをステージプレートのブラケットに設置する前に、オイル浸漬100x TIRF対物レンズとデジタルCCDカメラを備えた全反射照明蛍光（TIRF）顕微鏡を用いて、A IP one PGFPタンパク質を観察します。細胞に焦点を合わせるには、Slide Book 5.0 ソフトウェアを開き、ツールバーにあるフォーカスウィンドウボタンをクリックします。フォーカスコントロールにアクセスするには、Scopeタブを選択し、100xの対物レンズを選択します。ランプを点灯させ、ランプバーを15%にスライドさせます。顕微鏡のビン設定を2×2に変更し、フィルターを明視野（brightfield）に変更します。微動フォーカスを用いて、コンピュータ画面に表示される細胞に焦点を合わせます。フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用してランプをオフにし、フィルターをliveに変更して、顕微鏡の右側ポートに取り付けられたT-I-R-F-MイルミネーターのT-I-R-F-Mボタンをクリックします。レーザー照射をオンにし、フォーカスウィンドウ内のstreamタブを選択します。「録画開始」の隣にあるボックスにチェックを入れ、TIRFM照明の明視野ボタンをクリックします。マイクロメーターを回してレーザーの入射角を調整します。目的の画像が表示された際に、A IP one GFPフォーカスからの蛍光放出を最適化し、細胞およびスライドからの背景蛍光を最小限に抑えるためにこの調整を行います。スタートを押します。1秒あたり5フレームの速度で20秒間画像を撮影します。20秒後、ストップを押します。メインメニューバーのファイルタブから画像を保存します。「Slide as」として保存を選択し、ファイル、保存場所、および名前を入力してください。次に、Image Jソフトウェアを使用します。画像を解析するには、マクロプラグインのmanual trackerを使用して、蛍光A IP one Pフォーカスの移動と速度を追跡します。時間間隔パラメータを0.2秒に変更します。add track選択を使用して、個々の蛍光タンパク質を選択し、4〜8フレームの連続したフレームにわたって追跡します。N trackコマンドを使用すると、各フレーム間のタンパク質の移動速度が結果ウィンドウに表示されます。Microsoft Excelスプレッドシートを使用して、各フレーム間の平均速度を算出してください。これらの値を用いて、AIP1P移動の平均速度を算出するか、または関心のある各細胞株についてAIP1P移動を定量化します。10個以上の細胞において、50個以上の蛍光AIP1Pフォーカスを追跡しました。野生型細胞におけるAIP1P移動の代表的な結果を、期待される通りに示します。R 2 56 H 変異体 Acton を発現している細胞では、蛍光標識された a IP one P は細胞内を素早く移動した後、消失します。野生型細胞と比較して、a IP one P の移動量は少なくなっています。a IP one P は Image J を用いて追跡され、タンパク質の移動が定量的にマッピングされます。野生型株ではA IP one Pが細胞全体にわたって分布していますが、移動は制限された領域内のみで行われます。変異acton株において、各蛍光A IP one P領域の平均速度を算出しました。野生型細胞におけるA IP one Pの移動の平均速度は1.60 ± 0.42 microns per secondでした。アクチン細胞骨格の形態異常を持つことが知られているR 2 56 H変異アクチンを発現する細胞では、変異株においてA IP one Pの表現型が変化していました。A IP one Pの運動は制限されており、緩慢です。A IP one Pの平均移動速度は0.88 ± 0.30 µm/sです。このビデオを視聴することで、TURF顕微鏡を用いて細胞骨格タンパク質をイメージングする方法について十分に理解できるはずです。本手順を実施する際は、細胞を乾燥させたり、光退色させたりしないよう注意することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ アクチン結合タンパク質Aip1pの動態を、R256H変異アクチンを発現する酵母で可視化する方法。全反射蛍光顕微鏡を用いて、変異アクチンが細胞骨格ダイナミクスに与える影響を解析する技術です。

Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

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