単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する
2014年6月30日
孤立した血液灌流肺準備が肺表面上の微小血管ネットワークを可視化することが実現可能になります。ここでは、リアルタイムの蛍光画像を用いて単離された肺における単一微小血管の透過性を定量化するためのアプローチを記載する。
この手順の全体的な目標は、蛍光ベースの方法を使用して、単離されたラット肺の単一微小血管の透過性を定量化することです。これは、最初にラットの肺を分離し、自家血液で灌流することによって達成されます。手順の2番目のステップは、左心房マイクロカテーテルを肺の小さな領域に挿入して、4つのタグ付きデキストリンを植物相に注入することです。
次に、タグ付きデキストリンを注入しながら、肺の微小血管の画像が収集されます。最後のステップは、ソフトウェアを使用して画像から単一の微小血管の透過性を定量化することです。最終的に、結果は、LPS治療後など、さまざまな条件下での肺微小血管の透過性の程度を示すことができます。
この手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるカバ・カサミ博士で、麻酔が確認された手術面で雄ラットに気管切開を行うことから始めます。PE 90気管カニューレを使用し、縫合糸で固定します。次に、21ゲージの蝶針を使用して、100〜200ユニットのヘパリンを心臓に注入します。
1分待ってから、血液を放血します。血液を採取し、生理食塩水で脇に置きます。長さ4センチメートルの3ミリメートルのタイゴンチューブで作られた2つのカニューレを充填し、一方の端をフレアします。
次に、開胸術を行います。カニューレが右心室に入るのに十分な大きさの切開を行い、1つのカニューレのフレア状の巣穴を肺動脈に向かってスライドさせます。カニューレを縫合糸で固定します。
同じ手法を使用して、もう一方のカニューレを左心室の頂点に左心房に向けて挿入します。2mm幅のアンビリカルテープで固定します。次に、障害となる結合組織を取り除き、カニューレと一緒に長と心臓を取り除きます。
肺の横隔膜表面を上向きにし、3つのカニューレをすべて整列させた状態で、それらをペトリ皿に移します。解剖した調製物を、入口および出口チューブとして機能する圧力トランスデューサに取り付けられたNo.18タイゴンチューブが取り付けられた調整可能なステージに移動します。次に、血液のコレクションを等量の5%アルブミン溶液と混合します。
この混合物をローディングリザーバーに加えます。ポンプを毎分14ミリリットルで始動します。チューブに気泡がないことを確認してください。
準備の様子。肺動脈を肺入口チューブに、左心房カニューレを出口チューブに取り付けます。チューブに空気が入っていないことを再確認し、シャントが開いていることも確認してください。
気管カニューレを3番目の圧力トランスデューサーに接続します。気管カニューレを介して30%の酸素で肺を膨らませます。肺を5センチの水圧に保ちます。
次に、シャントをクランプし、ポンプを毎分14ミリリットルで始動します。灌流中に肺灌流を開始するには、ポンプを調整して肺圧を約10センチメートルの水に維持し、左心房の圧力を3センチメートルの水に維持します。血液を注入した肺の準備から始めます。
まず、長さ40センチメートルのPE10チューブを30センチメートルの長さのPE90チューブに挿入して輸液カテーテルを構築します。PE 10チューブのもう一方の端を、1ccのシリンジに取り付けられた30ゲージの針に取り付けます。肺に取り付けられたチューブの端を製剤の上に持ってきて、輸液カテーテルをそれに取り付けます。
輸液カテーテルを左心房に導き、次に抵抗に達するまで肺に導きます。力を入れすぎると肺が損傷します。マイクロカテーテルによる肺への損傷はプロトコルの成功を低下させるため、マイクロカテーテルの適切な切開は重要です。
次に、シリンジにリンガーを充填し、ポンプに取り付けます。毎分10マイクロリットルの速度で溶液をゆっくりと注入します。注入部位は徐々に肺の他の部分に比べて青白くなり、注入部位を除いて、肺表面をプラスチックで急速に湿らせます。
次に、肺を視覚化するために、22ミリメートルのカバースリップにOリングを取り付けて表示ウィンドウを作成します。ストップコックグリースを使用して、Oリングを試験管ホルダーに固定します。次に、ウィンドウを注入部位の上に配置します。
カバースリップの上で20倍の対物レンズを振り、肺に焦点を合わせてセットアップを完了します。視覚的な歪みは予想されません。次に、選択した溶液を肺に注入します。
この例では、生理食塩水に続いて、1ミリリットルのZI結合デキストリンがシリンジポンプを介して60分間にわたって肺に注入されます。イメージングソフトウェアを使用して、1時間の注入で1分あたり1つの画像を記録し、その後のウォッシュアウトステップでさらに10分間記録を続けますフィッツデキストリンを注入した後、同じ流量で少なくともさらに10分間肺リンガー溶液を注入して洗い流します。あとで。取得した画像を分析するときは、フィット注入中の関心領域の最大蛍光強度をスコアリングします。
次に、10分間のウォッシュアウト後の残留蛍光の最大蛍光強度をスコアリングします。血管透過性の変化は、細菌性リポ多糖類による治療後に fitzy dextrin 注入を使用して調査されました。これは LI.Residual fit e 蛍光の広く使用されているモデルであるため、リンガーで処理された微小血管では低かったが、LPS で処理されたものでは高かった。さらに、リンゲル注入と比較して、LPS注入は透過性指数の有意な減少を引き起こし、画像フィールド内のすべての血管における透過性の世界的な増加を示唆しています。
さらに、リンゲル注入と比較して、LPS注入は透過性指数の有意な減少を引き起こし、画像フィールド内のすべての血管における透過性の世界的な増加を示唆しています。このビデオを見た後、孤立した鳥の肺を準備し、左尾マイクロカテーテルを挿入し、マイクロの透過性を定義する方法をよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、リアルタイム蛍光イメージングを用いて、単一のマイクロ血管の透過性を分離したラットの肺で定量化する方法を説明します。分離した血液灌流肺の準備により、肺表面上のマイクロ血管ネットワークの視覚化が可能になります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 血管生物学
- 蛍光イメージング
背景
- マイクロ血管の透過性を理解することは、肺機能の研究に不可欠です。
- 分離した肺の準備は、実験のための管理された環境を提供します。
- 蛍光イメージングは、マイクロ血管のダイナミクスのリアルタイム観察を可能にします。
- 以前の研究は、様々な処置が血管透過性に与える影響を示しています。
研究目的
- 分離したラットの肺の単一マイクロ血管の透過性を定量化する。
- 正確な測定のために蛍光ベースの方法を利用する。
- LPS処置などの条件がマイクロ血管の透過性に与える影響を評価する。
使用された方法
- ラットの肺の分離と自己血液による灌流。
- 肺への左心房マイクロカテーテルの挿入。
- マイクロ血管へのフローレスセイン標識デクストリンの注入。
- 分析のために注入過程中の画像の収集。
主な結果
- 単一のマイクロ血管の透過性の定量化が達成されました。
- 結果は、異なる実験条件下での透過性の度合いを示しました。
- 蛍光イメージングは、マイクロ血管ネットワークの明確な視覚化を提供しました。
- データは、肺のマイクロ血管に対する処置の影響についてさらなる調査を支持しています。
結論
- この方法は、分離した肺でのマイクロ血管の透過性を効果的に定量化します。
- リアルタイムイメージングは、血管研究のための貴重なツールです。
- 結果は、様々な刺激に対する肺血管反応の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct quantification of permeability changes in individual pulmonary microvessels under inflammatory conditions, providing mechanistic insight into vascular leak pathways. By combining isolated lung perfusion with real-time fluorescence imaging, it supports target validation in pulmonary inflammation models and facilitates preclinical assessment of barrier-protective candidates. The approach reduces reliance on endpoint tissue processing, accelerating data acquisition for go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures real-time fluid leak across venular and capillary segments to interrogate therapeutic hypotheses in vascular inflammation.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of permeability responses across vascular beds within the same lung preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity readouts to assess compound effects on microvessel permeability.
- Operational Value: Standardizes perfusion and imaging conditions for reproducible, high-content vascular screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links LPS-induced permeability changes to disease-relevant mechanisms of acute lung injury.
- Operational Value: Supports dose-response modeling and pharmacokinetic-pharmacodynamic correlation in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical efficacy testing, particularly for pulmonary vascular modulators.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying vascular barrier function in response to inflammatory stimuli.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable outputs for evaluating compound effects on single-vessel permeability.
- Analytics: Provides permeability index calculations from time-lapse imaging to enable comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects microvascular responses to preclinical models of lung injury via LPS challenge.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular permeability across multiple compound classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular leak pathways through direct, single-vessel resolution.
- Operational Value: Standardizes microcatheter infusion and imaging protocols for cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative vascular safety signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on pulmonary vascular effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, vascular cannulation, and fluorescence microscopy.
- Depends on pressure-regulated perfusion systems and intravital imaging infrastructure.
- Necessitates standardization of infusion rates, fluorophore concentrations, and washout protocols across teams.
- Adaptation to other species or disease models may require validation of perfusion parameters and vascular accessibility.
- Practical limitations include technical complexity of microcatheter placement and potential lung trauma from cannulation.
