Name: ダイナミックカルシウムの自動分析 2 +の信号 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶ自動ROI解析による豚冠動脈内皮細胞カルシウム活動の解析法。手動解析より迅速かつ包括的で、ユーザーバイアスを低減し、生理学的Ca2+信号の信頼性を向上させる技術を習得できます。

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この作品は、健康補助金HL-085887、HL-092992、S10RR027535、及びMOP-93676の国立研究所によって部分的にサポートされていました。

1。血管解剖とイメージング<ol><li>マルテンスら 27に記載されているように、国内の幼若豚から収穫組織。ポリジメチルシロキサン（PDMS）、HEPESは、生理食塩水（PSS）にバッファリングを含む底の解剖皿に採取したブタの右心室に配置します。 <ol><li>実体顕微鏡を用いて、周囲の心臓組織層から血管セグメントを除去することによって、鉗子とスプリングはさみを使用して周囲の組織から冠状動脈（〜8mmの長さ、直径0.5mm）を左前のセグメントを分析し、取り除く。注：血管壁に穴を開けないように注意してください。 </li><li>解剖皿に、PDMSブロック（1×0.5×0.5 cm）の配置し、底にそれを固定するために、針を使用しています。 micropinsを形成し、12〜0.3センチメートル長のセグメントに約40μmの直径のタングステン線をカットし、皿にそれらを配置します。鉗子を用いて、micropi有するブロックに血管セグメントの一端を固定するN。 </li><li>慎重に血管内腔に小さな春のはさみを挿入し、それを完全に開くように、容器の1面下に縦方向に切断。内皮を上にして開いた血管部分を向けます。 </li><li>容器は平坦な長方形を形成するようにブロックするために開かれた血管セグメントの境界を固定するために、残りのmicropinsを使用する。注：マイクロピントップは90°に屈曲し、ブロック表面と同じ高さまで挿入する必要があります。ケアは過延伸することなく、容器の準備を伸ばすように注意する必要があります。最終的な幅が始まる未延伸幅1.5倍〜でなければなりません。 </li><li> 134のNaCl、6塩化カリウム：HEPES中ロニック（0.03％）でDMSOに溶解したFluo-4 AM（10μM）を混合したFluo-4 AMローディング少量の溶液（〜1ミリリットル）を調製mMのInを含むPSSが（バッファー、1塩化マグネシウム、10 HEPES、10グルコース）、暗所で室温で約40分間のローディング溶液中にブロック全体を挿入します。 </li><li>充填後、HEPES緩衝内のブロックを洗う5〜10分間PSS。 </li><li> HEPESを含むカバーガラス下部チャンバーに50〜100ミクロンの厚さのスペーサーの上にブロックをマウントするには、PSSにバッファリングされた。 NOTE：金属ピンがスペーサとして使用され、血管セグメントが下向きとスペーサに触れていないことを確認することができる。 </li><li>共焦点イメージングのために備えた倒立顕微鏡のステージ上のチャンバを配置し、内皮​​細胞層に焦点を当てています。 </li><li> 20X倍率共焦点画像シーケンスの初期同期ソフトウェアを使用して毎秒約8フレームのフレームレートで約3分間、基底相対蛍光のタイムラプス画像シーケンスをキャプチャする。 </li><li>基底蛍光を記録〜3分後、交換しHEPESをHEPESに溶解したサブスタンスP（pMの100）の同じ体積（〜1ml）でPSS溶液を緩衝PSSを緩衝し、addtionalの3分間の記録。 </li></ol></li></ol> 2。自動化された分析<ol><li> 8ビット、gと共焦点入手ソフトウェアからの蛍光カルシウム活性の画像シーケンス（単数または複数）をレンダリングするなしスケール情報とrayscale &#39;。TIF」形式のファイル。 </li><li>オープンImageJのは、[ファイル]メニューの「開く」をクリックし、ImageJの画像シーケンス（複数可）を表示するエクスプローラウィンドウで適切な画像シーケンスを選択します。 </li><li>画像シーケンス（S）内の活動の空間的な広がりの上下の境界を推定するために、長方形のROIツールを使用して、適切なROIの直径を決定します。注：平均長方形の直径は、ROIの直径はぴったりの選択です。 </li><li>コンピュータのハードドライブに新しいフォルダを作成し、フォルダのディレクトリ内に画像シーケンス（複数可）を追加します。 </li><li> ImageJのでは、分析を開始するには、 &#39;LC_Pro」をクリックし、「プラグイン」ウィンドウをクリックします。 </li><li> ROIの直径値を入力し、フィルタ閾値（0.05または0.01のいずれか）を選択します。 </li><li> 「薬物治療」チェックボックスをクリックし、すぐに前と後に、薬剤を添加した時間（秒単位）のポイント値を入力します。 </li><li> 「OK」をクリックし、ファイルエクスプローラウィンドウに画像シーケンスのディレクトリを入力します。 </li></ol> 3。グラフィカル出力<ol><li>からRバージョン3.0.2をダウンロードしてください<a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> 。 </li><li> Rの32ビットバージョンを開く</li><li> 「ファイル」は、「開いているスクリプト」をクリックして、グラフィカルな実験​​的なレポートを生成するための「traceplot.R &#39;のRスクリプトを選択します。 </li><li> 「パッケージ」を選択することで、キャリブレーション、およびgplotsパッケージをインストール、「パッケージをインストール」、およびappropirateパッケージを選択する。 </li><li> &#39;fil​​e&#39;をクリックして、「ディレクトリ変更」コマンド、およびLC_Pro分析出力に対応するディレクトリを選択するようにエクスプローラウィンドウを使用します。 </li><li>スクリプトウィンドウをクリックし、「すべてを実行 &#39;スクリプトを実行するコマンド。 </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
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<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

細胞および多細胞レベルでの複雑なCa 2 +の信号を復号化することは、厳密な実験·分析的アプローチが必要になります。ここで、アプローチのCa 2 +依存性蛍光の解決共焦点画像シーケンスが提示される特定の場合には、無傷の細胞のフィールド内に統計的に関連のCa 2 +シグナルを識別し、定量化する自動化された分析に供された時間に記載されている、動脈セグメントを単離した豚の心臓から、ピンは、共焦点イメージングを受けたCa 2 +指示薬のFluo-4 AM、を搭載し、内皮を露出するように開いて、カスタムアルゴリズムLC_Proで評価。このアルゴリズムは、1に設計されている）を検出および動的のCa 2 +のトラック部位は統計的に（p &lt;0.01）ノイズの上方に変更し、2）自動的に活性部位の中心に関心領域（ROI）を定義し、3）のROIにおける平均蛍光強度を分析する特定のイベントパラメータを決定する。アプローチ大幅オフライン解析時間を短縮する、ユーザエラーとバイアスを低減し、代表的なプロファイルまたはパターンを識別するためのフィールドを...

Ca 2 +のは、分子および細胞質のCa 2 +レベルを高度に制御されているシグナルユビキタスセカンドメッセンジャーである。細胞内Ca 2 +シグナルは複雑であり、孤立トランジェント、振動、および伝搬波1は、 - 4。のCa 2 +の空間的および時間的制御は、生理学的シグナルの特異性の根底にあると考えられ、そのためのCa 2 +信号パターンの分析は、複数のフィールド5内の研究者にかなりの関心がある。さこのようなのFluo-4およびフラ-2としてのCa 2 +インジケーター色素は、一般に、蛍光顕微鏡5-12で細胞内Ca 2 +シグナルを測定するために使用される。 16 -一般的に、時間的なCa 2 +の信号は、時間依存ユーザ定義領域内の平均蛍光の変化、または関心領域（ROI）5,6,13として評価されます。現在、手動のROI分析は、時間と労力の両方である19 -それは多くのROIを特定し、反復計算を17を実行するために、ユーザーが必要なため、緊張を引き起こす。これらの技術は、人工信号モードと低振幅またはびまん性信号18,20の除外の導入など、かなりのユーザーエラーを受ける可能性がある。 自動 ROI検出アルゴリズムは、以前に最適なROIの配置を決定するための統計的アプローチの様々な方法を用いて実現されているが、それらは一般にライン走査または時間17に単一の空間次元に分析を制限する擬似ラインスキャン画像の分析に限られていた19から22。さらに、多くの既存のアルゴリズムは、Ca、定期的、局所的な過渡からの伝搬波23,24の範囲2 +放出事象の多様性を包含するのに十分ではありません。生理的なCa 2 +の信号の総合評価は、多くの場合、さらに重要な画像ARTIFの存在によって複雑になる多くの実験系でのノイズの判別に信号を混乱させる行為。 以前は、カルシウム2への自動ROI検出アルゴリズム溶液は+トランジェント検出を知らせる、NIH ImageJソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、MD）用のプラグインとして実装され、開発され、25,26を検証した。 LC_Proと呼ばれるこのアルゴリズムは、二次元のタイムラプス画像シーケンス内のCa 2 +シグナルトランジェントを取り囲む関心領域を識別し、分析するために設計した。ここでは実際的な実験プロトコルおよびブタ冠動脈内皮におけるアルゴリズムの適用を代表するデモンストレーションが使えるグラフィカルな出力を生成するために、オープンソースの統計処理ソフトウェアRを使用して、追加の後処理で、提供されています。

<table><tbody><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Fisher Sci</td> <td>#NC9644388</td><td>エラストマーキットは、皿に成形する必要があります</td></tr><tr><td>HEPES緩衝PSS</td><td>Sigma</td> <td>#H3375-250G</td><td>HEPES酸</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン研究所</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>科学研究所 Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>ライフテック</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>金属ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラスボトムチャンバー</td><td></td><td></td><td>カスタム設計</td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>パーキンエルマー</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">ダウンロード先:http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</A></td></tr><tr><td>imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">ダウンロード先:http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td>LC_Pro</tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">ダウンロード先: http://www.r-project.org/</a ></td></tr><tr><td>R traceplot スクリプト</td><td></td><td></td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">ダウンロード先: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a ></td></tr></tbody></table>

ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

細胞内Ca 2 +シグナルは、一般に蛍光性Ca 2 +指示薬色素および顕微鏡技術を用いて研究されている。ただし、のCa 2 +イメージングデータの定量分析は、時間がかかり、バイアスを受ける。関心領域（ROI）検出に基づく自動化された信号解析アルゴリズムは、一次元ライン走査測定のために実装されているが、二次元画像シーケンスにおけるROIの最適化された同定および解析を統合しない現在のアルゴリズムは存在しない。ここで、画像シーケンスにおけるROIの迅速な取得および分析するためのアルゴリズムが記載されている。これは、楕円が最適ROIの配置を決定するために、ノイズのフィルタリングされた信号に嵌合利用し、振幅、持続時間及び空間の広がりのCa 2 +信号パラメータを計算する。このアルゴリズムは、ImageJの（NIH）ソフトウェアの自由に利用できるプラグインとして実装されました。一緒に、オープンソースの統計処理ソフトウェアRのために書かれた解析スクリプトと、このアプローチは、実験的な出力の迅速な統計分析を行うための大容量のパイプラインを提供する。著者らは、この分析のプロトコルの使用は、生理的なCa 2 +のシグナリングのより完全で公平な特性評価につながることを示唆している。

カスタムアルゴリズム、LC_Proは、Ca 2 +の共焦点画像シーケンスダイナミクスの自動分析を実行するために開発され、実施された。 図1に示されるように、アルゴリズムは動的のCa 2 +のA）を検出し、追跡する部位が、統計的に（p &lt;0.01）ノイズの上方に変更逐次処理モジュールを利用し、B）が自動的に活性部位の中心に関心領域（ROI）を定義し、 C）特定のイベントパラメータを決定するためのROIにおける平均蛍光強度を算出する。アルゴリズムのグラフィカルな概要は、既知の強度及び位置のガウスパルス（ 図2）を生成したコンピュータを用いて示されている。信号パルス（ 図2AおよびB）は標準正規分布のためのZスコアを使用してバイナリに変換し、ベストフィットの楕円は、信号閾値を超えるピクセル座（ 図2C）に割り当てた。楕円のソートアルゴリズムはdetermiに使用されたNE最適なROIの配置（ 図2D）。</st...

ここでは2次元のタイムラプス画像シーケンス内で正の信号の領域に割り当てられたベストフィット楕円を分類に基づいて、関心の分析プロトコルの新規領域が示されている。このアルゴリズムは、包括的に、最小限のユーザ入力及びバイアスが生理のCa 2 +シグナルを分析するために研究者を可能にすることができる。

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

本実験の全体的な目的は、自動ROI解析を用いてブタ冠動脈における内皮細胞のカルシウム活性を解析することです。これは、第2ステップとしてブタ冠動脈を解剖・開口し、内皮細胞のカルシウム活性を測定することで達成されます。得られたカルシウム測定値に対して自動ROI解析を行い、カルシウム活性の要約出力を算出します。次に、カルシウム活性分析の結果を統計的に解析し、グラフで描画するためにソフトウェアスクリプトを実行します。これにより、自動ROI解析と統計処理に基づいたカルシウムシグナルのトランジェントパラメータが得られます。手動のROI解析などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、自動解析の方が迅速で包括的であり、ユーザーによるエラーが起こりにくいことです。この手順では、採取したブタの右心室を、ヘップス緩衝生理食塩水が入ったA-P-D-M-S底面解剖皿に入れます。実体顕微鏡下で、左前下降冠動脈の一節を周囲の心臓組織層から剥離して取り出します。この際、血管壁に穴を開けないよう注意してください。次に、解剖皿にPDMSブロックを配置し、針を用いて底面に固定します。ディッシュにバッファーを加えます。次に、直径約40 micronのタングステン線を0.3 centimeterの長さのセグメントに12本カットしてマイクロピンを作成し、それらをディッシュに入れます。ピンセットを使用して、血管セグメントの一端をマイクロピンでブロックに固定します。小型のスプリング剪刀を血管腔に慎重に挿入し、血管を完全に開くために血管の一側を縦方向に切断します。その後、開いた血管セグメントの内皮側を上にして配置します。残りのマイクロピンを使用して、開いた血管セグメントの端をブロックに固定し、血管が平坦な長方形になるようにします。次に、1 mLのFluo-4 AMローディング溶液を調製します。ローディング後、ブロック全体を室温・暗所にて約40分間ローディング溶液に浸します。その後、HEPES緩衝PBSで5〜10分間ブロックを洗浄します。続いて、HEPES緩衝PBSを含むカバーガラス底チャンバー内で、50〜100 µm厚のスペーサー上にブロックをマウントします。共焦点イメージング用に整備された倒立顕微鏡のステージにチャンバーを設置し、共焦点画像シーケンス取得ソフトウェアを用いて内皮細胞層に焦点を合わせ、倍率20倍、フレームレート毎秒8フレームで、基底相対蛍光のタイムラプス画像シーケンスを3分間キャプチャします。基底蛍光を3分間記録した後、HEPES緩衝PSS溶液を、HEPES緩衝PSSに溶解した100 pMのサブスタンスPと同量に置換し、さらに3分間記録します。この手順において、共焦点取得ソフトウェアから蛍光カルシウム活性の画像シーケンスを、スケール情報なしの8ビットグレースケールTIFF形式ファイルとして書き出します。次にImageJを開きます。ファイルメニューの「Open」をクリックし、エクスプローラーウィンドウから適切な画像シーケンスを選択します。ImageJで画像シーケンスを確認し、矩形ROIツールを用いて画像シーケンス内の活性の空間的な広がりの上下境界を推定し、適切なROIを決定します。次に、コンピュータのハードドライブに新しいフォルダを作成し、そのフォルダディレクトリに画像シーケンスを追加します。Image Jで、「plugins」ウィンドウをクリックします。次に、「lc pro」をクリックします。解析を開始するには、ROIの直径値を入力し、その後でフィルターの閾値を設定して選択してください。薬物処理のチェックボックスをクリックし、薬物添加直前と直後のタイムポイント値を入力します。次に、「OK」をクリックし、ファイルエクスプローラーウィンドウで画像シーケンスディレクトリを入力します。このステップで、R version 3.0 0.2をダウンロードしてインストールしてください。次に、32ビット版のRを開きます。［ファイル］をクリックし、［スクリプトを開く］を選択して、グラフィカルな実験レポートを作成するためのtrace plot RRスクリプトを選択してください。［パッケージ］を選択し、calibrateおよびgplsパッケージをインストールします。パッケージをインストールし、その後、適切なパッケージを選択します。［ファイル］をクリックし、［ディレクトリ変更］コマンドを選択して、エクスプローラーウィンドウからlc pro解析出力に対応するディレクトリを選択します。次に、スクリプトウィンドウをクリックし、［すべて実行］コマンドをクリックして、ここでスクリプトを実行します。基底サンプリング間隔に続き、サブスタンスP刺激サンプリング間隔を入力画像シーケンスとしたタイムラプス画像がグレースケールのタイムラプス画像シーケンスで示されています。基底間隔および刺激間隔における最適リシスはlc Proによってレンダリングされ、自動的に配置された各ROIからの時間依存的なスケーリング済み強度曲線がここに示されています。代表的な実験における、コントロールおよびサブスタンスP刺激イベントの両方のピーク振幅、半値幅、および最大空間広がりのヒストグラムが、Rを用いてlc Proからの出力をグラフィカルに処理することでレンダリングされました。特筆すべき点として、substance Pによる刺激はイベント数を増加させ、Mann-Whitney U検定により、中央値の振幅および持続時間に有意な右方シフトを引き起こしました。この手順を行う際は、焦点面の移動や不適切なコントラスト設定による画像アーチファクトを最小限に抑えることが重要です。これらは解析結果に大きな影響を及ぼす可能性があるためです。

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

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生物学

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

心筋細胞では、管状の膜構造は、細胞内のネットワークを形成している。私たちは、品質管理、最先端の蛍光顕微鏡用ii）の生細胞染色を含むマウスの心臓から心筋細胞のi）の単離のためのプロトコルを最適化について説明し、およびiii）直接画像解析は、コンポーネントの複雑さおよび細胞内膜の可塑性を定量化するネットワーク。...

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。...

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

彼らは生きた細胞から分泌される、単一ラベルのない蛋白質のリアルタイム光検出のためのプロトコルを提案します。これは干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡は、様々...

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca2 +イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca2 +シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca2...

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

このプロトコルは、麻酔薬を使用したマウスの近くの血管から脳を包み込む周囲細胞からの蛍光カルシウム画像と血流データを取得して分析するステップを提示する。これらの技術は、壁画細胞生理学の研究に有用であり、任意の細胞型のカルシウム過渡症を調査するために適応することができる。...

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

TrackMate カルシウムイメージング分析(TACI)は、z軸の動きを調べ、各zスタックの最大値を特定して、対応する時点での細胞の強度を表す、3Dカルシウムイメージング分析用のオープンソースのImageJプラグインです。横方向(x / y)方向に重なり合うが、異なるz平面上にあるニューロンを分離できます。...

TACI: 3D カルシウムイメージング解析のための ImageJ プラグイン

このプロトコルでは、生理学的管腔内圧で肺内静脈(小肺静脈またはPV)のCa2+ シグナルを記録および分析するための新しい技術を紹介します。この手法には、小さなPVの単離、Ca2+ インジケーターによるインキュベート、カニューレ挿入と加圧、Ca2+...

生理学的管腔内圧下での小さな肺静脈におけるCa2+ シグナルのイメージング

このレポートでは、我々は慢性実験で電極やマイクロダイアリシスプローブの取付ベース用光硬化性歯科用樹脂の新しいアプリケーションを提案する。この材料は、頭蓋骨に直接接合することができます。...

慢性実験における実装電極やマイクロダイアリシスプローブ用光重合型歯科用接着性レジンの応用

学ぶ自動ROI解析による豚冠動脈内皮細胞カルシウム活動の解析法。手動解析より迅速かつ包括的で、ユーザーバイアスを低減し、生理学的Ca2+信号の信頼性を向上させる技術を習得できます。

ダイナミックカルシウムの自動分析

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