Name: ラット網膜へのエルバックス40Wを通じて徐放性ドラッグデリバリー：慢性症状の治療のための含意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶエルバックス40Wを用いたラット網膜への徐放性ドラッグデリバリー法。薬剤-樹脂複合体の作製と眼内挿入により、慢性眼疾患治療への応用可能性を示す。電気網膜図で有効性を確認できる。

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この研究は、オーストラリア研究評議会の支援を受けて、ARC視覚科学センターオブエクセレンス（CE0561903)、国立保健医療研究評議会（1049990、Progetto regionale speciale multiasse 'Reti per l'Alta Formazione' - PO FSE Abruzzo 2007-2013 - Azione 4.II.iii.

行ったすべての実験は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従った、とラクイラの動物倫理委員会の大学とオーストラリア国立大学動物実験倫理委員会の承認を得て。成体ラット（P100-200）は、この研究を通して使用した。 1共重合樹脂ペレットを作成<ol><li>通風室の小さなガラスビーカーに20エルバックス40Wペレットを配置します。 </li><li>全てのペレットをカバーするために確保し、100％エタノールでビーカーを埋める。 </li><li>パラフィルムでビーカーを覆い、及び7〜10日間室温で100％エタノールでペレットを浸す。注：これ以降のステップから、樹脂を処理するか、保存するために、金属やプラスチックを使用しないでください。 </li></ol> 2のロードのための医薬品の溶液を調製<ol><li> 0.1％ジメチルスルホキシド（DMSO）で選択される薬物を溶解する。ボリューム内の40μlに薬液を構成している。単回投与で与えられる薬物の3倍の濃度で樹脂をロードします。 </li></ol> 3。薬剤 - 樹脂複合体を準備し、ロード<ol><li>別の小さなガラスビーカーに20洗浄したペレットを転送します。約45分間、4ミリリットルのジクロロメタン中のペレットを溶解する。ペレットが溶解している間パラフィルムでビーカーをカバー。 </li><li> 0.001 mg / mlの濃度に0.1％DMSOに溶解してファストグリーンFCFの溶液を調製する。 </li><li> 1ピペットを取り、以前の準備の薬剤溶液40μlを策定。ファストグリーン溶液40μlを持つ別のピペットをロードします。 </li><li>ビーカーに同時に2つのソリューションを追加します。グリーン色素が均一に混合全体に分散されるまで攪拌棒ガラスを用いて急速に混合する。 </li><li>速やか樹脂を凍結する高速に10分間ドライアイスの上にビーカーを転送します。 </li><li>溶媒を蒸発させるために &quot;蒸発室」を設置。埋める硫酸カルシウム小石と三分の一に大きなコンテナをバックアップします。小石でよくを作成し、慎重に小石をチャンバー内にビーカーを安定させるために、ビーカーの半分まで到達するようにウェル内にビーカーを置く。 </li><li>パラフィルムを有するより大きな外側のコンテナをカバー。 </li><li>冷凍庫に蒸発チャンバーを転送します。 2〜3週間、-20℃で保管してください。 </li></ol> 4。外科的移植のための薬剤 - 樹脂複合体を準備します<ol><li>冷凍庫から蒸発室を削除します。ガラス皿に固体薬剤 - 樹脂ブロックの転送​​を氷上に保持。 </li><li>顕微鏡やルーペの助けを借りて、トレパンやパンチツールを使用して、ブロックから直径約0.05ミリメートル、長さが0.1ミリメートルの部分をカット。 </li><li>凍結防止の材料（ 例えば 、アルミ箔）のブロックの残りの部分をラップし、必要になるまで-20℃で保管してください。 </li></ol> 5。外科的インプラントのラットの目への薬物 - 樹脂複合体</P&gt; <ol><li>手術のために動物を準備します。ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（12 mg / kg体重）の腹腔内注射を用いて麻酔する。完全な麻酔が達成されるまで、動物を観察します。注：動物は（呼吸を除く）運動の喪失、および角膜とつま先ピンチ反射の損失を持っている必要があります。 </li><li>手術台に完全に麻酔をかけた動物を転送します。 （ 例えば 、硫酸アトロピン）mydriaticumを使用し、局所麻酔薬（ 例えば 、塩酸テトラカイン）手術を受け、眼（複数）に低下します。手術中に湿った角膜を維持するために人工涙液を適用します。手術全体の使い捨て注射針および滅菌器具を使用してください。 </li><li>瞳孔が完全に拡張された後に鈍い湾曲したピンセットで目を安定させます。 25 Gの針を用いて縁から硝子体、約2mmに到達するために、完全な深刺し傷を作るために手術用顕微鏡を使用してください。 </li><li> tは準備された部分を挿入します穿刺部位に浸透することができます罰金、先のとがった鉗子（ 例えば 、ピンセット）のペアを使用して刺し傷への彼の薬物-樹脂複合体。 </li><li>細菌感染の予防としては、動物が回復している間に角膜の乾燥を防ぐだけでなく、炎症を防ぐために、目に抗生物質軟膏を適用します。 </li><li>完全に回復するまで動物を観察します。それは意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返さないでください。動物がストレスや不快感の兆候を示した場合、鎮痛薬は承認された倫理プロトコルに従って使用してください。 </li><li>組織の収集と分析のための通常の実験手順に従ってください。 </li><li>実験の終了時に、ペントバルビタール（60 mg / kg体重）を2％リドカイン塩酸塩溶液の腹腔内注射で動物を安楽死させる。 </li></ol>注：リグノカイン塩酸分地元の不快感をimizes。

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</ol>

著者らは、開示することは何もない。

本稿では、網膜への薬物の徐放性送達のための薬剤 - 樹脂複合体の使用を実証した。私たちは、比較的安価で小型の動物モデルにおいて適用が容易である方法を提供することを目的とした。 APBの機能は、グルタミン酸類似体として作用することを考えると、眼における網膜の応答をブロックする。結果は、APBは、1週間の着床後による網膜応答の閉塞を引き起こしたことを示している。これはAPBが正常硝子体および網膜に放出されたことを示し、その効果は、眼に限定されたことを薬剤 - 樹脂複合体に注入されたこと。薬の完全な効果は、移植（ 図1B）の後に明らかな一週間となりました。 図1（a）は 、移植後1日目に、b波の有意な減少が移植眼の中の10 6φ強度でのみ存在していたことを示しています。これは、この初期の時点でそれを示すことができる応答コーン経路、 &#160;より高い光強度に、影響を受けた。樹脂は網膜にAPBを提供できる時間の長さを決定するために、更なる時間点を調査する必要があります。それは0-7日...

これらの疾患は、一般に、長期間の治療を必要とする糖尿病や高血圧などの慢性疾患の治療は、しばしば人生のために、多くの課題を提示する。これは、頻繁な投薬の必要性を減らす徐放性薬物送達システムの開発を求めている。これらの徐放方法の有効性は、糖尿病を治療するために必要なインスリン注射の数を減らすために、インスリンポンプの開発により実証されている。眼の慢性疾患、その内部層に影響を与え、特にものは、侵襲的な手続きを経て、薬物の頻繁な投与を必要とします。人間の目に影響を与える一つのこのような慢性疾患は、加齢黄斑変性症（AMD）です。それは、ビジョンを開始する責任眼球の奥に位置する神経組織の層である中心網膜に影響します。 AMDは、西側世界1における失明の主な原因である。再処理すると、特定の課題tinal疾患、薬物は、しばしば送達の侵襲的方法を必要とする眼、この深い層に到達するために必要とされることである。薬剤は通常、硝子体内注射を使用して、硝子体チャンバーと網膜に投与される。しかし、各注射で眼内炎、網膜剥離、白内障及び硝子体出血2後噴射を含む合併症の危険性がある。このリスクは、薬物のすべての再注入と乗算される。 複数回の注射の必要性を減少させることは、AMDの治療において大きな利点であろう。新しい血管の成長が特徴であり、AMDの湿潤型を治療するために、確立された治療戦略は、VEGF阻害剤3を使用して内皮増殖因子（VEGF）を標的とすることである。現在、これらを繰り返し、硝子体内注射を介して配信されます。同様に、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症の一般的な合併症の治療において、コルチコステロイドは、反復注射を介して配信されている<s&gt; 4アップ。徐放方法を介してこれらの薬物の送達は、実際に後噴射の合併症のリスクを減らすことができる。 徐放性薬物送達システムの概念は、最初の動物組織5中に小分子を送達するためにシリコーンゴム車両を用いて説明した。それ以来、他の徐放方法は、眼において試験されたいくつかのそれらのより大きな分子を送達するために開発されている。そのような生分解性ミクロスフェア、ポリ-ラクチド-コ-グリコリド（PLGA）ナノ粒子およびリン脂質小胞（リポソーム）などの粒子担体は、送達ビヒクル6,7として有用であり得る。 PLGAナノ粒子およびリポソームは、時間7を介して強膜を横切って抗がん剤を送達するそれらの能力についてインビトロ環境で比較した。どちらの車がゆっくりと薬剤を放出するのに有効であった。しかし、研究は唯一のin vitro環境で行われた。 Bochot ら （2002）8は、試験しリポソームの有効性は、 インビボで網膜に分子を送達する。彼らは、リポソームが正常ウサギの網膜に小さなオリゴヌクレオチドを​​提供することを明らかにした。著者らは、リポソームは、網膜疾患8の処置に有益であり得ることを示唆した。しかし、硝子体中に浮遊するためにこれらの小胞の性質は、彼らが可能性が高いにじみやビジョン9を損なうことを意味します。 岡部ら （2003）、10はウサギにおいてβ-メタゾンを適用するために33％のエチレン-酢酸ビニルからなる非生分解性ポリマーディスクを使用する。彼らは、強膜ポケットにディスクを移植し、1ヶ月まで10硝子体および網膜への薬物の効果的な放出を示した。しかし、この特定のプロトコルでは、インプラントは、比較的大きな剛性であり、大規模な強膜切開や縫合など、より複雑な外科手術を必要とした。 以前の研究では、TISSUを調査電子のウサギの眼の角膜にそれらを注入することにより、さまざまなポリマーの車両への応答、およびアルコール中で洗浄したエチレン - 酢酸ビニル共重合体は、炎症または刺激を引き起こさないことを見出した。これらの複合体は、いくつかの薬剤11に依存して100日までの超過、長期間動物組織へのより大きな化合物の送達を持続することが示された。共重合体樹脂のような一タイプはエルバックス40Wの形で工業的に開発された（ &#39;W&#39;アミド添加剤の重量のエチレン - ビニルアセテートコモノマー含量40重量％、ペレットの取り扱いを改善する）。この共重合体樹脂は室温と体温の両方で安定な不活性物質である。これは、生体組織におけるアレルギーまたは毒性を引き起こすことが示されていない。この樹脂は、効果的にそのような乳管システム12、一次聴覚野13,14 &lt;などのさまざまなシステムの機能を調査する別の実験モデルにおいて、薬の多種多様を提供してきました/ SUP&gt;、そしてカエルの視覚システム15。この樹脂はまた亀16,17、ニワトリ胚18,19の開発に薬物を送達するために眼に使用されており、大人のフェレットは20を網膜。ラット中枢神経系において、樹脂のみ脳21-23で使用されているが、ラットの眼におけるその使用が報告されていない。 他の方法よりもゆっくりと網膜に薬物を送達するために、この共重合体樹脂を使用する利点は、それが目に炎症または刺激を引き起こさず、安定な化合物であることである。それは、通常、代わりに硝子体中に浮遊の送達部位に留まるように、粒子担体とは異なり、薬剤 - 樹脂複合体は、移植後に視力を損なわない。それだけで、目の角膜輪部に近い硝子体腔に簡単な注入工程を必要とし、移植後の縫合を必要としない。近年、など、いくつかの新規な送達システムの出現があったカプセル化細胞技術（ECT）24,25、26、およびマイクロフィルム27をヒドロゲル。しかしながら、薬剤 - 樹脂複合体を製造し、送達するための現在の研究で使用される方法は、それによって基本的な研究環境で使用するための、より有利で、追従しやすく、安価でもある。長期の薬物治療を送達するためにこの複合体を使用することの課題は、より少ない硝子体内注射を持つことの治療上の利益を最大化する薬剤の最適濃度を決定することである。 本稿では、成体ラット網膜の長期治療の​​ための薬剤 - 樹脂複合体の使用を実証することを目的とする。この送達様式の有効性は、薬物としてのグルタミン酸類似体2 - アミノ-4 - ホスホノ（APB）を用いて試験する。 APBブロック網膜28にグルタミン酸、内因性神経伝達物質を模倣することによって、ON双極細胞の光応答。 APBは、その受容体のためのグルタミン酸と競合する、それブロックガーゼT応答。 APBは、網膜機能を制御し、そのような電図（ERG）のような電気生理学的方法を使用してその効果を測定するために生理学的研究に使用されている。以前の研究では、APBは、短期29と現像網膜の長期治療の両方に使用されている;後者は、30日間30毎日、眼内注射を介して、単回投与を与えることに関与。前作28,29,31で示唆されているように、APBと同じ量（50μMの濃度で滅菌生理食塩水中の0.092 mgを、）すべての注射のために使用した。私たちは、眼内に薬物を送達するために徐放車両等の薬剤 - 樹脂複合体をテストするために、APBを選びました。この研究で概説された方法は、16,32、複雑な薬-樹脂の製造に関わる前述の方法と似ています。しかし、私たちにもディテール特に成体ラットの眼での使用。眼内へのAPB-ロードされた樹脂の外科的移植の後、ERGは、APBをrを廃止かどうかを確立するために実施したetinal光応答は、従って、APBが正常硝子体および網膜中に放出されたかどうか。

<table><tbody><tr><td>Elvax 40W Pellets</td><td>Du Pont, DE, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td> 2-amino-4-phosphonobutyric <td></td><td></td></tr><tr><td>acid (APB)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, US</td><td>A1910</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drierite, calcium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA</td><td>238910</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine, Ilium Ketamil</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine, Ilium Xylazil-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アトロピン硫酸塩, Minims点眼薬</td><td>Bausch&Lomb Pty. Ltd.、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、テトラカイン塩酸塩、Minims点眼薬</td><td>、Bausch&Lomb Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール, Chlorsig 軟膏</td><td>Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール, Lethabarb</td><td>Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リドカイン塩酸塩, Ilium Lignocaine-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, オーストラリア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uni-Core Punch Tool</td><td>World PrecisionInstruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術顕微鏡, Zeiss OPMI 99</td><td>Zeiss, West Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G インスリン針</td><td>テルモ株式会社, 東京, 日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモンピンセット</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラット網膜へのエルバックス40wを通じて徐放性ドラッグデリバリー：慢性症状の治療のための含意

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

網膜は、眼内の深い位置するように網膜の疾患は治療が困難である。薬物送達の侵襲的方法は、多くの場合、これらの疾患を治療するために必要とされる。そのような網膜浮腫や新生血管などの慢性網膜疾患は、通常、効果的に症状を治療するために、複数の眼内注射を必要とします。しかし、これらの注入に関連したリスクは、薬物の再配達に伴って増加。したがって、代替的な送達方法は、再注入のリスクを最小化するために確立される必要がある。他のいくつかの研究は、眼の中にゆっくり化学物​​質を放出することが可能な材料を通って、長時間にわたって薬物を送達するための方法を開発した。この研究では、成体ラット網膜への薬物送達のためのビヒクルとして機能するのElvax 40W、共重合樹脂の使用を概説する。樹脂を作製し、薬物がロードされる。薬剤 - 樹脂複合体は、それがゆっくりとtiの上に薬物を放出する硝子体腔に移植される私。この方法は、2 - アミノ-4 - ホスホノ（APB）、ブロック網膜の光反応をグルタミン酸類似体を用いて試験した。これは、APBをゆっくりと樹脂から遊離されることを実証した、と、移植後7日目までに、網膜応答をブロックすることができた。これは、この共重合体樹脂を用いた徐放性薬物送達は、網膜を治療するために有効であり、更なる試験で治療的に使用することができることを示している。

全視野電図（ERG）が網膜上APBの効果を検出するために使用された。 ERGが実行された方法については、以下の研究33,34を参照してください。簡単に述べると、動物を麻酔した後、金電極は、眼の角膜上に置き、参照電極は、網膜の電気的活動を記録するために、目の間の前方頭皮に入れた。刺激は、電子フラッシュユニットを使用して生成され、強度が10〜10ロッドごとに有効感光性分子の数を表し6光異性化、の範囲であった。これらの実験では、ERG記録は、1日および7日後の手順で行った。仲間は目が未処理の内部対照として使用した左のに対し各動物の右眼は、薬剤 - 樹脂複合体を移植した。 図1は、ロッド当たり光異性化の増加にb波の振幅の変化を示している（φ）。対照眼では、b波の振幅は、フラッシュ強度が増加するにつれて増加する。 図1Aに、レチナール応答記録は、移植後1日目に与えられている。注入された眼は、対照眼と同様の振幅パターンを示した。両眼間の振幅差が10 6φた（p...

本論文では、エルバックス40Wは成体ラットの網膜への薬物送達のための徐放方法として使用することができる方法を詳しく説明します。調製ローディング、および眼への薬剤 - 樹脂複合体を送達するためのプロトコルが記載されている。

ラット網膜へのエルバックス40Wを通じて徐放性ドラッグデリバリー：慢性症状の治療のための含意

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

本実験の全体的な目的は、眼の慢性疾患を治療するための持続的な薬物送達システムを提供する、比較的簡便で費用対効果の高い手法を実証することである。まず、共重合体樹脂ペレットを調製し、選択した薬物の担体を構築する。次に、薬物溶液とDを組み合わせて、薬物樹脂複合体を形成させる。次に、網膜へ薬剤を直接届けるため、薬物樹脂複合体を眼内に挿入します。網膜電図に基づき、薬剤が正常に送達されたことが結果から示されました。したがって、本手法は標的組織へ直接的に徐放的な送達を可能にするため、慢性的な網膜疾患の治療への応用が期待されます。したがって、ナノ粒子、ハイドロゲル、マイクロフィルムなどの他の既存の方法に対する本手法の主な利点は、手順が比較的簡単で安価であり、そのため科学実験室の環境で実施可能であることです。最初のステップは、共重合体樹脂ペレットを準備することです。そのためには、20 LVA X 40 W ペレットを小型のガラスビーカーに入れます。ビーカーに、すべてのペレットが浸るに十分な量の100% ethanolを注ぎます。ビーカーをパラフィルムで密閉し、室温で7〜10日間浸漬させます。準備ができたら、洗浄した20個のペレットをドラフトチャンバー内の別のガラスビーカーに移します。ジクロロメタンを4 mL加え、ペレットが溶解するまで約45分間放置します。次に、単回投与に必要な濃度の3倍の濃度で、選択した薬剤の溶液を40 µL調製します。続いて、Fast Green FCFを40 µL調製します。後の工程で樹脂を急速冷凍するため、ドライアイスを入れた容器を用意します。準備が整ったら、ピペットで40 µLの薬物溶液を吸い取ります。2本目のピペットで40 µLのファストグリーン溶液を吸い取ります。ロード後、2つの溶液を同時にビーカーに加えます。ガラス棒を用いて、緑色の染料が混合物全体に均一に分散するまで急速に撹拌します。その後、速やかにビーカーをドライアイス上に10分間置き、樹脂を急冷します。次に、溶媒を蒸発させるための蒸発チャンバーを準備し、より大きな容器の3分の1まで満たします。硫酸カルシウムペブルを用いて、ペブルの中にくぼみを作り、そこにビーカーを慎重に配置して、ペブルがビーカーの半分まで届くようにします。外側の大きな容器をパラフィルムで覆い、蒸発チャンバーをフリーザーに移します。−20 °Cで2〜3週間保存してください。インプラント用の薬剤樹脂複合体を準備するために、蒸発チャンバーをフリーザーから取り出し、固形化した薬剤樹脂ブロックを氷上に置いたガラス皿に移します。顕微鏡下で、TRリファインまたはパンチツールを用いて、直径約0.05 mm、長さ0.1 mmの組織片をブロックから切り出します。すべてのサンプルを採取し終えたら、ブロックの残りを耐凍結材で包み、後で使用するため

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Medicine

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ラット網膜へのエルバックス40Wを通じて徐放性ドラッグデリバリー：慢性症状の治療のための含意

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