Name: 定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ qPCR法を用いたホルマリン固定・パラフィン包埋された消化管生検組織中のサイトメガロウイルスDNA検出法。この高感度な分子生物学的手法は、従来の染色法で判定困難な症例において正確なウイルス診断を可能にする。

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我々は、図面の製造における彼らの努力のためにこの原稿を準備し、フレドリックSkarstedtとライアン·クリスティと彼女の援助のためエイミートマソンを認める。

治験審査委員会の承認を得て、電子実験室のデータベースの検索は、胃腸内のサイトメガロウイルス（CMV）感染例組織病理によって診断（GI）生検（ヘマトキシリン​​を表す（FFPE）ブロックと組み込みホルマリン固定、パラフィンを特定するために実施されたエオシン（H＆E）および/または免疫組織化学（IHC））。 FFPE GI生検組織からの1。組織処理<ol><li>サイトメガロウイルス（CMV）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）のためにFFPE GI生検組織ブロックを集める。これらのブロックは、室温で保存されている。 </li><li>ブロックの固有の識別番号を事前にラベル1.7ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li>ミクロトームのハンドホイールをロックします。 </li><li>カセットクランプに組織ブロックを装着します。 </li><li>新しい未使用のブレードを使用して、ミクロトームナイフ角度にブロックの位置を合わせます。 </li><li>厚さ10μmの部分をカットするミクロトームを調整します。 </li><li>目のロックを解除Eのハンドルとブレードに向かってブロックを進める。 </li><li>各カットは、組織のスクロールにロールバックできるように、厚さ10μmの間隔でブロックの5つのセクションをカット。各スクロールが必要な生検組織の適切な表現が含まれていることを確認してください。 </li><li>ミクロトームのハンドホイールをロックします。 </li><li>ピンセットで、組織のすべての5巻物は、交差汚染の可能性を減少させるためにパラフィンでスクロールを操作するように注意しながら、予め標識遠心管に入れます。チューブのキャップをスナップし、ラックの上に戻って配置します。 </li><li>ミクロトームから組織ブロックを削除します。 </li><li>ブレードを取り外し、廃棄します。 </li><li>以前の組織と接触した可能性のある表面や楽器を除染。 </li><li>ナイフホルダーに新しい未使用のブレードを配置します。 </li><li>繰り返しは、処理対象の各追加ブロックごとに1.4から1.14を繰り返します。組織スクロールを含有するマイクロフュージチューブはティムまで室温で保存することができるDNA抽出の電子。 </li></ol> FFPE GI生検組織のスクロールから2。のDNA抽出注：このプロトコルはFFPE組織DNA抽出キット（：製品安全データシート（MSDS）を参照してください。注意）の添付文書から採用されている。 <ol><li>各サンプル微量遠心管に：1ミリリットルのキシレン（MSDSを参照してください。注意）を追加します。 10秒間激しく蓋と渦を閉じます。 </li><li> 、具体的に以下のように変更して、メーカーの製品添付文書で概説DNA抽出を続行します。 </li><li>最初に各微量遠心管に内部統制（IC）の6を添加する。 <ol><li> Cは1時間°1時間56℃でATL /プロテイナーゼK溶解インキュベートした後、30分間99℃でインキュベートするのではなく、90。 </li><li>最終的なDNA溶出工程の間に、慎重にDNA精製カラムの蓋を開けて、むしろbuffeなく、膜の中心に50μlの蒸留DNアーゼ/​​ RNaseフリー水を適用rは食べました。 注：適切なストレージおよび試薬の製造のための添付文書を参照してください。 DNAはすべて5のFFPE巻物から抽出する必要があります。室温（15〜25℃）ですべての遠心操作を実行します。 </li></ol></li></ol> CMVのため3。定量PCR <ol><li>ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手順<ol><li> CMVアッセイの実行のために、ExcelのPCRワークシートを生成します。このExcelのワークシートには、Mgをマスターミックスを構成するために必要な各試薬の総量を計算します。これは、サンプルごとに必要な各試薬の量（下記参照）倍のサンプルおよびコントロールの数プラス1を（ピペッティングによる損失を補償するために）掛ける。 <ol><li>量の各PCR反応において、以下の試薬が示さ含む。 試薬0;サンプルあたりの量 CMVの液晶マスターミックスバイアル12.5μL mgのソリューション黄色バイアル2.5μL 総量15.0μL </li></ol></li><li>すべてのアッセイで例えば、水又は無標的対照（NTC）、陰性コントロール、低ポジティブコントロール、高い正の制御、およびQS3またはQS4いずれか、およびすべての患者サンプルを実行します。毛細血管の順に設定する必要があります。 </li><li> 4℃で保存されているリアルタイムPCR機器のための冷却ブロックの特定を得る冷却ブロックに適切な毛細管を配置します。毛細管の表面に触れないでください。毛細血管を取り扱う際は、必ず手袋を使用しています。 </li><li>増幅生産で汚染されていないクリーンフード内のすべてのポリメラーゼ連鎖反応を設定TS。 <ol><li>すべての患者試料に加え、5コントロールをテストするためにPCRキットからマスターバイアルの正しい数を削除します。マスターバイアル、Mgの溶液、および冷却ブロック内のPCRグレードの水を解凍しましょう​​。各マスターバイアルは12のテストのための十分な試薬が含まれています。 </li><li>優しくマスターバイアルをボルテックスし、迅速な最大速度で遠心分離器で、そ​​れらをスピン。 </li><li> 1バイアルに各マスターバイアルの内容を組み合​​わせて、ゆっくり再びボルテックスする。 </li><li>マスターミックスとMgソリューションは、単一の滅菌マイクロチューブをPCRワークシートに表示されている量で結合します。 </li><li>定量標準（QS）のためである5位の毛細血管を除いて、各キャピラリーチューブにやさしく、アリコートMgをマスターミックス15μLを混合します。 </li></ol></li><li>クリーンフードから加工フードにMgを毛細管とマスターミックスを含む冷却ブロックを移動します。 </li><li>マスターの残り30μlに内部統制の2μL（IC）を追加Mgを混ぜる。 5位のキャピラリー（QS用位置）にやさしく、アリコート15μlを混ぜる。 </li><li>ピペット適切なキャピラリーチューブ内への水、コントロールDNA、またはサンプルDNAを10μl。キャッピングツールを使用して、キャピラリーチューブにキャップ。 </li><li>リアルタイムPCR機器にブロック/サンプルを冷却取る。 </li></ol></li><li>番組のリアルタイムPCR計測器（ 表1を参照のこと） </li><li>増幅および検出はリアルタイムPCR装置で行っ<ol><li>コンピュータにログオン</li><li>ダブル器具のアイコンをクリックして、ソフトウェアにログイン。 </li><li>リアルタイムPCR測定器の電源をオン</li><li>フロントスクリーンから「CMV / EBV」をクリックします。 </li><li>マクロウィザードの指示に従います。 </li><li>ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、セルフテストを実行するためにボックスをオンにします。セルフテストは、測定器が使用されている1日に1回実行する必要があります。 </li><li>実行に名前を付けます。 </li><li>上側のLEFにあるサンプル数を調整コントロールと患者の合計にページのTコーナーが実行に含まれ、各患者サンプルの識別番号を入力してください。 </li><li> 「ABSクワント」タブをクリックします。 </li><li> 「サンプルの種類」の下で、標準のための適切なサンプルタイプを割り当てる。 </li><li>定量標準（QS）が予想される濃度を入力します。 </li><li>クーラーブロックから毛細管を削除し、（ブロックサンプル＃1を冷却するなど 、カルーセル上の位置＃1に配置する必要があります）カ ​​ルーセルの対応する位置にそれらを配置します。 </li><li>測定器の遠心分離器を押し、スタートにカルーセルを配置します。 </li><li>遠心分離機を開き、カルーセルを取り外します。 </li><li>リアルタイムPCR機器にカルーセルを配置します。ふたを閉めます。 </li><li>を押して「スタートファイル名を指定して実行」。 </li><li>のリアルタイムPCR装置は、サンプルのために、それぞれの位置をチェックします。このチェックが完了するまで、機器からESPEを離れて歩いたりしてはならない毛細血管の一つがカルーセルにない場合cially。測定器は、この点に注意して、実行を継続するかどうか尋ねるでしょう。離れる前にyesと答える。 </li><li>実行が完了すると、生成されたレポートを閉じます。 </li><li> 「絶対定量」をクリックします。 </li><li>色補正の横にある矢印をクリックしてください。 </li><li>ドロップダウンボックスから「色の選択報酬」をクリックしてください。 </li><li>実行するために適用するために、最新のカラー補正ファイルを選択してください。 </li><li>ボックスがポップアップ表示されたら[OK]をクリックします。 </li><li>標準曲線の矢印をクリックします。 </li><li>ドロップダウンメニューから「外部利用」を選択します。 </li><li>最新の外部標準曲線ファイルを選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>濃度が割り当てられている場合の曲線は、存在していない平坦な線であることを確認するために絶対定量メニューの各曲線を見てください。 705/Back 530のための絶対定量が自動的に分析されている。 </li></ol></li><li> QUalityコントロール<ol><li>より頻繁な方、試薬の新しいロット番号が受信されるたびに、新しい標準曲線、または半年ごとに生成します。 </li><li> Mgをマスターミックスに各標準液10μlを加える。以前に抽出されたDNAのようなキットに含まれている基準を検討してください。 </li><li> Mgは正確な定量性を確保するために、標準曲線を生成する際に使用したマスターミックスに各標準のための内部統制の1を添加する。テンプレートなしのコントロール（NTC）のためにMgをマスターミックスにICを追加しないでください。 </li><li> 16のデータポイントで、合計NTCおよび定量標準QS 4、3、2、1、標準曲線を作成し、実行のためのQS4の1:10希釈の3回の反復を用意します。 </li><li>繰り返さ標準のためのドロップダウンメニュー内の &quot;の複製」を選択します。 </li><li>チャンネル530/backのnoneを選択し、実行を分析する際、色補正をオンにし、 </li><li> 「（ファイル名を指定して実行で）標準曲線」に、EX名前を付けて保存」を選択ternal「曲線に名前を付けます。保存時に「標準曲線として適用 &quot;コメントを入力します。 </li><li>結果をグラフ化する。その結果、直線性係数は0.81を≥しなければなりません。 </li><li>毎日実行するために、走行中のコントロールとしてQS3またはQS4のコピーが含まれています。現在の外部標準曲線は、分析フェーズ中に実行にインポートすることができる。 </li><li>実行されるコントロール：いいえDNAコントロール、陰性コントロール、低、高陽性対照。予想されるウイルス量を測定し、各ベンダーとロット番号のために調整される。 </li><li>各サンプルにICを追加し、DNA抽出の際に制御します。 </li><li>コントロールのいずれかが範囲外に落ちた場合、容認できない結果を記録し、トラブルシューティングのためのアッセイを参照してください。 </li></ol></li><li>コントロールの周波数<ol><li>すべての実行中に、次のとおり、NTC、負、正の低、高い正、そして標準コントロール。 </li></ol></li></ol>注：コントロールの許容限度。ピークが観察されるべきではないテンプレートなし（NTC）および陰性対照のためのD。ピークは530チャンネルで存在すべきであると予想されるウイルス量は決定され、低域と高陽性対照のため、各ベンダやロット番号のために調整されている。

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
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<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

多くの実験室的方法は、最近実証されたように、血清学、ウイルス培養、分子ウイルス血アッセイ、生検材料の組織学、および、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検の分子アッセイを含む、サイトメガロウイルスの診断（CMV）感染にご利用いただけます組織5,6。血清学的検査は、診断の主力一度のみ確実に露出を識別し、急性CMV感染7とよく相関しない。ウイルス培養、両方の従来の初期抗原シェルバイアルを、後者の8例で最高の2〜3日で、長時間のアッセイ時間によって妨げられる。分子ウイルス血アッセイは、ほとんどが治療効果9-11を監視するための定量的な可能性を有するという利点を有する、開発されている。胃腸（GI）管の局所的関与の臨床懸念がある場合には、残念ながら、ウイルス血アッセイは、全身の関与を反映し、特異的に局在感染を識別しない。そのため、HistologyはGI管のCMV感染を識別するためのゴールドスタンダードとなっている。 これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、化学療法に、このよ...

臨床検体中のサイトメガロウイルス（CMV）感染の解釈は非常に重要である。 CMVはヘルペスウイルスのbetaherpesvirinaeサブファミリーのメンバーである。他のヘルペスウイルスと同様に、CMVはアクティブなウイルス複製1の欠如を特徴と持続性または潜伏感染を確立する能力を持っています。ウイルスの再活性化は、疾患の症状2-4を伴うことがあるビリオン放出を特徴と活発なウイルス複製につながる、ストレスや他の免疫抑制の時間帯に発生する可能性があります。胃腸（GI）のCMV疾患の症状が頻繁に腹痛および/ ​​または血便1が含まれています。 組織学によるCMV胃腸炎の診断は、CMVウイルスの介在物を同定するためにヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）を利用する。臨床的疑いが高く、まだ明らかな介在物が観察されない場合において、免疫組織化学（IHC）は、しばしば補助試験法として使用される。しかし、IHCまた、解釈が難しい（ 図2）5作る珍しい非古典登場する携帯染色パターン（あいまい）によって妨げられることができる。なお、GI生検においてCMVを検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）GI生検組織および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）から抽出したDNAを使用することが求​​められていた。この技術は、GI生検においてCMVの検出に貴重であることが示されており、曖昧なIHC染色ケース5,6において特に有用であるれている。また、定量PCRはまた、6利用可能になった追加のCMV臨床試験データとよく相関することが示されている。 CMVの検出に定量PCRの使用は、CMVのための臨床的疑いが高い場合での早期診断と治療につながる可能性がありますが、H＆EおよびCMV IHCは陰性である。

<table><tbody><tr><td>1.7 mlマイクロフュージチューブ</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>鋸歯状鉗子</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>62086-1S</td><td>マイクロ鉗子 MF-1</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機 (マイクロフュージ)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー</td><td>フィッシャー サイエンティフィック: X3P</td><td>1 ガロン</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td>フィッシャー フィッシャーサイエンティフィック: ET108</td><td>96-100%</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE 組織キット</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR サプリメントキット</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 遠心分離機</td><td>ロシュ</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 冷却ブロック</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler キャッピングツール</td><td>ロシュ</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>色補正キット</td><td>ロシュ</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu;l キャピラリー</td><td>ロシュ</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>ブレード</td><td>サクラ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック: 4689</td><td>アキュエッジ ロープロファイル</td></tr></tbody></table>

定量pcrは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスdnaの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

これは、重症感染症を開発するための彼らの大きなリスクを考えると、胃腸（GI）免疫抑制患者の管内でのサイトメガロウイルス（CMV）感染を識別することが重要です。 CMV感染の検出のための多くの実験室方法は、血清学、ウイルス培養、および分子の方法を含む、開発されている。多くの場合、これらの方法は、CMVによる全身の関与を反映し、特に局所的な組織の関与を特定していない。したがって、GI管におけるCMV感染の検出は、しばしば、生検組織の伝統的な組織学によって行われる。免疫組織化学（IHC）に連動して、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色は、これらの生検を調べた柱が残っている。 H＆EおよびIHCは時々の解釈を困難にし、非定型（あいまい）染色パターンになる。これは、CMVの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）が正常に非常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織生検を行うことができることが示された高い感度および特異性。このプロトコルの目的は、臨床検査の設定でのFFPE生検組織におけるCMVの検出のための定量PCRテストを実行する方法を示すことです。この方法は、GI生検におけるCMVのための曖昧な染色例の患者のために非常に有益である可能性が高い。

228組織ブロックの合計91サイトメガロウイルス（CMV）陽性組織学および陽性免疫組織化学（IHC）に基づいてケース、あいまいCMV IHC 18、および79ネガティブコントロールで構成された定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により試験した。 図2に示すように、CMV陽性症例は、典型的なCMVウイルス封入体（A）および/ ​​または陽性IHC染色（B）を実証しているであろう。ネガティブコントロールがない不審な組織学またはIHC染色5を示さなかったであろう一方、疑わしいケースは、稀な、非古典的な登場染色パターン（C）を証明したであろう。 組織病 ​​理によるCMVのための肯定的な91検の、88は定量PCR（ 表2）で陽性であった。伝統的な組織学に基づいた真陽性の定義では、典型的なCMVウイルス介在物および/ ​​または一般的なCMV IHC、すなわち 、これらのデータは、...

このプロトコルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋生検組織におけるサイトメガロウイルスのqPCR検出について説明しています。これは、迅速で、感度が高く、特異的で、曖昧なヘマトキシリンとエオシン、または免疫組織化学染色パターンの解釈に役立ちます。

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

本手順の全体的な目的は、胃腸生検におけるサイトメガロウイルスDNAの検出感度を高めることであり、特に従来の染色法では判定が困難な生検検体を対象としています。まず、ホルマリン固定パラフィン包埋された胃腸生検組織を薄切し、ロール状に回収します。次に、増幅のためにこれらの組織ロールからDNAを抽出します。使用した特異的プライマーにより、サイトメガロウイルスDNAを選択的に増幅させます。消化管生検組織を用いた従来法で結果が不確定な場合に、この高感度法を用いてサイトメガロウイルスDNAを検出できます。ヘマチン染色、アンドイン染色、免疫組織化学などの他の手法に対する本手法の主な利点は、スライド上の非典型的染色パターンの解釈を必要としない点にあります。消化管生検組織の切片を作成する様子を実演するのは、ラボの組織技術者であるZainab van Hornです。また、ラボにおける核酸抽出およびRT-PCRのセットアップについても実演します。このプロトコルのために、砕氷上に置いたFFPE GI生検組織ブロックを用意します。まず、マイクロトームにて、各サンプルブロックの識別番号を記載したマイクロ遠心チューブにラベルを貼ります。ハンドホイールがロックされていることを確認し、組織ブロックをカセットクランプにセットします。検体間のクロスコンタミネーションを防ぐため、必ず新しい刃を使用してください。最初の検体には、未使用の刃を使用することが極めて重要です。試料の間で別の刃に交換し、また試料の間でミクロトームの除染を行ってください。次に、ブロックをナイフの角度に合わせて調整し、切片の厚さを10 micronsに設定します。その後、ハンドホイールのロックを解除し、ブロックを刃に向かって前進させます。ブロックを10 micron間隔で5枚切り出し、各切片が組織のロール状（スクロール）になるようにします。各ロールに目的の生検組織が十分に含まれていることを確認してください。5枚のロールを切り出したら、ハンドホイールをロックします。5本のロールをラベル付き遠心チューブに移す際は、ピンセットがパラフィンのみに触れ、組織に触れないように迅速に行ってください。チューブに蓋をし、次にカセットクランプからブロックを取り出して、次のサンプルのロールを回収します。まず、ブレードを取り除いて廃棄してください。また、未使用の新しいブレードを装着する前に、前のサンプルに接触した可能性のある表面をすべて除染してください。サンプルをさらに処理するまで、室温で保存することが可能です。以下のプロトコルは、FFPE組織DNA抽出キットから改変したものです。操作を開始する前に、必ず化学物質安全性データシート（MSDS）を確認してください。まず、各サンプルチューブにキシレンを1 mL加え、10秒間激しくボルテックスします。次に、以下の変更を加えた状態で、製造元の指示に従ってください。まず、各チューブに内部コントロールを6 µL加えます。次に、56 °Cで1時間のA TLプロテイナーゼK溶解インキュベーション後、サンプルを90 °Cで1時間ではなく、99 °Cで30分間インキュベートします。第三に、溶出ステップを行う際、TEバッファーの代わりに、nuclease-free distilled waterを50 µL、溶出カラムのメンブレンの中央に慎重に加えてください。最後に、すべての遠心分離ステップは室温で実施してください。反応のセットアップは、当該キットの増幅産物によるコンタミネーションのない、清潔なフード内で行ってください。サンプル数にコントロール5件分を加えた量に相当するマスターバイアルとマグネシウム溶液を取り出します。各マスターバイアルには12回分（テスト分）の試薬が含まれています。融解後、マスターバイアルをボルテックスし、最大速度で短時間遠心分離して液を落とします。次に、PCRワークシートに従い、マグネシウム溶液とマスターミックスを混合します。冷却ブロックにセットした状態で、ピぺッティングにより溶液を穏やかに混合します。5番の位置を除き、冷却ブロック内のテスト用キャピラリーにミックスを15 µLずつ加えます。このキャピラリーは定量標準用に確保しておきます。キャピラリーとマグネシウムを含むマスターミックスが入った冷却ブロックを、クリーンフードから別の処理用フードへ移動させます。ここで、残りの30 µLのマスターミックスに2 µLの内部コントロールを添加します。ピペッティングで溶液を混合し、この混合液 15 µL を5番目のキャピラリーに分注します。次に、水コントロールDNAまたはサンプルDNA 10 µL を適切な箇所に加えます。ロードが完了したら、キャピラリー遠心機にあるキャッピングツールを用いてキャピラリーを密封します。キャピラリーを冷却ブロックからカルーセルラックの対応する位置に移動します。次に、カルーセルを遠心機にセットし、スピン後のサイクルを実行します。カルーセルをリアルタイムPCR機に移し、後の解析時に反応を実行します。絶対定量を用いてデータを確認し、定量を行うための標準曲線が利用可能であることを確認します。合計228件の組織ブロックをQPCRで検査しました。そのうち91件のブロックが、組織学的所見および免疫組織化学的染色陽性に基づき、CMV陽性例とされました。18個のブロックでC-M-V-I-H-Cの結果が不確定でした。残りの79個は陰性コントロールでした。CMV陽性例を示します。典型的なCMVウイルス封入体とIHC染色の陽性反応、またはそのいずれか一方が認められた。疑わしい症例ではまれに非典型的な染色パターンが示された一方、陰性コントロールでは、CMV陽性であった88例の組織に対し、91例で疑わしい組織学的所見やIHC染色が見られなかった。また、陰性コントロール71例をqPCRで検査したところ、1例がCMV陽性であった。A.判定困難なC-M-V-I-H-C染色の生検組織に関する考察は、テキストプロトコルに記載されています。このビデオを視聴することで、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）された消化管生検組織からDNAを抽出する方法と、それに続くリアルタイムPCRによるサイトメガロウイルスDNAの検出方法について、十分に理解できるはずです。

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

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生物学

我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。...

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

このビデオでは、MCPyVビリオンに感染した細胞をin situハイブリダイゼーション連鎖反応にかけ、MCPyV特異的なゲノムを検出しました。さらに、DNA-HCR技術をFISHと組み合わせて、感染したヒト皮膚細胞のMCPyV...

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA...

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用​​性を示します。...

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR...

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

逆のトランスクリプション (RT qPCR) と組み合わせてリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応分析は、RNA ウイルス感染のレベルを測定するため広く使用されています。デング熱ウイルスを含むいくつかの RNA ウイルスの定量化のために開発、RNA の精製ステップを必要としない直接 RT qPCR...

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染細胞の培養上清中のデング ウイルス RNA を測定

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。...

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

筋肉の損傷のメカニズムの同定は非常に重要です。ここでは、ショウジョウバエの胸部筋肉のパラフィン包埋して凍結切片を調製するための組織学的手法を提示する。これは筋肉の形態やタンパク質と他の筋肉の細胞成分の局在の分析を行うことができます。...

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

学ぶ qPCR法を用いたホルマリン固定・パラフィン包埋された消化管生検組織中のサイトメガロウイルスDNA検出法。この高感度な分子生物学的手法は、従来の染色法で判定困難な症例において正確なウイルス診断を可能にする。

定量PCRは、ホルマリン固定、パラフィン包埋された生検組織中のサイトメガロウイルスDNAの検出のための高感度かつ迅速な方法であり、

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