Name: 培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶsiRNAスクリーニング法で、培養哺乳動物細胞におけるユビキチン系の新規レギュレーターを識別する手法です。HIF1A依存的低酸素応答を用いた標的アプローチにより、従来の全ゲノムスクリーニングより迅速かつ低コストで効率的な解析が可能です。

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この作品は、ウェルカムトラスト、グラクソ·スミスクライン（GSK）とセルシグナリングのためのスコットランド研究所（MRCのタンパク質リン酸化とユビキチン化ユニットの一部）によってサポートされていました。

<ol><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458, 422-429 (2009).</li>
<li>Schulman, B. A., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+activation+by+E1+enzymes%3A+the+apex+for+downstream+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).</li>
<li>Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+to+reading+the+RNA-interference+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the road to reading the RNA-interference code.</a> Nature. 457, 396-404 (2009).</li>
<li>Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+by+metazoans%3A+the+central+role+of+the+HIF+hydroxylase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway.</a> Mol Cell. 30, 393-402 (2008).</li>
<li>Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+remodeler+ISWI+regulates+the+cellular+response+to+hypoxia%3A+role+of+FIH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH.</a> Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).</li>
<li>Bhinder, B., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+analyzing+actives+in+random+RNAi+screens%3A+introducing+the+%26%2334%3BH+Score%26%2334%3B+for+hit+nomination+%26+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the &#34;H Score&#34; for hit nomination & gene prioritization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).</li>
<li>Bett, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-body+component+USP52%2FPAN2+is+a+novel+regulator+of+HIF1A+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability.</a> Biochem J. 451, 185-194 (2013).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+methods+for+analysis+of+high-throughput+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens.</a> Nat Methods. 6, 569-575 (2009).</li>
<li>Stagg, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRC8+E3+ligase+ubiquitinates+MHC+class+I+molecules+before+dislocation+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER.</a> J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF146+is+a+poly%28ADP-ribose%29-directed+E3+ligase+that+regulates+axin+degradation+and+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling.</a> Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).</li>
<li>Jackson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Birmingham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR+seed+matches%2C+but+not+overall+identity%2C+are+associated+with+RNAi+off-targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets.</a> Nat Methods. 3, 199-204 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whither+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whither RNAi.</a> Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

哺乳動物細胞におけるゲノムワイドなsiRNAスクリーンの使用は、異なる生物学的経路の新規な調節因子を同定するのに非常に有益であることが証明された。ここでは、低酸素に対するHIF1A媒介性細胞応答の調節因子を同定するための標的ubiquitome siRNAスクリーニングの使用が記載されている。対象となる画面は、彼らは一般的に安価であるように、より速く、ますます魅力的になってきて簡単に管理するための唯一の研究者が7関心のある経路成分についての報告、10、11。 これは、基本セルレポータースクリーニングに適しており、その再現性および低変動性を達成することができることを確認するために、アッセイ開発段階に主要な努力をすることが重要である。これは、ライブラリ·レギュレータが落ちるその中で分離のウィンドウを作成するために強固な陽性および陰性対照を選択することも重要である。さらに、これらは、各アッセイプレート内の内部対照として働く個々のプレートに問題の迅速な同定を可能にするスクリーン。 ハイスルー...

ユビキチンおよびユビキチン様分子（のUbl）とのタンパク質の修飾は、多様な生物学的経路とストレス反応を調節広大な生化学システムを表します。彼らの標的タンパク質に対するのUblの共有結合は、安定性、局在性、機能または基板1のインタラクトームを規制する様々な成果を持つことができます。 UBLの変更の基礎となる酵素工程は、まず、ユビキチンのために設立され、現在ではSUMO、NEDD8、ISG15およびFAT10を含むほとんどのUbl、との修正のためのパラダイムとして機能した。修飾が起こるためには、UBLのジグリシンモチーフのカルボキシレート基は、第E2結合酵素の活性部位システインへ転送される高エネルギーチオールを形成するためにE1活性化酵素により活性化される。 E2は、その後、（通常は）分枝鎖（イソ）を作成し、ターゲットのリジン残基が結合2にUBLの転写を媒介する基質結合E3リガーゼと相互作用する。修正の連続ラウンドは、ユビキチンリニアユビキチン鎖を作成し、その7リジンのいずれかを介して、またはそのN末端メチオニンを介して起こり得る基板上にイソペプチドチェーンを構築するために発生する可能性があります。これらの変更は、このような従来の専門プロテアーゼによるUBLの除去に新たな相互作用モチーフを作成し、分解のためにタンパク質を標的として、多様な目的に離散トポロジーを形成している。ユビキチンの場合、2つのE1酵素、30〜40のE2結合酵素、少なくとも600のE3リガーゼと約100脱ユビキチン化酵素（DUBの）があります。経路は、他の10かそこらのUblはあまり広大ですが、全体的なubiquitomeの複雑さは、特定のUBL改変の生物学的結果に大きな多様性を与える。 UBL生物学における大きな進歩がなされてきたがしかし、これらubiquitome部品の大多数の正確な細胞の役割は不明のまま。 short int型の使用erferingリボ核酸（siRNA）が原因、特に個々の遺伝子の役割は、さまざまな生物学的状況3で調べることができるように、破壊のための細胞mRNAを標的とするsiRNAの能力に逆遺伝学の強力なツールとして浮上している。全ゲノムスクリーンは、多くの細胞プロセスの新たな規制当局を特定し、検証するために使用されており、より広い科学界にアクセス可能な有用なデータが豊富に作成しました。全ゲノムスクリーンは非常に有用であることが証明されているがしかし、対象となる画面は、彼らが安くなっていますように、速く、唯一の研究者が最も興味のあるゲノムのメンバーにはあまりデータ管理とレポートを伴い、ますます人気が高まっている。そのため、より良い細胞プロセスUBLファミリーの構成要素が関与しているかを理解するために、我々はすべての知られてubiquitomeのコンポーネントを予測を対象とした、人間のsiRNAライブラリーをコンパイルしている。これはのUbl、E1活性化酵素、E2共役が含まれてい酵素、E3リガーゼ、ユビキチン結合ドメイン（UBD）含有タンパク質とのDUB。このライブラリは、このように、これらの経路を支配する新規なUBL成分の公平な同定を可能にする、異なる生物学的問題のレポーター細胞株の広い範囲に対してスクリーニングすることができる。 以下のプロトコルは、低酸素に対するHIF1A依存性応答の新規制御因子を特定するために、厳格な標的としたsiRNA ubiquitome画面を実行する方法について説明します。通常の酸素分圧の下では、HIF1Aは、フォン·ヒッペル·リンドウ（VHL）E3リガーゼ複合体4によって認識され、分解の標的させるプロリルヒドロキシル化の対象となります。低酸素症は、HIF1Aの安定化につながるプロリルヒドロキシル化を阻害し、その後の低酸素応答エレメント（HRE）に結合する遺伝子の発現を駆動する。ここでは、安定的にハイの三タンデムコピーの制御下でホタルルシフェラーゼを発現U20S骨肉腫細胞を使用して画面を記述poxia応答エレメント（U20S-HRE細胞）5。レポーター活性の強固な読み出しが達成可能であり、適切な陽性および陰性対照とカップリングすることができる場合に、このプロトコルは、任意の生物学的な経路に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>自動液体ディスペンサー</td><td>Fluid-X</td><td>XPP-721</td><td>http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td></tr><tr><td>白壁アッセイプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td></td><td>655083 http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td></tr> <tr><td>クリアプレートフィルム</td><td>パーキンエルマー</td><td>1450-461</td><td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td></tr><tr><td>siRNAライブラリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>On-Target Plus</td><td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td></tr> <tr><td>Transfection試薬</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine RNAimax</td><td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td></tr><tr><td>還元血清培地</td><td>Invitrogen</td><td>Optimem</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>インビトジェン</td><td>25300-054</td><td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td></tr></tbody></table>

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、sirnaのスクリーニング

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

ユビキチンおよびユビキチン様分子（のUbl）を有するタンパク質の翻訳後修飾は、低酸素応答、タンパク質恒常性、DNA損傷応答及び転写を含む多様な生物学的経路を調節ダイナミック細胞シグナル伝達ネットワークとして浮上している。より良いのUblは、ヒトの疾患に関連する経路を調節する方法を理解するために、我々は、UBLシステム経路のすべての既知の予測成分を標的1186 siRNAの二重のプールからなるヒトのsiRNA」ubiquitome」ライブラリをコンパイルしている。このライブラリは、UBL成分は、当該経路の正又は負の調節因子として作用するかを決定するために、多様な生物学的経路のレポーターを発現する細胞株の範囲に対してスクリーニングすることができる。ここでは、転写ベースのルシフェラーゼレポーターを使用して低酸素に対するHIF1A媒介細胞応答のubiquitomeレギュレーターを識別するために、このライブラリを利用したプロトコルを記述します。最初のアッセイ開発段階第一、第二および第三級/デコンボリューションスクリーニング：三段階でのスクリーニングを実施する前に、細胞株の適切なスクリーニングパラメータを確立するために行われる。それが唯一の研究者が最も興味を持っているとの経路のメンバーに報告するという利点を提供するように全ゲノムsiRNAライブラリーを介してターゲットの使用は、ますます人気が高まっています。 siRNAのスクリーニングの固有の制限にもかかわらず、siRNAのオフターゲット効果に起因する特定の偽陽性で、問題となっている経路の本物の小説制御因子の同定は慎重に行っ制御一連の実験を実施することによって克服することができるこれらの欠点を上回る。

スクリーニングの前に、HRE-U20S細胞の低酸素応答性が確立される。 U20S-HRE細胞が低酸素にさらされるとHIF1A/HIF1Bヘテロ二量体（ 図1A）に拘束された低酸素応答エレメントの3タンデムコピーの下流に融合ホタルルシフェラーゼからなるレポーター構築物を発現する。細胞を低酸素暴露は、スクリーニングのための最も効果的な応答を生成する確立する時間の範囲の低酸素ワークステーションに配置されている。 U20S細胞は、したがって、ルシフェラーゼ測定値が低酸素症媒介HIF1A安定化7に大きく依存している、HIF2Aを低レベルで発現する。 0時間、2時間、4時間、6時間、ルシフェラーゼ活性の低酸素依存的誘導（ 図1B）での24時間の結果を得るために低酸素症にU20S-HRE細胞の曝露。活動の約10倍の誘導（ 図1B）での24時間の結果を得るために低酸素症にU20S-HRE細胞の曝露は、したがって、これは表しNのsiRNAスクリーニングのための優れた応答。 適切...

ここでは、低酸素にHIF1A媒介細胞応答の新規ユビキチンおよびユビキチン様レギュレータを識別するための画面」ubiquitome」を標的としたsiRNAを実行するための方法論を説明します。これはレポーター活性のうち、堅牢な読み取りが可能な任意の生物学的経路に適合させることができる。

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

この手順の全体的な目標は、HF one α依存性低酸素応答を例として使用して、ユビキチンおよびユビキチン様修飾系の新規成分の生物学的経路への関与を特定することです。これは、まず環境刺激性低酸素症に対するレポーター細胞株の応答を最適化することで達成されるため、レポーター細胞株はスクリーニングに適しています。手順の 2 番目のステップは、スクリーニングに適した Z 係数を与えるための高コントロールと低コントロールを確立することです。パラメータが確立されると、一次 irna スクリーニングが 3 回で実行され、その後、二次および三次デコンボリューションスクリーニングによってヒットが確認されます。最終的に、その結果は、問題の生物学的経路の新しいユビキチンおよびユビキチンのようなシステム調節因子を明らかにすることができます。この技術が全ゲノムIrnaスクリーニングのような既存の方法よりも優れている主な利点は、ターゲティングスクリーニングがより速く、実施が容易で、安価であり、研究者が最も関心を持つ生化学的経路のメンバーについてのみ報告することである。U2 O-S-H-R-Eレポーター細胞株の低酸素応答性は、10%FBSのDMM中に2つの75センチメートル四方の細胞フラスコを用意しています。細胞が80〜90%になったら、1つのフラスコから培地を吸引し、それらの細胞を10ミリリットルのPBSで2回洗浄します。トリプは細胞をアニズし、10%FBSとDMMの8ミリリットルでそれらを再懸濁し、ピペットで細胞を均質にし、平均2つの細胞数を得て、その後、細胞をミリリットルあたり60,000に希釈します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、5つの白い壁の96ウェルアッセイプレートの3つのカラムに6,000個の細胞を加え、5つのプレートをインキュベートしながら一晩インキュベートします。プレートの基部に湿ったティッシュペーパーを置き、翌日の終わりにプレートの山に硬くて透明なビニール袋を置きます。時間を記録し、1つのプレートを1%酸素に設定された低酸素ワークステーションに移します。次に、インキュベーション開始から14時間後、18時間後、および22時間後にプレートを低酸素ワークステーションに移動します。次に、30ミリリットルのルシフェラーゼ溶解バッファーを作ります。BSAをバッファーに少なくとも30分間溶解させてから、Luciferとピロリン酸ナトリウムを添加してください。最初のプレートエディションの24時間後、低酸素ワークステーションをアンロードし、調製したバッファーをアッセイプレートの各ロードウェルに追加して、細胞を完全にシラミ化します。プレートを透明なフィルムで覆い、10分間振とうします。500 RPMで、スタックしたプレートをソフトウェアの自動プレートリーダーに移します。プロトコ

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

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生物学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

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ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

ここで使用した実験は、分子ドッキングとプローブ技術を組み合わせて、伝統的な漢方薬の低分子とタンパク質標的との間の相互作用を予測および検証する方法を示しています。...

分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶsiRNAスクリーニング法で、培養哺乳動物細胞におけるユビキチン系の新規レギュレーターを識別する手法です。HIF1A依存的低酸素応答を用いた標的アプローチにより、従来の全ゲノムスクリーニングより迅速かつ低コストで効率的な解析が可能です。

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

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