ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

本手順の総合的な目的は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、iPS細胞由来の網膜色素上皮細胞、および胎児網膜色素上皮細胞におけるマイクロRNAの発現を比較することです。これは、まずiPS細胞と胎児RPEを培養し、拡大させることで達成されます。

第2ステップは、iPS細胞をRPEへと分化させることです。次に、iPS細胞、iPS-RPE細胞、および胎児RPE細胞からRNAを抽出します。最終ステップとして、これらのRNAサンプルを用いてマイクロRNAマイクロアレイ解析を行い、データを解析します。

最終的に、パスウェイ解析およびネットワーク解析を用いて、増殖や細胞周期の進行を含む複数の細胞ネットワークに関与する、差異的に発現しているmicroRNAを特定します。この手法は、成熟したRPEへの分化、細胞周期の進行、増殖、および老化の調節におけるmicroRNAの役割など、視覚研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の意義は、治療に使用される細胞の最適な継代数を決定できるため、疾患や損傷のあるRPEを置換するための幹細胞由来網膜色素上皮を用いた治療法にまで及びます。

本手法は、iPS細胞からRRPへの分化を制御する因子の解明に寄与するだけでなく、iPS細胞から他のTC特異的な細胞型への分化など、他の器官系にも応用可能です。本手順を開始するには、新たにコーティングしたプレートのM tester one培地を用いて、1ウェルあたり約350個の細胞コロニーとなるように人工多能性幹細胞を播種し、iPS細胞コロニーを4〜5日間培養して拡大させます。

その後、3日ごとにM tesser one培地を4 mLの分化培地で置換し、培地の半分を新鮮な分化培地で交換します。色素沈着したフォーカスが、手作業で培養液から切り出せる大きさになるまで成長させます。これには約40～50日かかります。次に、200 µLピペットチップを使用して、色素沈着したコロニーの周囲を切り取り、持ち上げます。

切り出したコロニーを回収し、15 mLのコニカルチューブにまとめます。まとめられたRPE細胞に5 mLのDMMF 12培地を加え、300 ×gで5分間遠心分離します。次に、培地を除去して細胞ペレットを5 mLの培地で再懸濁し、遠心分離を繰り返します。

細胞ペレットから培地を除去します。次に、プールしたI-P-S-R-P-Eを0.25% TRIPSIN EDTAとともに37 °Cで5〜10分間、細胞塊が単一細胞に解離するまでインキュベートし、単一細胞懸濁液を調製します。I-P-S-R-P-E細胞をI-P-S-R-P-E培地で洗浄し、回収した細胞をMatrigelコートした新しいプレートに4 mLのI-P-S-R-P-E培地と共に播種します。継代前に3週間細胞を培養し、実験期間中は3日ごとに新鮮なI-P-S-R-P-E培地で培地交換を行ってください。

I-P-S-R-P-E細胞を1平方センチメートルあたり100,000個の密度で播種し、未分化IPS細胞を回収するために播種から17日後に細胞を回収します。未分化コロニーの中心部が高密度になるまで細胞を培養します。この状態が確認されたら、コロニーをD-M-E-M-F 12培地で洗浄し、Accutaneを用いてIPS細胞を単一細胞に解離させます。

細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、300 Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLのD-M-E-M-F 12培地で再懸濁します。胎児RPEを回収する場合、まず胎児RPE細胞培養物をD-M-E-M-F 12で洗浄します。次に、0.25% TRIPSIN EDTAを用い、37 °Cで5〜10分間処理して細胞培養物を単一細胞に分散させます。

胎児RPE細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、300 gで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLのD-M-E-M-F 12培地で再懸濁します。

17日目にI-P-S-R-P-E細胞を回収します。継代3回目および5回目以降、I-P-S-R-P-E細胞をPBSで2回洗浄し、0.25%トリプシン1 mLを用いて37 °Cで5〜10分間インキュベートし、単一細胞懸濁液を調製します。その後、氷冷したI-P-S-R-P-E培地2 mLでトリプシンを中和し、細胞を15 mLコニカルチューブに回収します。

チューブを300 Gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。マイクロビーズキットに含まれる染色バッファー3 mLを用いて細胞ペレットを再懸濁し、染色バッファー中のI-P-S-R-P-E細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、再懸濁します。

細胞ペレットを、マイクロビーズキット付属の染色バッファーを用いて、100 µLあたり2×10⁶個の濃度で懸濁させる。細胞2×10⁶個につき、anti TRA1-60 PE抗体を10 µL添加する。十分に混合し、4 °Cで10分間インキュベートする。

2 × 10⁶個の細胞あたり1 mLの染色バッファーで細胞を洗浄します。その後、細胞懸濁液を300 ×gで10分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、2 × 10⁶個の細胞あたり80 µLの染色バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。

次に、細胞2×10⁶個あたり20 µLのanti-PE標識マイクロビーズを添加します。十分に混合し、4 °Cで15分間インキュベートします。細胞2×10⁶個あたり1 mLの染色バッファーを加え、300 ×gで10分間遠心分離し、上清を吸引除去します。

次に、細胞ペレットを500 µLの染色バッファーで再懸濁し、付属のテキストプロトコルに従って磁気細胞分離機を用いてTRA1-60陰性細胞を分離します。核酸ミニプレップ用に設計された市販のマイクロ遠心ホモジナイザー・ミニスピンカラムに各サンプルを通し、細胞を溶解させます。その後、小分子RNA分子を保持するように設計された市販のRNA抽出キットを用いて、iPS細胞、iPS-RPE、および胎児RPEから全RNAを抽出します。

NanoDrop分光光度計を用いて全RNA濃度を測定し、サンプル群間で発現レベルに2倍以上の差が認められたmicroRNAのリストを含むExcelファイルを作成します。次に、オンラインのRNAパスウェイ解析プログラムにログインし、そのExcelファイルをアップロードします。ファイル形式に「flexible format」を選択し、識別子のドロップダウンリストから「Agilent」を選択してください。

「raw data」の見出しの下に入力します。「probe ID」列には「ID」を割り当て、「log ratio」列には「observation one」と「log ratio」を割り当てます。それ以外のすべての列は「ignore」を選択してください。

解析パラメータを次のように選択します。信頼性は「実験的に観察されたもののみ」とし、「直接的および間接的な関係」を含め、「内因性化学物質」も含めます。リファレンスセットとしてingenuity knowledge baseを選択します。次に、リファレンス分子のデータベースを選択します。

これには、すべての種、すべての細胞株および組織、およびすべての変異からのデータが含まれます。すべてのパラメータを選択した後、「networks」を選択してネットワーク解析を実行します。次に、「overlapping networks」を選択し、目的のネットワークをクリックして結果を確認します。

I-P-S-R-P-E細胞に分化したiPS細胞は、胎児RPE細胞と同様に、六角形の色素細胞形態という典型的なRPE表現型を示しました。未分化iPS細胞とI-P-S-R-P-E細胞のmicroRNA発現プロファイルを比較したところ、47個のmicroRNAがアップレギュレートされ、36個がダウンレギュレートされていました。一方、胎児RPE細胞では、I-P-S-R-P-E細胞と比較して61個のmicroRNAがアップレギュレートされ、49個がダウンレギュレートされていました。Ingenuity IPAソフトウェアを用いたパスウェイ解析により、差次的に発現したmicroRNAの標的遺伝子が、細胞の発達、増殖、および細胞周期を含む細胞プロセスに関与していることが示されました。また、この解析により、生体内の眼組織で発現するmicroRNAが、iPS細胞と比較してI-P-S-R-P-Eおよび胎児RPEにおいて濃縮されていることが示されました。本手順を行う際は、操作後のRNAサンプルのコンタミネーションおよび分解を防ぐことが重要です。

細胞の分化後、各細胞型におけるmicroRNAの発現レベルを確認するために、RT-PCRなどの他の手法を実施することができます。この技術により、視覚研究分野の研究者が、RPEにおける分化および細胞周期進行におけるmicroRNAの役割を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、iPS細胞からRPEを誘導する方法、およびiPS-RPEのmicroRNA発現プロファイルをiPS細胞および胎児RPEと比較する方法について、十分な理解を得ることができます。