Name: 使用フレクスナー赤痢菌オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶ Shigella flexneri感染におけるオートファジーと細胞骨格の相互作用を、in vitroの組織培養細胞とin vivoのゼブラフィッシュ幼生を用いて調査する方法です。セプチンケージ形成と細菌制御メカニズムの理解に役立ちます。

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SMの実験室での作業は、ウェルカム·トラストの研究キャリア開発フェローシップ[WT097411MA]でサポートされています。

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
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<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

組織培養細胞を用いてインビトロで自食作用および細胞骨格を監視する場合、セクション1および2に記載のプロトコルは、組織培養細胞型の多種多様に適用することができる。さらに、オートファジーに従うこと（ 例えば、ATG8 / LC3はオートファゴソームVEの+）と細胞骨格（ 例えば 、アクチンテイル、セプチンケージ）のライブイメージングを用い赤痢菌感染の間にリアルタイムでダイナミクスは、組織培養細胞は一過性にGFP-を使用してトランスフェクションすることができる、 RFP-またはCFP-タグ作成物以前に7,8に記載されているように。 赤痢菌に感染した細胞の割合を増加させるために（ すなわち 、リアルタイム分析のために一般的に望ましい赤痢100でHeLa細胞の5〜30％に侵入できることを考慮すると：1 MOI）、直接赤痢菌 400μlの（OD 600 = 0.3を追加-0.6）2ml中の細胞に、MEM（血清飢餓）と、十分な細菌のエントリの少なくとも1.5時間後に感染を待つファゴソーム、複製、AUからの脱出tophagy認識とセプチンのケージング。あるいは、アドヘシンAfaEを発現する赤痢菌 M90T AFAI株を使用し、M90T株28と比較して上皮細胞においてはるかに高い浸潤能力を有することができる。注目すべきは、M90T AFAI株はまだゼブラフィッシュを用いてインビボで試験されていない。 赤痢菌コロニーのプレートは、2〜3日間4℃に維持し、いくつかの実験のために使用することができる。しかし、時間をかけて、病原性プラスミドを失った赤痢菌のコロニーはまた、コンゴレッドを吸収し、それらの病原性プラスミドを保持しているように見えることがあります。このような理由から、私たちは、可能な場合は、新鮮な細菌株を使用することをお勧めします。 in vivoでの感染の細胞生物学を監視する場合、プロトコルは、セクション3と4の使用野生型ABラインゼブラフィッシュで説明。 赤痢菌 -leukocyte相互作用を監視するには、トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を使用することができ、 たとえば、MPX：GFPまたはLYZ：DsRedを視覚的にマクロファージ19,31を可視化するためにmCherryを：好中球19,29,30またはMPEG1を IZE。セクション3.8で説明したように生体内で自食作用を可視化するために、GFP-LC3ゼブラフィッシュトランスジェニック系統19,24を使用することができる。 インビボでオートファジーを摂動するために、効果的なモルホリノオリゴヌクレオチドの用量は、転写、スプライシングまたはタンパク質翻訳を阻害するその効率に基づいて実験的に評価されなければならない。これは、滴定実験を実行し、（スプライスモルホリノオリゴヌクレオチド用）、RT-PCRによって、あるいは（並進ホリノオリゴヌクレオチド用）、SDS-PAGE 32で枯渇を確認することをお勧めします。ゼブラフィッシュ胚または幼虫からのRNAの単離は、チオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出を用いて行うことができる。ゼブラフィッシュの幼生（8〜15幼虫/管）からタンパク質を抽出するために、機械的に200μlの溶解緩衝液（1 Mトリス、5 MのNaCl、0.5 M EDTA、0.01％オクチルフェノールエチレンオキシドコンデンスで乳棒を用いて均質化するeおよびプロテアーゼ阻害剤）。 15分間、4℃で19000×gで遠心分離管と新しいチューブに上清を移す。レムリ緩衝液を添加し、15分間、95℃でサンプルを加熱する。溶解物を、必要になるまで-80℃で保存することができ、セクション2.3で説明したようにウェスタンブロッティングによって評価することができる。 ゼブラフィッシュは、生体内の薬物アプリケーションのための優れたモデルです。モルホリノオリゴヌクレオチドを用いた分析は、自食作用を操作するための確立された薬物（ 例えば 、ラパマイシンおよびバフィロマイシン）で補完することができる。未感染及び/又は感染した幼虫は、ラパマイシン（1.5μM）またはバフィロマイシン（80 nM）のE2で希釈し、25,33に記載されるようにオートファジーフラックスウェスタンブロッティングによって評価することができるで処理することができる。 3.5節で説明したように、感染した幼虫の感染と生存の結果にオートファジー操作の結果を評価することができる。 宿主細胞を研究することに加えin vitroおよびin vivoプロトコルにおける決定因子は、 例えば 、 赤痢菌ΔicsAは （ 赤痢菌タンパク質 ICSAは、N-WASPを動員し、次にARP2 / 3、示差的オートファジーによって認識される細菌の変異株を用いて、オートファジー認識に必要な細菌の決定因子を評価するために適用することができるその非存在下での、その非存在下ではなく、アクチンテイル、ないセプチンケージ）とShigellaΔicsB（赤痢菌は、ICSAのオートファジー機械の動員を防止し、細菌のエフェクタータンパク質ICSB、経由オートファジー応答を回避することはありえない、アクチンテイルとセプチンケージ形成にもっとセプチンケージ、より多くのオートファジー）7,8がある場合もあります。 赤痢菌は、ゼブラフィッシュの自然な病原体ではありませんし、37℃で最適に成長する。しかし、仕事は赤痢菌の侵入に必要な病原性因子は、CY内貪食空胞およびレプリケーションから逃れることが示されているtosolを発現させ、28℃で19でゼブラフィッシュの幼生において機能的であることができます。 28°C、正常なゼブラフィッシュの開発23を確保するためにゼブラフィッシュ飼育し、標準温度で最も一般的に使用される温度である。驚くべきことに、（ すなわち 、マクロファージ細胞死、上皮細胞内に侵入し、乗算、細胞から細胞への拡散、ホスト上皮の炎症性破壊）ヒトで細菌性赤痢を引き起こす主要な病原性のイベントが忠実に赤痢菌感染のゼブラフィッシュモデルで再現されている19。 オートファジーと細胞骨格の遺伝子は、普遍的に発現し、生物学的機能の広い範囲を持っている。マウスの研究は、胚致死性であり、そしてこの問題は、ゼブラフィッシュが複数あるという事実によって低減することができるが、それは（これらの遺伝子のいくつかはまた、ゼブラフィッシュの開発のために不可欠であると思われる本質的なオートファジー26またはセプチン遺伝子のノックアウト5を示しているパラロガス遺伝子33）。もしそうであれば、（i）のオートファジーを調節する薬理学的試薬の使用および細胞骨格、（ii）のモルホリノを滴定することができ、（iii）の遺伝子のノックアウトは、特定のセルのために設計することができるなど、この問題を克服するためのいくつかの選択肢が存在し、タイプ、および/ ​​または（iv）は、動物の発達のために必須ではないオートファジー認識に関与する遺伝子（ 例えば 、P62）を標的とすることができる。 ゼブラフィッシュは、 赤痢菌感染時にオートファジーと細胞骨格を調査するための理想的なモデルシステムであるが、分子ツールは、現在不足している。フィールドは、新しいツールを生成し、目的のタンパク質の細胞特異的発現を駆動する必要がある。オートファジー/細胞骨格遺伝子の発現をノックダウンするために、新しいモルホリノ配列は必要とされ、ゲノム工学のための新規な方法（ 例えば 、ターレン、CRISPR / Cas9）を使用することもできる。一方、いくつかのツールは、以前に、ヒトまたはマウスの研究のために生成された同じようにゼブラフィッシュのために働くことがあります。 細胞内細菌S.赤痢菌は、免疫系1,2によって認識される細菌の能力を含む、生物学における主要な問題に対処する例外的なモデル生物として浮上している。宿主細胞は、S.の運動性を制限するセプチンを採用赤痢菌とオートファジーにそれらをターゲットに、細胞自律的な免疫7,8の重要な要素。これらの観​​察は、自食作用および細胞質細菌を分解する能力を研究するための新しい分子のフレームワークを提案する。主要な問題は、完全に、基礎となる分子や細胞のイベントを解読するために、関連する動物モデルを用いて、生体内での細菌感染の間、in vitroで分析し、これらのイベントを検証することになりました。この目的のために、ゼブラフィッシュは、S.の分析のための貴重な新しいホストとして確立されている赤痢菌感染19。細菌と宿主細胞間の相互作用は、高解像度で撮像することができる、及びゼブラフィッシュモデルは、 生体内で赤痢菌感染症の細胞生物学を理解するのに有用であることを証明する必要があります。ゼブラフィッシュの幼生は、宿主防御における細菌オートファジーの役割を調査するために使用することができ、かつ作業がオートファジーの摂動に悪影響シゲラ感染19に応答して宿主の生存に影響を及ぼし得ることが示された。 赤痢菌の研究から生成された観測は、組織培養細胞を用いたin vitroでケージやオートファジーをセプチンおよびin vivoでゼブラフィッシュの幼虫を使用すると、宿主防御を理解する上での基本的な進歩を提供することがあります。彼らはまた、感染症と闘うことを目的とし、新しい戦略の開発を示唆している可能性があります。 本報告書の重要な目的は、in vitroで解析し、分子および細胞事象の意味を理解することです（ つまり 、オートファジー、アクチンテイル、ケージングセプチン）ENTとの関連で、生体内での細菌感染の間にゼブラフィッシュの幼虫を使用して怒り生物。ゼブラフィッシュ生物学や取り扱いに慣れていない場合は、1が適切なゼブラフィッシュの飼育23の奥行きプロトコルおよびゼブラフィッシュの感染19,35 のin vivoでの分析に指すことができる。

赤痢菌赤痢 、グラム陰性浸潤性腸病原性細菌は、細胞質ゾルへのファゴソームから脱出し、細胞質ゾルの免疫応答を回避し、細胞内および細胞間移行1,2を促進するために、ホストアクチン細胞骨格を重合させることができる。 試験管 3,4 におけるアクチンベースの運動性の理解にもかかわらず、 生体内で細菌の普及を制限するメカニズムは完全に定義されていない。これは自然免疫と宿主防御のより完全な理解のために重要である。 セプチン、後生動物の中で、タンパク質の高度に保存されたファミリーは、ヘテロオリゴマー複合体に集合し、細胞膜と細胞骨格5,6関連付ける無極性フィラメントを形成するタンパク質を-結合グアノシン三リン酸（GTP）である。最近の研究は、感染した宿主細胞はautophに標的細菌を区画化することによって、シゲラアクチンベースの運動性を抑制することができることを発見したAGY内部の「セプチンケージ」、アクチンベースの運動性7,8に対抗する最初の細胞メカニズムを明らかに。調査の広いオープンフィールドは現在、「セプチン生物学と感染症」にある。多様な病原体によって誘導されたセプチンアセンブリ（ 例えば 、 リステリア·モノサイトゲネス7,9,10-、マイコバクテリウムマリナム7,8、カンジダ·アルビカンス 11）は 、宿主防御5,12における重要な課題として浮上することがあります。 オートファジー、高度に保存された細胞内分解プロセスは、原因リソソーム13,14にサイトゾル細菌を送達する能力を細胞自律的免疫の重要な構成要素と見なされる。しかし、細菌の複製を制限したり、促進するための生体内での細菌のオートファジーの役割は不十分15,16を理解したままになります。それは、光学的にアクセス可能であるため、ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ） は、感染症の研究のための脊椎動物のモデルとして登場しました幼虫の段階で自然免疫系はすでに17,18機能しているとき。最近の研究は、Sにゼブラフィッシュの幼虫の感受性を特徴としている赤痢菌 、細菌、オートファジー15パラダイム、およびin vivo 19 に抗菌治療のためのオートファジーの操作を研究するために赤痢菌 -zebrafish感染モデルを使用してきました。 このレポートでは、新しいツールやSを研究するためのアッセイを提供するオートファジーと細胞骨格との相互作用フレクスナー 。最初のステップでは、オートファジー細胞骨格相互作用をモニターするためのプロトコルは、ヒト上皮細胞株HeLaのシゲラ感染を用いて説明する。 インビトロでのシゲラ感染プロセスに対するオートファジー細胞骨格相互作用の役割を評価するために、自食作用および細胞骨格成分（siRNAまたは薬理学的試薬を使用して）操作する方法が提供される。新しい仕事は、 赤痢菌感染 oを使用することによってそれを示しているゼブラフィッシュの幼生fは、類似のアッセイは、 インビボでの感染の細胞生物学を研究するために適用することができる。ゼブラフィッシュの幼生を準備し、感染させるプロトコルは詳述され、そしてインビボでシゲラ感染に対する宿主応答を評価するために、宿主の生存および感染した幼虫の細菌負荷を決定するためのプロトコルが提供される。モルフォリノ（1-4細胞期の胚に注入）、オリゴヌクレオチドまたは薬理学的試薬を用いて赤痢にセプチンとオートファジーのマーカーの動員をモニターするための方法（固定またはゼブラフィッシュ幼生の生活のどちらかを使用して）およびin vivoでのこれらのプロセスの役割をテストするための方法[（ゼブラフィッシュ風呂の水に直接添加する）]についても説明します。この作業プログラムは、サイトゾル宿主応答による感染の制御に必要なメカニズムへの洞察を提供することが期待される。

<table><tbody><tr><td>バフィロマイシンA1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラー&nbsp;</td><td>ハーバード装置</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>粗い手動マニピュレーター&nbsp;</td><td>成重</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシン D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 ファインピンセット</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>N / A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヤギアリウサギIgG(H + L)抗体</td><td>モレキュラープローブ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEIトランスフェクション試薬</td><td>Polyplusトランスフェクション</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>ラトランクリンB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTekガラス底皿</td><td>MatTek株式会社</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM plus L-alanyl-L-glutamine&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>41090028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター&nbsp;</td><td>ナリシゲ</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー装置&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co.、ノヴァト、</td><td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗チューブリン、アセチル化抗体&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&nbsp;</td><td>分子プローブ</td><td>A12379</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ノールレッド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62 / SQSTM1抗体</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr>ラ<tr><td>パマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8781</td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD HDIP 含有封入剤&nbsp;</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

赤痢菌赤痢菌は、細胞質ゾルに到達するためにファゴソームから脱出し、その運動性と普及を促進するためのホストアクチン細胞骨格を重合させることができる細胞内の病原体である。新しい仕事は、アクチンベースの運動性に関与するタンパク質はまた、オートファジーは細胞自律的免疫に重要な細胞内分解プロセスにリンクされていることが示されている。驚くべきことに、宿主細胞は、S.のアクチンに基づく運動性を防止することができる細菌の内部の「セプチンケージ」を区画化し、オートファジーにそれらを標的とすることによってフレクスナー 。これらの観​​察は、セプチンのより完全な理解は、糸状GTP結合タンパク質のファミリーは、オートファジーのプロセスに新たな洞察を提供するであろうことを示している。このレポートは、Sに起因するオートファジー細胞骨格の相互作用を監視するためのプロトコルを記述フレクスナーインビトロ組織培養細胞を用いてin vivoでゼブラフィッシュの幼生を用いた。これらのプロトコルは、細胞内mechanisの調査を可能にする分子の細胞、および生物全体レベルでの細菌の拡散を制御するミリ。

インビトロでの組織培養細胞の感染の際に、S.ネリはファゴソームから脱出し、細胞質ゾルに侵入することができます。細胞質ゾルにおいて、宿主細胞は、セプチンケージ（ 図1A）の内側に細菌を区画化することにより赤痢菌のアクチンベースの運動性を防ぐことができます。セプチンケージによって捕捉された細菌はまた、オートファジーマーカーP62（ 図1B）およびLC3（ 図1C）で標識することができる。これらの観​​察は、侵襲性病原体の普及を制限する宿主防御の新規メカニズムを強調し、また、オートファジーと細胞骨格の間に新しいリンクを明らかにした。驚くべきことに、オートファジーマーカーの枯渇が著しく細菌（ 図2A）のセプチンのケージを低減し、作業もセプチンケージの枯渇が著しく、オートファジーマーカー8の動員を減少させることが示されている。したがって、少なくとも赤痢菌の場合には、ケージアセンブリとオートファゴソームをセプチン構成体nは相互に依存するプロセスとみなすことができる。セプチンケージによる赤痢菌の区画化のための他の細胞の要件は、アクチン重合およびアクトミオシン活性（ 図2B）が含まれる。 感染症の新たなモデル動物、ゼブラフィッシュの幼虫19の恩恵を受けることができない自然のマウス細菌性赤痢のモデル、および赤痢菌の病因、セプチン生物学および生体内での細菌のオートファジーの研究はありません。このようなインビボでの顕微鏡検査（ 図3A）のために尾静脈生存実験のための注射、および尾の筋肉注射などのさまざまな解剖学的部位における細菌を注入することにより、ゼブラフィッシュの幼虫を感染させることが可能である。用量に応じて、S.ゼブラフィッシュの幼虫に注入フレクスナーはどちらか48時間の感染後以内にクリアすることができ、または進行し、最終的に致命的な感染症（ 図3B - 3D）になることがあります。 赤痢菌の病原性ファのコンスは28℃、ゼブラフィッシュの最適な成長温度で表され、 赤痢菌によるゼブラフィッシュの感染は、III型分泌系（T3SS）19、ヒト疾患における必須病原性決定因子に応じ厳密に依存している。まとめると、これらの観察結果は、ゼブラフィッシュの幼虫は赤痢菌感染のin vivo分析のための貴重な新しいホストを表していることを示している。 ゼブラフィッシュ幼生の光アクセス性は、in vivoでのセプチンのケージ（ 図4A）、前哺乳類宿主モデルを使用して達成されたことがない成果の可視化を可能にします。セプチンケージが生体内で自食作用を標的とした細菌を捕捉するという証拠を補完するために、人は、GFP-LC3を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫に感染し、 赤痢菌 （ 図4B）にオートファジーマーカー補充を観察することができます。 in vivoでの赤痢菌オートファゴソームのultrastrucutral分析、EL用ectron顕微鏡は、明らかに二重膜小胞19による細菌の細胞質ゾル分画を表示するために使用することができる。オートファジーは、細胞自律的免疫及びintracytosolic細菌に対する重要な防御機構14-16の重要な要素と見られている。 インビボでオートファジー機能を特徴づけるために、P62のモルホリノで処理したゼブラフィッシュの幼生を使用することができる。コアオートファジー機械[ 例えば 。、36、オートファジー関連タンパク質（のATG）26]とは異なり、P62は、脊椎動物の発生27に必須ではないため、ゼブラフィッシュの幼虫は感染前に正常に開発することができます。驚くべきことに、P62-枯渇幼虫S.を接種大幅に増加し、死亡率の増加細菌負荷19におけるフレクスナー結果。セプチンケージアセンブリは、オートファゴソームの形成7,8と相互依存していることを示すin vitroの研究と一致して、 赤痢菌にセプチンの動員は明らかに（P62-枯渇幼虫低減される<strオング&gt;図4C）。これらのデータは、ゼブラフィッシュ生存率は、細胞内細菌感染を制御するために、p62を媒介自食作用に依存することを示している。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> インビトロでのセプチンケージ。図。（A）HeLa細胞を感染させたS.赤痢菌は、4時間40分間、固定し、SEPT9およびファロイジンに対する抗体で標識し、共焦点縮小コピーによって撮像された。スケールバーは、1μmである。（B）HeLa細胞を感染させたS.赤痢菌は、4時間40分間、固定し、P62とSEPT2に対する抗体で標識し、蛍光顕微鏡で画像化。スケールバーは、1μmである。（C）HeLa細胞を、GFP-ATG8 / LC3でトランスフェクトされたS.を感染させた4時間40分のためにフレクスナー 、固定、SEPT2に対する抗体で標識し、蛍光灯マイルにより撮像されたcroscopy。スケールバーは1μm。これらの図はMostowy ら 7から変更されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> シゲラ -septinケージの形成のための図2セルラー要件。（A）HeLa細胞をP62、ATG5、ATG6またはATG7 siRNAを、コントロール（CTRL）で処理した。 siRNAで処理した細胞の全細胞溶解物は、siRNAの枯渇（上）の効率を示すために、GAPDH、P62、ATG5、ATG6、またはATG7のために免疫ブロットした。 siRNAで処理した細胞は、Sに感染していた4時間40分のためにフレクスナー 、固定し、定量的な顕微鏡検査のために標識。グラフ（下）は処置当たりn個≥3実験からSEPT2ケージ内部の赤痢菌の平均±SEMの％を表す。（B）HeLa細胞は、Sに感染させたFD（CytD）サイトカラシン、DMSOで処理lexneri、ラトランキュリンB（LATB）、ノコダゾール（NOCO）、またはブレビスタチン（ブレブ）と4時間後に40分固定し、定量的な顕微鏡検査のために標識。グラフは、治療ごとに2つの独立した実験からSEPT2ケージの中に赤痢菌の平均％±SEMを表す。これらの数字はMostowy ら 7から変更されている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> 図3 赤痢菌感染のゼブラフィッシュモデル。実体顕微鏡下でゼブラフィッシュの幼虫の向きを説明するために、（A）画像。 （左のパネル）ゼブラフィッシュの幼生72時間後に受精は、その背側は、注射針を向けて射出プレートに横方向に配置した。 （中央パネル）血流感染がINJによって行った尾静脈内細菌（赤色溶液）をパソ、泌尿生殖器の開口部に後方。尾の筋肉内（右のパネル）感染は、体節の上の細菌（赤色溶液）を注入することにより行った。（B）72時間後の受精の幼虫の生存曲線をSのさまざまな投与量を注射フレクスナー及び48時間感染後、28℃でインキュベートした。効果的な接種材料は、低（&lt;10 3 CFU、白丸）、中（〜4×10 3 CFU、白三角）または高（〜10 4 CFU、白四角）に分類された。 nは％±SEM（横棒）≥3種菌クラスごとの実験の平均。個別の幼虫からホモジネート中の生菌（C）列挙さまざまな時期に、感染後、LB上にプレーティングすることにより測定された注、感染を生き残った唯一の幼虫を列挙分析に含まれています。これも図示±SEM（横棒）を意味する。（D）GFP- 赤痢菌の分布によって決定ライブイメージングさまざまなタイミングで蛍光実体顕微鏡を用いて低、中、高用量接種（尾静脈注射）を使用して、感染後。送信画像（灰色）およびGFP蛍光（緑色）のオーバーレイ（B） - （D）これらの図はMostowy ら 19から変更されている。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> in vivoでの赤痢菌感染症の細胞生物学。図。（A）ゼブラフィッシュの幼虫はSEPT7に対する抗体で標識された固定24時間GFP- 赤痢菌 （低用量）と尾の筋肉、、（赤）およびGFPに感染させ、（緑）、共焦点顕微鏡で画像化。スケールバーは5μm。（B）GFP-LC3ゼブラフィッシュの幼虫はmCherry- 赤痢菌 （中用量）のために感染させた4時間、固定、mCherryを（赤）に対しておよびGFP（緑）に対する抗体で標識し、共焦点顕微鏡で画像化。スケールバー、1.5μmのコントロール（CTRL;左画像）のいずれかで処理された（C）ゼブラフィッシュの幼虫。またはP62（右画像）モルフォリノは（、4時間（中用量）のために、GFP 赤痢菌に感染して固定し、SEPT7に対する抗体で標識した赤）およびGFP（緑色）に、共焦点顕微鏡で画像化。矢印は、セプチンケージ（CTRL）かに捕捉された赤痢菌のいくつかの例を強調4時間後に感染（P62は枯渇）。スケールバーは5μm。これらの図はMostowy ら 19から変更されている。

病原体の普及に対抗するために、宿主細胞には、細菌を区分し、オートファジーを誘導するそれらの細胞骨格を再編成する。組織培養細胞のシゲラ感染を使用して、このプロセスの基礎となるホストおよび病原決定因子が同定され、特徴付けられる。 シゲラ感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、発見された分子およびメカニズムの役割は、in vivoで調べた。

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

本手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ幼魚における組織培養細胞を用い、in vitro および in vivo で感染中の細菌拡散を制御する細胞内メカニズムを調査することです。in vitro 法では、まずグラム陰性で腸管侵入性の細菌病原体である Chlamydia trachomatis の調製から開始します。その後、宿主細胞に感染させ、siRNA または薬理学的試薬を用いて、感染中の宿主のオートファジー機構および細胞骨格を操作します。in vivo で Chlamydia が引き起こすオートファジーと細胞骨格の相互作用を研究するため、どちらの手法においても受精後3日目のゼブラフィッシュ胚に感染させます。最終ステップは、オートファジーおよび細胞骨格マーカーを用いて組織を標識することです。最終的に、これらの結果は細胞質における宿主応答による感染制御に必要なメカニズムへの洞察を与えることになります。リステリアなどの他の細菌よりもゲルを用いて細菌のオートファジーを研究することの利点は、ゲル標的オートファジーが開始ケージに捕捉され得る点にあります。この手法は、オートファジー分野における主要な疑問、例えば、オートファジーにおける細胞骨格の役割は何か、あるいは細胞内細菌の抑制または促進におけるオートファジーの役割は何か、といった問いに答えるのに役立ちます。本技術の意義は、ウイルスのオートファジーやミトコンドリアのオートファジーなど、他のオートファジープロセスへも展開でき、またセプチンやオートファジー成分が関与するヒト疾患に対する治療的意義も持ち得ます。これらはゼブラフィッシュを用いた実演です。ゼブラフィッシュへの細菌注入を含む手順は、針の準備や適切な注入に時間と高い精度を要するため、習得が困難であり、感染させる工程は極めて重要です。また、ゼブラフィッシュ感染の顕微鏡観察には経験が必要です。本プロトコルでは、凍結グリセロールストックから野生型株の _C. flexneri_ M9 DT を使用し、コンゴレッド添加トリプチケース・ソイ・アガープレートに細菌を画線し、37 °C で一晩培養します。また、翌日に HeLa 細胞を 10% 胎児牛血清含有 MEM 培地を用いて 6 ウェルプレートに播種します。その翌日、個別のコロニーをピックアップし、37 °C で振盪しながら TCS 培地で一晩培養します。新鮮な TCS で 1:80 に希釈し、継代培養を行います。600 nmにおけるサブカルチャーの吸光度が0.3から0.6の間になったら、1000 Gで5分間遠心分離して細菌を回収します。その後、細菌ペレットをMEMで再懸濁し、元の吸光度に戻します。HeLa細胞に、感染多重度（MOI）100で直接感染させます。MEMで希釈したchagをプレートに播種したHeLa細胞に加え、1ウェルあたりのMEMの総量を2 mLにします。次に、宿主細胞への細菌の付着を最大化するため、プレートを700 ×gで10分間遠心分離します。室温で30分間インキュベートし、細菌を細胞に感染させた後、感染期間を設けます。細胞を穏やかに2回洗浄します。細胞外の細菌をさらに除去するために新鮮なMEMを使用し、経験的な観察に基づいて、ジェンタマイシンを含む完全培地中で1〜4時間インキュベートします。次に、感染した細胞を固定し、ラベル付けします。63倍または100倍の対物レンズを用いたエピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察し、DAPIで標識されたセプチンケージを分解します。これらは、細胞質内でアクチンを重合させている細菌を囲む、直径約0.6 µmのリング状構造として視認できます。セプチンケージ内部の細菌は、P62、LC3、ATG8などのオートファジーマーカーによっても認識可能です。概念的に、この手順において最も困難な点は、in vivoおよびin vitroにおける細菌オートファゴソームおよびセプチンケージの同定であり、これには慎重な顕微鏡観察と解析が必要です。さらに、複数の生物学的反復において適切なイベント数が解析されていることを確認し、統計的有意性を確保する必要があります。HeLa細胞にChlamydiaを感染させた後、まず、細菌が細胞質に到達するまで少なくとも2時間半待機させます。次に、細胞骨格を処理するために薬剤処理を行います。陰性対照として、細胞を含む培地 2 mL ごとに、希釈した薬剤ストック液を 1～5 µL 添加します。細胞の 1 セットを MEM 中の DMSO で処理し、その後 30 分間インキュベートして、細胞のオートファジーフラックスを操作します。20 nM の rapamycin または 160 nM の bafimycin を使用してください。その後、処理後4〜12時間、細胞をインキュベートします。テキストプロトコルに記載されている通りに細胞を固定し、ラベル付けを行います。この手法は、in vivoにおけるゲルの感染とオートファジー細胞骨格の相互作用をモデル化したものです。継代培養を開始し、前述の方法でゲルを回収するため、細菌をXPBSで1回洗浄し、1000 Gで10分間遠心分離します。次に、細菌を0.1% Phenol red含有PBS 80 µLに再懸濁させます。この調製液は氷上で保持してください。予定している注入の72時間前に、1 nLあたり約2000個の細菌が含まれている必要があります。産卵したゼブラフィッシュから胚を回収し、細胞外の汚染物質を除去します。0.003% 漂白剤を含む E two medium で胚を10分間洗浄します。10分後、E two medium に交換し、胚を E two で5回洗浄します。次に、10 cm ディッシュに 50 mL の E two と、最大 50 個の胚を分注します。受精後24時間、28℃で計約100個の胚を育成します。顕微鏡観察の妨げとなるメラニン形成を防ぐため、発育中の胚を0.003%のPTUを含むE2培地で処理します。次に、E2培地に200 µg/mLのトリカインを添加した水槽を用いて、72時間後の稚魚を麻酔処理します。次に、マイクロマニピュレーターと精密ピンセットを使用して、マイクロインジェクション針の先端を折断し、顕微鏡下で折断状態を確認します。続いて、針の準備を行います。まず、細菌培養液の一滴を顕微鏡ステージ上のカバーガラスに滴下します。次に、マイクロインジェクターとガスシリンダーの電源を入れます。次に、針先を液滴の中に下ろします。そして4番目に、針に液体を吸い込み、cha感染時のゼブラフィッシュの生存率を評価します。細い絵筆を用いて、慎重に静脈内注射を行ってください。麻酔した幼虫を、背側が針に向くように注入プレート上に側方に配置します。次に、針先を尿生殖腔の近くに配置し、心嚢静脈に向けます。その後、皮膚を刺し、1〜5 nLの細菌ボルスを注入します。フェノールレッドが静脈に沿って広がるのが確認できれば、尾静脈への注入は成功です。技術的に、尾静脈への注入はこの手順の中で最も困難な部分であるため、ゼブラフィッシュ幼魚を用いた練習が必要です。また、幼魚の適切な固定が必要となるため、共焦点顕微鏡観察も困難な場合があります。注射後、感染させた各幼虫を、1 mLのE2培地を含む24ウェルプレートの各ウェルに個別に移します。プレートを28 °Cでインキュベートし、胚を毎日観察します。これは、セプチンおよびオートファジーマーカーのリクルートメントを可視化するためです。尾部筋肉などの局所部位にEllaを注入します。前のセクションで示した通りに、幼魚への注入準備を行います。ゼブラフィッシュを側面に向けて固定し、筋肉の上に針を置きます。次に、2つの体節の間の隙間に針を刺し、約1 nanoliterのEllaを注入します。尾部筋肉への注入に成功すると、注入した体節が赤色に染まります。これは、フェノールレッド緩衝液を使用しているためです。また、E2培地を用いて、37 °Cで0.1%低融点アガロースを調製しておきます。ガラスボトムディッシュに、アガロ（agarro）を1滴ずつ滴下します。注入済みの幼虫を最小限の溶液とともに、アガロの滴に移動させます。幼虫を好みの向きに調整し、アガロを凝固させます。次に、ディッシュ全体をLMAで覆い、続いてtricaを用いてE twoを添加します。その後、数時間にわたって2分ごとにZacksを採取します。感染した組織培養細胞において、shailaはファゴソームから細胞質へと脱出します。そこで宿主の細胞骨格が再構成され、セプチンによるケージ状の構造内に細菌が区画化されます。セプチンケージに閉じ込められた細菌は、P 62やlc threeなどのオートファジーマーカーによって認識されます。ゼブラフィッシュは、CHA感染のin vivo研究における有用な新しいホストとなります。感染量に応じて、ゼブラフィッシュは感染後48時間以内に低用量を排除するか、あるいは高用量の場合には感染により死に至ります。ゼブラフィッシュの光学的な透明性により、セプチンケージのin vivoでの可視化が可能となりました。これは、セプチンケージがオートファジーを標的とする細菌をトラップするという証拠を補完するために、他の脊椎動物モデルでは達成されていなかった成果です。GFP lc three トランスジェニックゼブラフィッシュに感染させ、lc three陽性オートファゴソームの細胞内chaへのリクルートをin vivoでリアルタイムに観察し、オートファジーの特性を解析しました。P 62 モルフォ処理した幼魚にchalaコントロールモルフォを注入したところ、正常なセプチンケージ構造が観察されました。しかしながら、P 62 morphoを処理した幼魚では、chalaへのセプチンのリクルートが減少しており、P 62がオートファジー機構の必須コンポーネントであることが示されました。感染を適切に制御できれば、本手順に従うことで、PHI幼魚の作成は1〜2日で完了します。ゼブラフィッシュのゲノム編集には、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集などの他の手法も利用可能です。さらに、新たな蛍光標識ゼブラフィッシュ系統を作製することで、ライブイメージングを用いて感染中のオートファジー細胞骨格のダイナミクスをリアルタイムで追跡することが可能になります。Chaga Septinケージは、オートファジーと細胞骨格の相互作用の研究に用いられており、感染症および細胞生物学の研究者がオートファジーにおける細胞骨格の新たな役割を解明するための道を切り拓いてきました。Ellaを扱う際は極めて危険な場合があるため、本手順の実施には常にレベル2のラボ環境で作業するなどの予防策を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ Shigella flexneri感染におけるオートファジーと細胞骨格の相互作用を、in vitroの組織培養細胞とin vivoのゼブラフィッシュ幼生を用いて調査する方法です。セプチンケージ形成と細菌制御メカニズムの理解に役立ちます。

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