用アメロゲニン - キトサンハイドロゲルの開発

本手順の総合的な目的は、表在性エナメル質再建のためのAMLOおよびキトサンハイドロゲルを作製するプロトコルを開発することです。これは、まずエッチング処理を施した歯片を準備し、次に、新鮮なAMLOおよびキトサンハイドロゲルを調製することで達成されます。

次に、AMLOおよびkitanハイドロゲルを歯切片の表面に塗布します。最後に、人工唾液中でAMLO chizenハイドロゲルを用いて歯のエナメル質を再成長させます。最終的に、超音波処理およびナノインデンテーションを用いて、新しく形成された層の機械的強度および天然のエナメル質への結合性を評価することができます。

本手法の意義は、成人および小児の罹患した歯のエナメル質に適用することで、初期う蝕病変を停止させ、う蝕により失われたエナメル質を再構築し、歯の構造を維持し、さらに虫歯の進行を防止する技術の開発にまで及びます。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクトラルフェローであるDr. Chittarが行います。まず、修復処置を受けていないヒトの第三大臼歯を選択することから始めてください。

水冷式の低速ダイヤモンドソーを用いて、歯冠を縦方向に厚さ2 mmの切片に切断し、その後、臼歯の根の部分を超音波洗浄機で除去します。切片を2分間洗浄し、その後、イオン水で3回すすぎ、酸蝕像を再現させます。2枚の切片を30%リン酸で30秒間エッチングします。

その後、すぐにイオン水で洗浄します。次に、エッチングした切片を再び2分間超音波洗浄し、イオン水で洗浄します。

さらに3回繰り返します。Kazanストック溶液を調製するには、まず1% w/v のKazanを1% v/v 酢酸溶液に溶解させ、次いで80 °Cで一晩攪拌します。

溶液を室温まで冷却した後、esanを0.45 µmフィルターでろ過し、1 M水酸化ナトリウムを加えてpHを5.0に調整します。カルシウムおよびリン酸塩のストック溶液を調製するには、塩化カルシウムを量り取り、0.1 M溶液を調製します。次に、溶液が透明になるまでボルテックスし、1 M水酸化ナトリウムを用いてpH値を11に調整します。

次に、ジバリン酸ナトリウムを秤量します。0.1 M溶液を調製し、溶液が透明になるまでボルテックスで混合します。AMLO Genin kaizanハイドロゲルを調製するために、200 µgの組換えブタAMLO geninを含むチューブに、調製したばかりの1%esan溶液を960 µL加えます。

その後、溶液が透明になるまでボルテックスします。次に、AMLO含有ozan溶液に0.1 M塩化カルシウム溶液を25 µL、続いて0.1 Mリン酸二ナトリウム溶液を15 µL加えます。溶液を5分間ボルテックスします。

次に、1 Mの水酸化ナトリウムを慎重に添加し、AMLOおよびozan溶液のpHを6.5に調整します。pH値が6.5に達すると、AMLOとozanのハイドロゲルが形成され、AMLOとazのエナメル質再成長を誘発するハイドロゲルとなります。まず、1 Mの水酸化ナトリウムを用いて人工唾液溶液のpHを7.0に調整し、溶液を4 °Cで保存します。その後、シリンジを用いて約20 µLのAMLOおよびchizenハイドロゲルを歯の切片の端に塗布し、室温のデシケーター内に保管します。

2時間後、唾液溶液に300 PPMのフッ化ナトリウムを添加し、その後、歯片を30 millilitersの溶液が入ったビーカーに移します。ビーカーをアルミ箔で覆い、37 °Cのオーブンに入れます。最後に、3～7日後に歯片を取り出し、室温のデシケーターに入れ、乾燥するまで放置します。AMLOおよびchizenハイドロゲルによる7日間の修復後、エッチングされたエナメル質表面に厚さ15 micrometersのエナメル質様層が形成されます。

新たに成長した層は、表面に対して垂直なc軸方向に優先的に成長した、直径約50 nanometersの高度に秩序化された結晶配列で構成されています。これらの針状結晶は、天然エナメル質の基本単位に似た束状に組織化されていることに注目してください。修復層の制限視野電子回折（SAED）像は、新しく成長した結晶の階層的な配向を示す弧状のパターンを示しています。

0 0 2方向に沿ったX線回折分析により、新たに成長した層がアパタイトで構成されていることが確認され、走査電子顕微鏡および制限視野電子回折の観察結果と一致して、結晶学的C軸に沿って配向していることが示されました。この画像では、新たに成長した層と天然エナメルの界面の微細構造が示されています。新たに成長した結晶は元のエナメル小晶と同方向には成長しておらず、タンパク質介在によるアパタイト成長の結果、天然エナメル結晶に対して新たに成長した結晶が垂直方向に配向していることに注目してください。新たに成長した層とエナメル基板との界面に明らかな隙間は見られません。

ナノスケールでは、エナメル質と再成長した結晶が融合し、継ぎ目のない界面を形成していました。10分間の超音波処理後、AMLO Geninキトサンハイドロゲル中で形成された新成長層は依然としてエナメル質表面に強固に結合しており、am mologenを含まないtizenハイドロゲルで処理した試料では組織構造が維持されていました。しかしながら、エナメル質と修復層の間に大きな隙間が観察され、新成長層と天然のエナメル質を明確に区別することができました。

本実験では、新生層内のAMLOゲニンを免疫蛍光染色し、新生層内に緑色蛍光が認められたことでAMLOゲニンの存在を確認した。グラフに示されている通り、酸エッチング後のエナメル質表面の硬度および弾性係数は、それぞれ約98%および88%低下した。AMLOゲニンを含まないozanハイドロゲルで処理した対照群では、硬度と弾性係数のいずれにおいても限定的な改善しか認められなかった。

対照的に、AMLOおよびozanハイドロゲルでミネラル化させた後、その作製後において、弾性率は約4倍、硬度は約9倍に増加することが観察されました。in vivoおよびさらなるモデル評価において、このプロトコルを拡張することで、初期う蝕やエナメル質侵食などのエナメル質欠損を治療するための技術を設計することが可能です。