プロテオームとトランスクリプトーム解析のための蜘蛛から毒の抽出と毒液腺Microdissections

本手順の全体的な目的は、トランスクリプトームおよびプロテオーム解析のために、クモから毒液を抽出して毒腺を摘出することです。まず、電気刺激により毒液を採取するために必要な器具と試薬を準備します。次に、解剖顕微鏡下でピンセットを用いてクモを固定し、麻酔をかけます。その後、クモに電流パルスを与え、放出された毒液をマイクロキャピラリーチューブで回収します。

最終ステップは、2〜3日後にクモの毒腺を摘出することです。最終的に、質量分析法またはその他のプロテオーム解析を用いて、毒に含まれる構成タンパク質の配列を明らかにします。毒の採取手順は、迅速かつ慎重に行うべき一連の協調的な動作を伴うため、習得が困難であり、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

まず、電気刺激装置の電源コードをコンセントに接続し、外部フットペダルを外部信号入力に接続します。次に、極性スイッチがノーマルモードになっていることを確認し、正極を電気刺激装置の赤色の出力端子に、負極を黒色の出力端子に接続します。その後、刺激装置を以下の推奨初期設定に設定します。

ワニ口クリップを電圧計の正極および負極のテストリードに接続し、電極の出力をテストします。次に、刺激装置の電源スイッチを入れ、フットペダルで電流を流します。液体プラスチックで片方の爪をコーティングして、フェザーウェイト鉗子を準備し、コーティングが乾燥するまで4時間待ちます。プラスチックが完全に乾燥した後、反対側の爪の先端から15 mmの範囲を綿の縫い糸で単層にきつく巻き付け、端を結んで糸を固定します。

次に、鋭利なハサミを用いて、鈍端皮下注射針の先端を切断します。このとき、クモを傷つけない程度に小さく、かつ詰まりを防ぐのに十分な大きさに切断してください。切断面をサンドペーパーで滑らかにし、針を真空廃棄トラップに取り付けます。その後、解剖顕微鏡の視野内で、磁気ベースに固定したビニール被覆の2本爪クランプを用いて、超軽量ピンセットを水平かつ密閉した状態で配置します。この際、プラスチック被覆の爪を上に、スレッド被覆の爪を下にして固定してください。

次に、糸の上流にある下側のpronged端子に正極のアリゲータークリップを取り付け、鈍端の金属製真空針に負極のアリゲータークリップを取り付けます。続いて、糸とアリゲータークリップの間にある鉗子のpronged端子に正極リードを、鈍端の真空針に負極リードを配置します。電圧計回路の電流を確認するためにフットペダルを押し、十分な電流が検出されることを確認した後、保護メガネを着用した状態でリードを取り除きます。

毒素回収用のマイクロキャピラリーチューブを数本用意します。次に、ペトリ皿にマウント用パテのストリップを置き、その上にマイクロキャピラリーを載せます。手袋を着用した手で、マイクロキャピラリーチューブの一端を固定し、もう一端を滅菌済みの金属製ピンセットで保持してブンゼンバーナーの炎にかざします。一端を固定したまま、もう一端を炎から引き離して先端を細長く伸ばします。解剖顕微鏡でマイクロキャピラリーの端を確認し、滅菌済みの金属製ピンセットを用いて、伸ばした端に小さな斜めの開口部を作製します。

チューブを閉じ、氷上に置きます。クモの不動化を開始するために、CO2チャンバーのガスをオンにします。次に、長い金属製ピンセットを用いて、クモを閉じたプラスチック製採集瓶からCO2チャンバーへと移します。

クモをチャンバー内に5〜10分間保持し、長いピンセットでそっとつついて、クモがもう動いていないことを確認します。次に、生理食塩水を入れた転送ピペットを使用して、ピンセットの先端を濡らします。

次に、麻酔されたクモを前脚でつまんでCO2チャンバーから取り出します。鈍端解剖鉗子と手袋を着用した手を用いて、麻酔されたクモをフェザーウェイト鉗子装置へ移動させます。その後、閉じた状態のフェザーウェイト鉗子の prong を開き、クモの頭胸部を prong の間に挟みます。

クモがしっかりと固定され、かつ潰されないように、 prong を閉じます。クモの背甲背面が thread 塗布済みの prong に接し、腹面がプラスチックコーティング側に向けられ、正極が下の prong に取り付けられていることを速やかに確認してください。次に、解剖顕微鏡の倍率、焦点、および光源を調整し、クモの鋏角と牙がはっきりと見えるようにします。毒液の採取を開始するため、バキュームを起動し、クモの毒腺に水をスプレーします。

2本目の鈍端針付きシリンジを用い、真空吸引針で水を吸引して不純物を除去します。次に、負極を接続した真空吸引針をクモの吻に接触させ、フットペダルでパルスを印加します。するとクモの脚が収縮し、牙から透明な液滴として毒液が現れます。

必要に応じて、逆流した液体を吸引して除去します。次に、マイクロキャピラリーチップを用いて毒液の液滴を回収し、そのチップを水が入った0.5 milliliterチューブに挿入して、水をキャピラリ内に吸い込ませます。この際、キャピラリでクモに穴を開けたり、キャピラリがクモの糸や接着物質で汚染されたりしないように注意してください。

次に、チューブアダプター付きの移送用注射器を、採取チップとは反対側のマイクロキャピラリーに取り付け、毒液溶液をチューブに戻し、チューブを氷上に置きます。毒液の入ったチューブは－80°Cで保存してください。毒液の採取が終了したら、蓋を開けたプラスチック製採取バイアルとキャップをクモの近くに配置します。迅速に移送するため、片方の手で持った鈍端解剖鉗子でクモの脚をそっと掴み、もう一方の手で極細鉗子を慎重に開きます。

次に、鈍端ピンセットを用いてクモを回収バイアルの中に滑り込ませます。そして、すぐにキャップを閉めます。毒液採取の2〜3日後、CO2チャンバー内でクモを麻酔し、液体窒素キャリアを満たして解剖顕微鏡の横に配置します。解剖エリアとピンセットをRNA awayで清掃してください。

次に、小型のシャーレに1xサリンクエン酸ナトリウムを満たし、解剖顕微鏡の下に置きます。続いて、クモをCO2チャンバーからシャーレに移し、ピンセットを用いて頭胸部を腹部から迅速に切り離します。その後、ピンセットで頭胸部を解剖顕微鏡の下で保持し、視界の中に複眼が来るように配置します。

2組目のピンセットの尖った端を使用して、carabaseとcollieryの側面を繋いでいる角質層を外側に向かって切断します。2組目のピンセットでcollieryを掴み、毒腺が引き出されるまで、ゆっくりと前後に引っ張ります。この操作は15分以内で完了させてください。

腺をコロニーから分離し、0.5 milliliterのクライオセーフチューブに移します。閉じたチューブを液体窒素に入れます。質量分析技術と、毒腺のCD NAから作成された配列データベースを統合することで、毒タンパク質の同定が可能となりました。質量分析を用いてブラックウィドウの毒から同定された36種類のタンパク質のうち、一つにLaro ineptペプチドがありました。

クロゴケグモのようなクモを扱う際は非常に危険を伴うため、本手順の実施中は常に保護手袋を着用するなど、十分な予防策を講じてください。