プロテオームとトランスクリプトーム解析のための蜘蛛から毒の抽出と毒液腺Microdissections

この手順の全体的な目標は、トランスクリプトームおよびプロテオミクス研究のためにクモから毒を抽出し、毒腺を解剖することですが、これは最初に電気刺激によって毒を収集するために必要な機器と試薬を準備することによって達成されます。2番目のステップは、解剖顕微鏡下で鉗子を使用して麻酔をかけたクモを固定することです。次に、クモに電流をパルス化し、放出された毒をマイクロキャピラリーチューブで収集します。

最後のステップは、2〜3日後にクモの毒腺を解剖することです。最終的には、毒の質量分析やその他のプロテオミクス分析を使用して、構成する毒タンパク質の配列を示します。毒の収集ステップは、迅速かつ慎重に実行する必要がある一連の協調的なアクションを伴うため、習得が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

まず、電気刺激装置の電源コードをコンセントに接続し、外部フットペダルを外部信号入力に取り付けます。次に、極性スイッチが通常モードになっていることを確認し、正極を電気刺激装置の赤い出力端子に接続し、負極を黒い出力端子に接続します。次に、刺激装置を次の推奨初期設定に設定します。

ワニ口クリップを正負の電圧計テストリードに取り付けて、電極出力をテストします。次に、刺激装置の電源スイッチをオンにし、フットペダルで電流を供給します。片方のプロングを液体プラスチックでコーティングしてフェザーウェイト鉗子を準備し、プラスチックが乾くまで4時間待ちます AP対向するプロングの先端の15ミリメートルを綿のミシン糸の単層でしっかりと包み、端を結び目で結んで糸を固定します。

次に、鋭利なハサミを使用して、クモを傷つけない程度に小さく、しかも目詰まりを防ぐのに十分な大きさの鈍い皮下注射針の先端を切ります。サンドペーパーで開口部を滑らかにし、針を真空廃棄物トラップに取り付けます。次に、解剖顕微鏡の視野の下で磁気ベースに固定されたビニールで覆われた2本のピンを使用して、フェザーウェイト鉗子を水平にしっかりと閉じた位置に配置します。

次に、正極ワニ口クリップを糸の上流の底端に取り付け、鈍い金属製の真空針に負極ワニ口クリップを取り付けます。次に、正のリード線を糸とワニ口クリップの間の鉗子のプロングに置き、負のリード線を鈍い真空針に置きます。電圧計回路電流をテストするには、フットペダルを押して十分な電流が検出されていることを確認し、保護メガネを着用した状態でリード線を取り外します。

毒液収集のためにいくつかのマイクロキャピラリーチューブを準備します。次に、取り付けパテストリップをペトリ皿に置き、マイクロキャピラリーをストリップに置きます。手袋をはめた手で、一方の端に1本のマイクロキャピラリーチューブを持ち、もう一方の端を滅菌金属鉗子でブンゼンバーナーの炎にかざし、端を炎から引き離して細長い先端を作り、もう一方の端を静止位置に保持しながら、マイクロキャピラリーの端を解剖顕微鏡で調べ、滅菌された金属鉗子で引っ張られた端に小さな斜めの開口部を作ります。

チューブを閉じて氷の上に置きます。クモの固定化を開始するには、CO2チャンバーガスをオンにします。次に、長い金属製の鉗子でクモを閉じたプラスチック収集バイアルからCO2チャンバーに移します。

クモをチャンバーに5〜10分間保管し、クモが動いていないことを確認します。長い鉗子で優しく突っ込みます。次に、生理食塩水を入れたトランスファーピペットを使用して、鉗子の糸を濡らします。

次に、麻酔をかけたクモをCO2チャンバーから回収します。鈍い解剖鉗子と手袋をはめた手を使用して、麻酔をかけたクモをフェザーウェイト鉗子装置に移動します。次に、閉じたフェザーウェイト鉗子のプロングを分離し、プロングの間にクモの頭蓋サックスを配置します。

クモがしっかりと固定されているが押しつぶされていないことを確認するために、プロングを閉じますクモが手の甲背側を下にして、糸でコーティングされたプロングの上に置かれ、車の腹側がプラスチックコーティングに面し、正極が下部プロングに取り付けられたままであることを確認します。次に、クモの鳴き声と牙がはっきりと見えるまで、解剖顕微鏡の倍率の焦点と光源を調整します。毒の収集を開始するには、真空をオンにし、スパイダーコリエに水を噴霧します。

2つ目の鈍い先端のシリンジニードルを使用して、真空針で水を吸引し、不純物を取り除きます。次に、負極のついた真空針をクモの吻に当て、フットペダルでパルスを送ります。クモの足が収縮し、牙から出てくる透明な液滴として毒が見えます。

必要に応じて、逆流物を掃除機で取り除きます。次に、マイクロキャピラリーチップで毒液滴を収集し、キャピラリーチップを水を入れた0.5ミリリットルのチューブに移し、キャピラリーに吸い込みます。毛細管でクモを穿刺したり、紡績物からの絹や接着剤で毛細血管を汚染したりしないでください。

次に、チューブアダプター付きトランスファーシリンジを採取先端の反対側の端にあるマイクロキャピラリーに取り付け、毒液をチューブに戻し、マイナス80°Cの毒液入りチューブにチューブを保管します。終了したら、毒の収集が終了したら、開いたプラスチック製の収集バイアルとそのキャップをクモの近くに置きます。迅速な移動のために、片手で持った鈍い解剖鉗子でクモの脚を慎重につかみ、もう一方の手でフェザーウェイト鉗子を慎重に開きます。

次に、鈍い鉗子でクモを収集バイアルにスライドさせます。そして、毒物収集の2〜3日後にキャップをすばやく閉じ、CO2チャンバーでクモに麻酔をかけ、液体窒素キャリアを満たして解剖顕微鏡の隣に置きます。解剖部位と鉗子をRNAできれいにします。

次に、小さなペトリ皿に1 x 生理食塩水クエン酸ナトリウムを入れ、解剖顕微鏡の下に置きます。次に、クモをCO2チャンバーからペトリ皿に移し、鉗子を使用して頭側タックスを腹部からすばやく分離します。次に、鉗子を使用して頭側タックスを解剖顕微鏡の下に保持し、炭鉱を視野に配置します。

2対目の鉗子の鋭い端を使用して、カラベースを炭鉱の側面に横方向に結合するキューティクルを切断します。2組目の鉗子で炭鉱をつかみ、毒腺が引き抜かれるまでゆっくりと前後に引っ張ります。15分以内で

腺を炭鉱から分離し、それらをクライオセーフな0.5ミリリットルチューブに移します。閉じたチューブを液体窒素に入れ、質量分析技術と毒腺CD NAから生成された配列データベースを統合します。ライブラリーにより、毒タンパク質の同定が可能になりました。Laro ineptペプチドは、質量分析法を使用してブラックウィドウ毒から同定された36のタンパク質の1つでした。

ブラックウィドウのようなクモを扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に保護手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。