Name: 新生児肝外胆管細胞を単離する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ新生児マウスの肝外胆管細胞単離法。コラーゲンゲル培養と免疫蛍光顕微鏡を用いて純粋な胆管上皮細胞を得る技術です。胆管の発生と病態研究に有用な手法を解説します。

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著者らは、消化器の分子研究UPenn NIDDKセンターの分子病理学とイメージングコアおよびイメージングの支援のための肝臓病（p30ポリDK50306）に感謝しています。この作品は、国立衛生研究所からの補助金（R01 DK-092111）によってサポートされ、フレッドとスザンヌBiesecker小児肝センター（RGW）と（SK）は小児肝疾患研究教育ネットワークの交わりによって行った。

特に断らない限り、全手順を室温で実施される。全ての動物の仕事は地元の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルの下で人道的な条件の下で行われるべきである。 1。機器の製造とソリューション<ol><li>組織培養フード、インキュベーター（ 図1A）に近接してマウス手術台をセットアップします。注意：必要とされる装置は、解剖顕微鏡、光源、12.5センチメートル長い直線アイリスはさみ、細かいチップを備えた6インチの非鋸歯状に湾曲した鉗子、湾曲した先端（ 図1B）と4インチの鋸歯状の鉗子が含まれています。 </li><li>手術台に70％アルコールのガラスビーカーに滅菌機器を配置します。 </li><li>無菌分離培地（ 表1）で3無菌60ミリメートルペトリ皿を埋める。手術台に2つ、フード内1、氷の上のすべてを置く。 </li><li>ラット尾コラーゲンを置き、滅菌した10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、滅菌水、滅菌1 N NaOHおよび組織培養フード内胆管上皮細胞（BEC）培地（ 表1）。注：コラーゲンは、氷の上でなければなりません。 </li></ol> 2。胆管の単離および培養<ol><li>意識不明の頸椎脱臼が続くまで、動物実験委員会のガイドライン（ 図1C）ごとに、二酸化炭素に曝露することによって、生命の0-3日の間、新生児マウスを安楽死させる。 注：高齢のマウスは、特定の実験の必要性に応じて使用することができる。 </li><li>仰臥位で動物を置き、骨盤の領域での正中線を横切る小さな横切開する。横方向にこの切開を拡張し、腹部の両脇まで、U字型のフラップを形成する。腹部臓器を露出するためにフラップを上げます。腹部が開いたら、慎重に肝臓のより良い視覚化のための動物の右側に腹腔と総胆管から腸を動かす。注：肝臓のより良好な識別を得るために、胸郭内に横方向の切開部を拡張する必要があるかもしれない。 </li><li>解剖顕微鏡を用いて、総胆管、肝臓、及び腸を識別する。構造は非常にデリケートであるとして、注意を使用して、最初に総胆管（図1D）を特定します。鋸歯状と非鋸歯鉗子で、細心の注意を払ってきれいで胆汁を取り巻く脂肪などの結合組織を狙い撃ち。きれいにダクトやその他を保持するために1鉗子を使用してください。 </li><li>胆嚢をきれいに同様の技術を使用しています。 </li><li>氷上の分離培地の最初の皿にきれいにダクトや胆嚢を配置します。メディアでさらに結合組織を除去し、胆嚢から胆汁を削除しながら、静かに非鋸歯鉗子で構造体をマッサージします。 </li><li>分離培地の第二の皿にダクトや胆嚢を転送します。 </li><li> 5匹の動物からのダクトや胆嚢の単離後、転送フード内の第三のシャーレにピース、。注：細胞は、5つ以上の動物から単離さする場合は、5匹の動物のグループごとに新鮮な溶液を使用して、バッチで行う。 </li><li>組織培養フードに厚いコラーゲンゲルを準備します。 注意：任意のサイズの皿を用いることができる。 5新生児のグループごとに3ミリリットルのコラーゲンの最終体積で60ミリメートル培養皿はうまく動作します。これは新たに単離したダクトを埋め込み時の新鮮な準備する必要があります。 <ol><li>氷上でラット尾部コラーゲン、無菌の10×リン酸緩衝生理食塩水（10×PBS）、無菌のdH 2 O、および滅菌1NのNaOHを置く。 </li><li>のdH 2 O、10×PBS、NaOHおよび1×PBS中で2 mg / mlのコラーゲンの最終濃度を有するゲルに必要なコラーゲンの体積を計算し、0.023倍に等しい1 NのNaOHの体積を用いたコラーゲンの量を添加した。注：コラーゲンの代替ソースを使用する場合、中和およびゲル形成のための製造業者の指示に従う。 </li><li>一緒のdH 2 0、1を混ぜるPBS、そして1N NaOHを0X、その後でも混合を確実にするだけでなく、コラーゲンとピペットを追加します。 </li></ol></li><li>コラーゲン溶液は、室温でゲル様コンシステンシーに増粘された後、直ちにコラーゲンダクトを埋め込む。 </li><li> 5％CO 2で30分間固化させたコラーゲンを可能にするために、37℃のインキュベーター内に置く。 </li><li>ゲルは、（透明から白への色変化）、BECメディア（ 表1）の3.5ミリリットルでオーバーレイを固化し、37℃、5％CO 2でインキュベートしたら。 </li><li> BECメディアを週に3回を削除し、3.5ミリリットルの新鮮な培地と交換してください。 </li></ol>太いコラーゲンゲルから3。遮音プライマリ胆管注：3週間以内に、胆管のシート（埋め込みダクトから直接伸び、大きな核を有する細胞）の厚さのコラーゲンに表示されます。皿中の線維芽細胞の多数が存在する場合、それは破棄されるべきである。皿のいくつかの領域がある場合は線維芽細胞成長は、これらが外科用メスで切り出し、前の胆管を分割に除去することができる。 <ol><li>薄いコラーゲンゲルを準備します。 <ol><li>滅菌PBSで1 mg / mlのコラーゲンの濃度に希釈する。注：100ミリメートル板に1ミリリットルを使用します。他のサイズの料理のためにそれに応じて調整してください。 </li><li>セルスプレッダー（大食器）またはピペットチップ（小皿）で均等にコラーゲン溶液を広げ、その後、10分間室温で残す。 </li><li>カバーDMEM/F12でプレートし、10分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。 </li><li>インキュベーターからプレートを取り外し、1×PBSで洗浄します。すぐに1X PBSを吸引除去する。 </li><li>プレートを回転させたり、シェーカー上のプレートを配置することによって拡散コラーゲンの第二の薄膜層で被覆する。 10分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。 </li><li>コラーゲン後DMEM/F12と、カバープレートを凝固し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol></li><li>目から細胞を分割ICKのコラーゲンゲル： <ol><li>それが浮遊しているように、細胞培養ヘラやセルスクレーパーで、プレートから静かにコラーゲンゲルをこすり。 </li><li> DMEM/F12に10 mg / mlのように入力XIコラゲナーゼ（素材リストを参照してください）​​で希釈することによりコラゲナーゼ溶液を調製する。よく混ぜ、滅菌フィルター。 </li><li>太いコラーゲン中の細胞の60ミリメートル皿当たりコラゲナーゼ溶液（上記）の1ミリリットルを追加します。 （3ミリリットルでなければなりません）BECメディアを抜かないでください。 37℃、5％CO 2で30分間皿をインキュベートする。 </li><li>細胞を含む溶液を除去し、15ミリリットルコニカルチューブに入れます。 </li><li> 5分間2200×gでスピンダウン。上澄み液を捨て、DMEM/F12の似た量のペレットを中断再。 </li><li> 5分間2200×gで再びソリューションをスピン。上清を取り除きます。 </li><li>再懸 ​​濁し、0.5％トリプシン3ml中のペレットを、5分間37℃、5％CO 2でインキュベートする。インキュベーション後、胆管のシートを分割する上下ソリューションをピペット。 BECメディアAの5ミリリットルを追加します。5分間1500×gでNDスピンソリューション。 </li><li> 5分間1500×gで解決策をスピンして、DMEM/F12中で上清を除去し、ペレットを再懸濁し。 </li><li>上清を除去し、BECメディア（ 表1）でペレットを中断して再。以前に行った薄いコラーゲンゲル上のプレートの細胞。 </li></ol></li></ol>細胞の4。通路及び保管注：必要に応じて薄いコラーゲンゲル上で細胞が分割することができる。 <ol><li>前10〜15分間、37℃で0.25％トリプシンでインキュベートする滅菌PBSでプレートを洗浄します。 </li><li> BEC培地の等量を中和し、5分間、1,500×gでペレット。その後、5分間1500×gでペレット化し、DMEM/F12でペレットを洗浄します。 </li><li>コラーゲンコーティングされた細胞培養皿に配布するためのBECのメディアに再懸濁細胞。 注：あるいは、細胞は、記憶媒体に再懸濁し、-80°Cの冷凍庫または液体窒素（ 表1）に記憶することができる。 </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する利害を持たないことを宣言します。

ここで説明するには、新生児を含むすべての年齢のマウスのマウスの肝外胆管、胆管から純粋に分離する技術である。技術は肝外胆管は、肝内胆管から別々に研究することができるという利点を提供しており、細胞のこれらの集団の主な違いを識別するための研究を容易にすることができる。我々は最近、この方法によって単離された肝外胆管に繊毛が減少し、アカゲザルロタウイルス8に感染研究実証を発表した。欠点は技術は労働集約的であり、細心の切開が線維芽細胞の汚染を防止する必要があることが挙げられる;さらに、成長および培養物中で少なくとも3週間は、ほとんどの実験のために十分な細胞を得るために必要とされる。従って、これらの細胞は、二次元培養に伴う変化を反映することができる。それはまだ得られた細胞集団は、幹細胞または細胞の有意な数を含むかどうか決定されていないperibiliary腺9,10からのS。 我々は、ラットから肝外胆管を隔離するためにこのメソッドを使用しようとしました。しかし、細胞は培養液中で成長することができなかった。主要な成長因子が培養培地中に存在しないか、他の条...

内および肝外胆管の起源と発展は著しく異なっている。肝臓は、腹側前腸内胚葉5の憩室から開発しています。頭蓋領域は肝内胆管5を生成しながら、憩の尾側領域は、肝外胆管を形成している。肝内胆管、ダクトは、ポータル周囲領域6に、管板の周囲に前駆細胞に由来する。これらの細胞は、肝細胞または胆管6のいずれかに分化する能力を有する。これはcholangiopathiesは、特に胆管の1カテゴリを標的にすることができることを考えると重要な臨床的意義を持っています。アラジール症候群は肝内管に影響を与えながら、例えば、胆道閉鎖症は、最初は、新生児の肝臓外管に影響を与えます。 マウスおよびラットの肝内胆管や胆管ユニットの単離の複数の記述がある。でvestigatorsは、ダクトの単離およびその後の伸長によって、または特定の細胞表面マーカーを発現している胆管1-4のダウン肝臓消化および抗体プルで単一細胞を単離した。官能偏胆管ユニットは、肝臓消化およびサイズ濾過7によって単離されている。胆管ユニットは、単離された胆管細胞は、インビトロで 1,2小管構造を開発することが示されているが、刺激して分泌液分泌7を実証するために応答することができる。これらの方法の制限は、消化酵素で、肝臓灌流のための専門的な技術的専門知識や特殊な装置の必要性があります。また、間葉系細胞3による汚染の危険性がある。 具体的には新生児肝外胆管から、肝外胆管胆管を単離する方法は、以前に記載されていない。本論文では、新生児Aを分離するために簡略化された手法の概要を説明純度の高いレベルで成人肝外胆管細胞として周知だ。この手法は、内および肝外胆管と肝外ダクトを伴う胆道閉鎖症などの病気のメカニズムの研究の違いの研究を促進する。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸を含む MEM</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-selenium</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>Na ピルビン酸</td><td>セルグロ</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml、BEC培地に使用</td></tr><tr><td>化学的に定義された脂質濃縮物</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml、BEC培地に使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>セルグロ</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml、BEC培地および500 &#956に使用。分離</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco /生命技術</td><td>15750-060</td><td>0.2ミリリットル、BEC媒体および500&#956で使用。分離</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>MEMビタミン溶液</td><td>Gibco/Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml、BEC培</td></tr>地で<tr>使用<td>大豆トリプシン阻害剤</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml、BEC培地で使用。溶媒はPBS、5 mg / mlに混合します ストック濃度</td></tr>L<tr><td>-グルタミン</td><td>セルグロ</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物</td><td>ジェミニ</td><td>500-102</td><td>1.1 ml、BEC培地で使用</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>D4902</td><td>0.5 ml、BEC培地で使用、ストックコンc 393 &#956;エタノールで希釈したg / ml、</td></tr><tr><td>3 3'、5-トリヨード-L-チロニン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml、BEC培地で使用、エタノールで希釈したストックコンク3.4 mg / ml</td></tr>、<tr><td>上皮成長因子</td><td>ミリポア</td><td>01-101</td><td>0.5 ml、BEC培地で使用、25 &#956;g/mL DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 mlで希釈し、BEC培地で使用し、ストック濃度0.411 mg/mlで使用し、DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 mlで希釈し、BEC培地および500 &#956で使用。l単離ラット</td></tr><tr><td>テールコラーゲン</td><td>BDバイオサイエンス354236</td><td></td>コラーゲン<td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USBコーポレーション</td><td>75889</td>の使用の濃度に応じて可変、<td>スターリー、コラーゲンを作るために使用され、使用される量はコラーゲン濃度</td></tr><tr><td>に依存しますdH2O</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>滅菌、コラーゲンを作るために使用され、使用される量はコラーゲン濃度</td></tr><tr><td>NaOHに依存します10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td> 1 <td>Nに希釈、滅菌、コラーゲンの製造に使用、使用量はコラーゲン濃度によって異なります</td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td> のコラーゲン濃度に依存します コラーゲンの種類 XI <td>DMEMで希釈し、滅菌フィルターで希釈してから使用前に</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml、最大10分間</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(10x) 0.5%</td><td>ギブコ/ライフテクノロジー</td>ズ <td>15400-054</td><td>3 ml、インキュベート最大 10分</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ645</td><td>その他のモデルも可能</td></tr><tr><td>光源(光ファイバーイルミネーター)</td> <td>ショット・フォステック</td><td>エース EKE LR 92240</td><td>その他のモデルも可能</td></tr><tr><td>12.5cmストレートアイリスハサミ</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td></td><td>その他のモデルも可能</td></tr><tr><td>6インチ非鋸歯状湾曲鉗子細い先端を持つ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td></td><td>他のモデルも可能</td></tr><tr><td>4インチ鋸歯状のステンレス製鉗子と細い先端</td><td>電子顕微鏡科学</td><td></td><td>その他のモデルも許容できる</td></tr></tbody></table>

新生児肝外胆管細胞を単離する

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

肝内および肝外胆管は、発生的に区別され、かつ差次特定の疾患によって影響を受ける可能性がある。しかし、内および肝外胆管、および新生児と成人細胞との間の相違点は、よく理解されていない。 肝内胆管から胆管細胞を単離するための方法は当1-4確立されている。これは明確な胆管集団間および肝外ダクトをターゲットに表示されるような胆道閉鎖症などの疾患を研究の違いを理解する上で非常に有益であるが、特に新生児の肝外管細胞の単離は、まだ記載されていない。ここで説明は、新生児および成人の両方のマウス肝臓外胆管細胞を単離するための最適化技術である。この手法は、線維芽細胞のような間葉系細胞から、最小限の汚染との純粋な細胞集団が得られます。 このメトDは、肝臓外管および胆嚢の除去に基づいて細心の解剖が続き、脂肪や線維芽細胞層を除去するスクレーピングされている。構造は、その後、トリプシン処理することができ、実験的な使用のためにメッキを再単層、内胆管の伸長を可能にするために約3週間のコラーゲン培養の厚い層に埋め込まれている。

K19の免疫蛍光染色（ 図2Aおよび2B）によって示されるように、優れた純度の新生仔マウスの肝臓外胆管細胞集団の単離は、このプロトコルの使用により、;我々は、成体マウスから細胞を単離する同様の結果を得る。我々はそれが厚いコラーゲンゲル上で単層を形成するために、新たに単離された胆管の細胞のための3週間かかりますことを観察した。胆管細胞は、孤立したダクトからの細胞のシートを形成し、厚いコラーゲン全体で直線的に成長する。単層が生い茂っなる前培養物は3週間前に分割されていない場合は、穴が細胞シートに表示されるので、細胞は、分割され、薄いコラーゲンゲル上で再播種する必要があります。最適な細胞増殖および線維芽細胞の汚染を最小限にするためには、切開及び洗浄工程（2.3、2.4）の間に細心の注意を払って慎重かつ繊細な肝臓外管を周囲の結合組織を除去することが重要である。線維の成長があった場合芽、メスまたは穏やかな吸引厚いコラーゲンの患部の除去は、従来の分割細胞への線維芽細胞の移動を減少させることができる。これらの細胞は、最初の3つの通路の間に急速に分裂するが、より高い通過点で、成長速度は遅くなり、細胞が大きいと空胞化と...

新生仔マウスの肝臓外胆管から胆管を単離するための技術が記載されている。ダクトは細心の注意を払って解剖し、その後、細胞が厚いコラーゲンゲル中で成長することによって単離される。この方法では、肝外胆管の開発および病理学を研究するための有用なツールを提供しています。

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

本手順の全体的な目的は、新生児ニューロン肝外胆管細胞を単離し、培養することです。まず、外科的に腹部臓器を露出させて肝臓と胆管へのアクセスを可能にすることでこれを達成します。手順の第2段階では、胆管と胆嚢の周囲にある結合組織と脂肪を細心に除去します。洗浄した胆管と胆嚢を厚いコラーゲンゲル上に配置し、3週間培養します。胆管から遊出した胆管細胞を、さらなる培養のために薄いコラーゲンゲルへと分割して移します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡により、純粋な胆管細胞の単層が形成されていることが確認されます。一般的に、この手法を初めて行う方は、解剖技術における技術的な困難や、細い胆管の洗浄に苦労することが多いです。本手順では、組織培養フードおよびインキュベーターの近くにマウス手術台を設置してください。滅菌済みの手術器具はすべて、70% ethanolを入れたビーカーに入れて準備します。培地を入れた60 mmディッシュ3枚を氷上に置きます。手術台では2枚のディッシュが必要になりますが、その他の材料はフード内に保持してください。コラーゲンは氷上に置いておく必要があります。まず、安楽死させた生後0日から3日の新生マウスを解剖台の上に仰向けに置きます。骨盤付近の正中線に沿って、小さな水平切開を加えます。切開線を両側に広げてU字型のフラップを作り、内臓を露出させます。次に、腸管を腹部の右側へ慎重にずらします。肝臓と胆管を観察するために、必要に応じて皮膚切開を広げてフラップを大きくしてください。解剖用実体顕微鏡下で、総胆管を慎重に同定し、周囲の組織を清掃します。結合組織と周囲の脂肪を除去します。次に、同様の操作を行います。胆嚢を洗浄するため、胆管と胆嚢を取り出し、用意しておいたディッシュのいずれかに移します。定量的でないピンセットを用いて組織をマッサージし、さらに結締組織を除去して胆汁を排出させます。その後、洗浄した組織を2枚目のディッシュに移します。ちょうど5匹の新生児から組織が回収されるまで、この手順を繰り返します。まず、高濃度のコラーゲンゲルを調製します。これは必ず最初に、新鮮な状態で作成してください。滅菌済みのすべての溶液を氷上に準備します。1X PBS 1 mLあたり2 mgのコラーゲンに必要な容量を算出します。コラーゲンの各容量に対し、0.023倍量の水酸化ナトリウムを加えます。室温でピぺッティングを行い、分注した液を混合します。コラーゲンを加える前に、PBS水酸化ナトリウムと蒸留水を混合させることが不可欠です。コラーゲンストックはゲルの最後に添加する成分とし、最終溶液はピペットで分注する必要があります。これにより、コラーゲンの凝集を防ぐことができます。溶液がゲル状になり始めたら、すぐに単離した組織を包埋し、包埋した組織をインキュベーターに移して30分間静置し、凝固させます。凝固後、ゲルの上に3.5 millilitersのBEC培地を重層し、そのままインキュベーションを継続します。BEC培地は週に3回交換してください。3週間以内に、包埋された導管から伸展した大きな核を持つ細胞シートが形成されます。これらが胆管細胞です。ディッシュに線維芽細胞が相当数混在しており、それらを取り除くことができない場合は、そのディッシュは廃棄してください。次に、1 mLのPBSあたり1 mgのコラーゲンを用いて薄いコラーゲンゲルを調製します。100 mmプレートに1 mLを塗布し、コラーゲンを均一に広げて10分間待ちます。10分後、プレートに7 mLのDM EMF 12を加え、10分間インキュベートします。短時間のインキュベーション後、コラーゲンを1回XPBSで迅速に洗浄します。吸引によってすべてのPBSを除去し、第1層の構築時と同様に、コラーゲンの第2層を添加します。凝固後、プレートにDMF 12を重ね、30分間インキュベートします。次に、厚いゲルから細胞を分離します。まず、スパチュラまたはスクレーパーを用いて、コラーゲンが浮き上がるようにプレートから慎重に剥離させます。次に、ろ過済みのコラゲナーゼ溶液を調製し、厚いコラーゲンが入った60 mmディッシュにそれぞれ1 mLずつ加えます。その後、プレートをインキュベーターに移します。30分間のインキュベーション後、細胞を含む溶液をすべて回収し、15 mLチューブに移します。チューブを遠心分離し、上清を吸引して除去します。ペレットを4.5 millilitersのDM F 12培地で再懸濁し、再度遠心分離します。ペレットを3 millilitersの0.5% Trypsinで再懸濁し、細胞を37 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。この間に細胞シートが剥離します。5分後、塊が分散するまで5 mLまたは10 mLのピペットでピペッティングします。その後、5 mLのBEC培地を加え、遠心分離して細胞を回収します。3回目の再懸濁を行います。洗浄工程として、ペレットをDMM F 12培地で懸濁し、再度細胞をペレット化します。次に、細胞をBEC培地で再懸濁し、準備した薄層上に播種します。コラーゲンゲル内で細胞を増殖させ、必要に応じてコラーゲンゲル上で細胞を継代します。記載されたプロトコルを用いることで、極めて純度の高い新生マウス肝外胆管細胞集団を単離し、K 19免疫蛍光染色で染色しました。このビデオを視聴することで、綿密な胆管切除と厚いコラーゲンゲル上でのアウトグロースを組み合わせ、純粋な新生マウス肝外胆管細胞集団を単離する方法について十分に理解できるはずです。

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新生児肝外胆管細胞を単離する

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