感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

本手順の全体的な目的は、時間分解STEPスキャンFTIR分光法を用いて、2つの光感受性膜タンパク質のプロトン化および構造変化のダイナミクスを調べることです。これはまず、水和タンパク質膜を形成し、バクテリオプシンでは全反射減衰（ATR）構成で、チャネルロドプシン2では透過構成で赤外吸収を測定することで達成されます。次のステップでは、適切な波長のナノ秒レーザーフラッシュで試料を励起してタンパク質内の光サイクル反応を開始させ、試料と相互作用する赤外光の強度における時間分解変化を検出します。

次に、2つの分割ビーム間の光路差を制御する干渉計の可動ミラーの不連続な位置において、完全な時間分解インターフェログラムが記録されるまで、上記の手順を繰り返します。最終ステップでは、フーリエ変換とランベルト・ベールの法則を用いて、時間分解インターフェログラムを時間分解IR差吸収スペクトルに変換します。最終的に、特にMI領域およびカルボキシ基のCO二重結合領域のバンドの時間変化を詳細に検討し、タンパク質のコンフォメーション変化およびプロトン化状態の変化のダイナミクスを解析します。

既存の多くの実験手法における本技術の主な利点は、タンパク質における一過性のプロトン化変化を解明できることです。さらに、タンパク質の機能を調べる上で最も重要な時間領域であるマイクロ秒およびミリ秒の時間スケールでこれを実現します。本手法は、タンパク質の機能メカニズムにおいてどの残基がいつプロトン化されるか、あるいはタンパク質の大きな構造変化がいつ起こるかといった、分子生物物理学およびタンパク質科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。

本手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチアソシエイトであるVictor Riaが行います。まず、減衰全反射（ATR）アクセサリーをFTIR分光計のサンプルチャンバーに装着します。従来のラピッドスキャンFTIR分光法を用いて、クリーンな内部反射素子表面の広範囲なエネルギースペクトルを4 cm⁻¹の分解能で測定します。その後、ATR表面に、後でサンプルの再水和に使用する高イオン強度緩衝液を20 µL添加します。

次に、バッファーのIR吸収を測定します。続いて、バッファーを取り除き、表面に触れないように水で洗浄します。強力な気流で残留した液体を除去し、表面上に6 mg/mLの細菌Rodin紫色膜タンパク質溶液を約3 µL滴下します。

タンパク質懸濁液を乾燥空気の緩やかな流れで、フィルム状になるまで乾燥させます。次に、乾燥フィルムの吸収スペクトルを測定します。その後、高イオン強度緩衝液を20～40 µLゆっくりと加え、乾燥フィルムを再水和させます。

水分の蒸発を防ぐため、A TRホルダーに蓋をします。その後、吸収スペクトルを測定します。フィルムの再水和後、バッファーの吸収スペクトルを差し引くことで、表面付近に残っているサンプルの割合を推定します。この時点で、低イオン強度バッファーで調製したデカルサイド溶解チャネルオプシン2を、直径20 mmのフッ化バリウムウィンドウの中央に10 µL添加します。

マイクロピペットのチップを用いて溶液を広げ、乾燥した空気の緩やかな流れを利用して、直径6〜8 mmの均一な温調フィルムを作成します。この直径は、最大絞りにおけるIRビームのサイズとおおよそ一致するようにします。次に、厚さ1 mmの平らなシリコンOリングを使用します。グリセロールと水の混合液を、乾燥フィルムの周囲に3〜5滴に分けて3〜5 µL添加し、フィルムを水和させ、2枚目のウィンドウでしっかりと閉じます。

フッ化バリウムのサンドイッチ窓をホルダーに挿入します。次に、ホルダーを試料室に設置します。吸収スペクトルを測定します。

A TRセットアップにおいて、アミドI領域の最大吸収が0.6から1.0の範囲にあることを確認します。A TR蓋の上に配置した光ファイバーを使用して、レーザーを試料に結合させます。試料におけるレーザーのエネルギー密度を、1パルスあたり2〜3 mJ/cm²に調整します。

パワーメーターまたは透過実験を用いて、ミラーでレーザーを試料まで導き、必要に応じてレンズを使用してレーザービームをコリメートまたは偏向させ、試料フィルムのサイズよりわずかに大きい直径に調整します。Qスイッチを用いて、レーザーパルスとデータ記録を同期させます。ネオジウムドープ・イットリウム・アルミニウム・ガーネット（Nd:YAG）レーザーの電子回路からのSync out TTLパルスを使用して、分光計のアナログ-デジタルコンバータをトリガーします。

時間分解測定を行うため、レーザーの励起率を設定する。1800から850 inverse centimeterのスペクトル範囲でステップスキャン測定を行う。1,950 inverse centimeter以上で不透過であり、1800 inverse centimeter以下で透過率の良いローパス光学フィルターを光路に配置する。

次に、検出器をAC結合モードからDC結合モードに変更します。この時点で、検出器にバイアス電流を印加し、INTERFEROGRAM（干渉計）のDCレベルをゼロにします。アナログ-デジタル変換器のダイナミックレンジをより有効に活用できるよう、電子ゲインを再調整してください。

次に、FTIR分光計のステップスキャンメニューを開始します。ステップスキャン測定のターゲットスペクトル帯域幅を、ヘリウムネオンレーザー波数の8分の1に設定します。スペクトル分解能を8 cm⁻¹、位相分解能を64 cm⁻¹にそれぞれ設定します。

appe関数を選択します。次に、INTERFEROGRAMの取得モードをsingle side forwardに設定します。分光計のA/Dコンバータのサンプリングレートを、利用可能な最高値に設定します。

実験のトリガーを外部（external）に設定します。次に、トリガー前の100ポイントを含む、記録する線形間隔のデータポイント数を設定します。続いて、ミラー位置ごとの光反応のコエディション数または平均回数を設定し、実験を開始します。

最後に、細菌およびredsinについて10回、channel redsin twoの3種類の異なるサンプルフィルムについて35回、実験を繰り返し、ミラーポジションあたり約200回の共添加を行ってください。細菌redsinのドライフォーム吸収スペクトルでは、ペプチド結合のアミド振動に由来する特徴的なバンドが判別可能です。低イオン強度の緩衝液を使用すると、フィルムが過度に膨潤し、エバネッセント場によってプローブされるタンパク質の量が減少します。フィルムの膨潤と緩衝液のイオン強度との正確な相関関係は、他の要因に加え、脂質の種類によって異なります。

水和後の膜の膨潤は、細菌のドシン（dosin）において安定状態に達するまで時間を要します。紫色の膜では、このプロセスは時定数12分で単一指数関数的に進行します。細菌を用いた典型的な時間分解ステップスキャンFDIR実験の3Dプロットです。

ここにRedsinを示します。特定の時点でスペクトルを抽出することが可能です。例えば、細菌のRedsinフォトサイクルにおいて、中間状態の個体数が最大になると予想されるタイミングなどで抽出します。

細菌性ロドプシンにおける、1,762 cm⁻¹での吸光度変化の時間追跡曲線は、Asp85のプロトン化・脱プロトン化ダイナミクスについて報告しています。また、1,741 cm⁻¹では、水素結合の変化およびAsp96の脱プロトン化・再プロトン化ダイナミクスについて報告しています。1,670 cm⁻¹および1,555 cm⁻¹における時間追跡曲線も示しています。

ペプチド主鎖のコンフォメーションに感受性を持つMI 1および2の振動の変化について報告する。この手法に続き、部位特異的変異導入や網膜酵素分光法などの他の手法を適用することで、開発後にタンパク質内の特定の残基に振動バンドを割り当てることが可能である。この技術は、分子生物物理学分野の研究者が、多くの異なる光駆動タンパク質の機能メカニズムを探索するための道を切り拓いた。