Name: 感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶ時間分解ステップスキャンFTIR分光法による感光性膜タンパク質のプロトン化ダイナミクスと立体配座変化の観測手法。ナノ秒レーザー励起と赤外吸収変化の計測により、タンパク質機能のミクロ秒からミリ秒スケールの動態を解明する。

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この作業は、ドイツ研究振興協会からJ.H.(FOR-1279, SFB-1078, B3)への助成金によって支援されました。トム・レスラーとビョーク・スースに感謝します。

1。一般的なサンプルの態様及び機器の準備<ol><li>時間分解ステップ走査測定のために装備商用FT-IR分光計を使用する。最良の結果を得るには、振動減結合テーブルの上にFT-IR分光計を配置。 </li><li>数ミリバールに光学区画を避難。乾燥した空気または窒素で試料室をパージします。 </li><li> FT-IR分光計のMCT検出器の前に可視光に対して不透明IR透明材料を配置します。この予防措置は、ステップ·スキャン実験中励起レーザパルスからのアーチファクトを防ぐために不可欠です。注：私たちは、直径25mmのゲルマニウム（Ge）ウィンドウを使用します。その高い屈折率は、望ましくない強度が大きく、反射防止コーティングでGeのフィルタを用いて回避し、失う原因となる。 </li><li>液体窒素でMCT検出器デュワーをクールダウン。注：光起電MCT検出器を使用は、それらの線形応答のphotoconductivesよりも好ましい、したがって、優れたphotometrさICの精度と信頼性をベースライン31,53。 </li><li>均質なタンパク質膜を形成するタンパク質懸濁液を乾燥しながら塩結晶の形成を防止するために低い（&lt;20 mM）のイオン強度の緩衝液中に少なくとも2 mgのタンパク質/ mlの実験に用いたサンプルを予め濃縮する。沈降サンプルについては、（リポソームまたは細胞膜パッチにおいて、例えば 、膜タンパク質）超遠心分離を適用することにより、それらを濃縮する/洗浄する。堆積物（ 例えば 、洗剤可溶化した膜タンパク質）をしないタンパク質のための適切なカットオフのセントリコンを使用してください。 </li><li>最適な結果を得るために使用します。可能な限り純粋でアクティブA）タンパク質製剤を、細胞膜パッチ内またはリポソーム中に再構成するタンパク質のための体重の3≤B）脂質/タンパク質比; C）洗剤可溶化したタンパク質のための体重の1≤洗剤/タンパク質比は。振動バンドタンパク質（ 例えば 、CHAPS）と重複洗剤や脂質の使用は避けてください。 </li></oL&gt; 2。 バクテリオロドプシン上の全反射減衰実験の準備を<ol><li> FT-IR分光計の試料室にATRアクセサリーをマウントします。注：私たちは5アクティブ反射でのZnSe /ダイヤモンドATRを使用しています。その光学特性は、可視光を励起レーザによって影響されるように、このようなATRアクセサリの内部反射素子（IRE）のようなゲルマニウムまたはシリコン等の半導体材料を避ける。 </li><li> 4センチメートル-1従来のラピッドスキャンFT-IR分光法によるクリーンIRE表面の解像度で広い範囲（約4,000-800 cm -1）でエネルギースペクトルを測定します。後の段階で吸収スペクトルを計算するために基準スペクトルとして、このスペクトルを使用する。 </li><li>試料（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために後で使用緩衝液20μlとATRのIREの表面を覆う。バッファのIR吸収を測定します。 </li><li>バッファを削除し、IRE表面WIをすすぐ目の水。表面に触れないようにしてください。強烈な空気の流れによってIRE表面から残留液を除去します。 </li><li> IREの表面の上に紫色の膜中のバクテリオロドプシンの〜3μL（BR）（〜6 mgのタンパク質/ mLの脱イオン水中）スプレッド（〜0.2センチメートル2エリア）。フィルムが得られるまで乾燥した空気の穏やかな流れの下でタンパク質懸濁液を乾燥させます。 </li><li> （ 図1参照）の乾燥フィルムの吸収スペクトルを測定する。 </li><li>静かにドライフィルム（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために、高いイオン強度の緩衝液を20〜40μlを加える。注：高イオン強度が探査された表面にできるだけ近い（ 図2）と同じくらいのタンパク質を保持することを可能にする、膜フィルムの過剰な膨潤を防止する。 </li><li>水の蒸発を防ぐために蓋付きATRホルダを覆う。必要に応じて、温度制御のために25℃に設定し、循環バスに接続されたカバー·ジャケットを置く。長いphotocycles（＆＃を有するタンパク質62;秒）、温度制御は、ベースライン安定性を高める可能性があります。 </li><li>吸収スペクトルを測定します。緩衝液（ 図3）の吸収スペクトルを差し引くことにより、フィルムの再水和後に表面近傍に残留する試料の割合を推定する。 </li><li>再水和後の5〜20分間隔（ 図4）で吸収スペクトルを記録することによって、フィルムの膨潤の安定化を確認する。この手順は省略可能ですが、推奨される。 </li></ol> 3。界面活性剤で可溶化したチャネルロドプシン2の伝送実験を実施 <ol><li>直径20mmのBaF 2をウィンドウの中央に5のNaCl、5mMのHEPES（pH7.4）でデシルマルトシド（DM）に溶解にChR2（〜10 mgのタンパク質/ ml）を10μlを追加します。 6〜8ミリメートル径（〜200μgの/ cm 2のタンパク質表面密度）をマイクロピペットチップの助けを借りて、それを広げた。 </li><li>フィルムUSIを形成乾燥した空気の穏やかな流れをngの。最良の結果を得るには膜が均一であり、およそ最大の開口部にIRビームのサイズと一致する直径を有していることを確認してください。 </li><li> 3-5で配布グリセロール/水の混合物の3〜5μLを添加することにより、フィルムの水和物は、ドライフィルムを中心に低下して、しっかりと≥1ミリメートルの厚さの平らなシリコーンOリングを使用して第二のウィンドウを閉じます。注：グリセロール/水混合物の比は、窓54との間の相対湿度を制御する。吸湿サンプルについては3月7日または2月8日グリセリン/（w / w）の水の比率を使用しています。グリセロール/水滴が膜タンパク質と直接接触してはいけません。 </li><li>ホルダー内のBaF 2に挟まれた窓を挿入します。水和したフィルムのサイズに一致する穴と、紙等のIR不透明材料、とのサンプル窓を覆うことにより、検出器に到達するのまっすぐ光を防ぐ。サンプルコンパートメント内のホルダーを配置します。 </li><li> 25℃にホルダの温度を制御する温度制御された循環バスに接続された恒温ジャケットによるC。 </li><li>吸収スペクトルを測定します。アミドI領域（〜1,700-1,620 cm -1）での最大吸収が0.6〜1.0の範囲内であることを確認してください。 </li><li>水、DM、代表膜タンパク質（ 図6）のための基準消衰係数スペクトルを用いて、水和フィルムの吸収スペクトルからの質量およびタンパク質/界面活性剤/水のモル比（ 図5）を推定する。 </li><li>水和レベルはステップ·スキャン実験（≥1時間）を実施する前に、安定するまで待ってください。 </li></ol> 4。調整と励起レーザの同期 光サイクルをトリガするために、YAGレーザ（λ= 532nm）を：BR上の実験のために、パルスのNdの第二高調波放射を使用しています。 OPによって提供されるのChR2を含む実験では、λ= 450nmの励起を使用：YAGレーザーの第三高調波のNd（λ= 355 nm）とによって駆動されるticalパラメトリック発振器（OPO）。レーザパルスが二光励起を最小限にするために（〜10ナノ秒）十分に短いことを確認してください。注：レーザパルスのエネルギーはできるだけ一定であるべきである。過渡現象記録装置に接続されたフォトダイオードでレーザの反射を測定し、応答（ 図8）を積分することによって確認されるように我々のセットアップでは、レーザ強度は、平均値の周りの10％≤変動する。 <ol><li>カップルサンプルへのレーザー。パワー·メータを使用して、パルス当たり2〜3ミリジュール/ cm 2のサンプルでのレーザーのエネルギー密度を調整します。 <ol><li> ATRのセットアップでは、ATRの蓋の上に置か光ファイバを使用してください。 </li><li>透過実験のために、試料にレーザーをもたらすためにミラーを使用して、必要に応じて、コリメートレンズのいずれか、またはわずかに試料フィルムサイズ上記直径にレーザ光を発散する。 </li></ol></li><li> LASEを同期させるR分光計によってデータ記録パルス。分光器をトリガする：YAGレーザーのNdエレクトロニクスのQスイッチシンク·アウトTTLパルスを使用してください。それぞれのbRは10 HzおよびChR2を0.25 Hzに：YAGレーザーのNdの励起レートを設定します。 </li><li>レーザー励起速度を制御するパルス遅延発生器（PDG）を使用する場合のNd繰り返し率：YAGレーザは容易に調整できません。 <ol><li> PDG外部トリガ入力に：YAGレーザーのNdランプシンク·アウトに接続します。レーザ発振をトリガするためにYAGレーザ：PDGは、Q-スイッチ同期中のNdの入力にTTLパルス出力を遅延〜190マイクロ秒を提供する。ゲートPDGだけ最後に受け入れトリガ（BrまたはChR2を4秒100ミリ秒）から一定時間後に外部トリガを受け入れます。 </li></ol></li></ol> 5。時間分解ステップスキャンの準備と設定<ol><li>光路にローパス光学フィルタを配置します。 1,800-85で時間分解ステップスキャン測定を行うに0センチメートル-1スペクトル範囲は、1950センチメートル-1を超えると1800センチメートル-1（ 図7）の良好な伝送（&gt;百分の50から80）で、フィルターの不透明を使用しています。 </li><li> ACからDC結合モードに検出器を変更します。注：この調整した後、インターフェログラム信号は、もはや周りのゼロが、DCレベルとして知られている値を中心に振動しません。 </li><li>より高い光子束及び、従って、より良好な信号対ノイズが、検出器の直線性限界内ための分光計の最大の可能なビームアパーチャを使用する。 </li><li>ゼロにインターフェログラムのDCレベルを持参し、アナログデジタル変換された（ADC）のダイナミックレンジをより有効に活用するために、電子ゲインを再調整。前置増幅器によって供給される信号に電圧バイアスを印加することでDCオフセットレベルを達成する。注記：このオプションは、近代的なFT-IR分光計に含まれています。そうでなければ、自家製の外部装置は、前置増幅器とADC 38の間に配置され、代わりに使用することができる。ケアはしてあるこのようなデバイスの電子機器は、高速かつリニアであることを確認する必要がありました。 </li><li> FT-IR分光計のステップ·スキャンメニューを起動します。 1,975.3-0 cmのステップスキャン測定対象のスペクトル帯域幅を設定し-1。少し光フィルタのカットオフを超え、He-Neレーザーの波数（ここでは1月8日目 ）の画分にスペクトル帯域幅を調整します。 </li><li>後の時間で反応速度の歪みを防止するために、任意の高域通過フィルタの電子を無効にします。そのカットオフ周波数が順またはADC（ノイズエイリアシングを低減する）のサンプリングレートを上回る場合、ローパス電子フィルタは有益であり得る。 </li><li> 8センチメートル-1と64 cmのスペクトルと位相解像度を設定し-1であった。前進片面にフェログラム取得モードを設定します。これらのオプションを1フェログラムは約500ポイントが必要です。 </li><li> 160 kHを、 例えば （分析計で利用可能な最高にADCのサンプリング·レートを設定Z、または6.25秒）。 「外部」、 すなわち 、「実験のトリガー」を設定し、レーザーがマスターです。 BR（最大42ミリ）7,000 20,000 ChR2を（最大125ミリ）のために：記録される直線等間隔のデータポイント数を設定します。注：より長い時間スケールは、データ取得38をトリガする波発生器から擬似対数的時間間隔を外部TTLパルスを用いてADCメモリをオーバーフローすることなく覆うことができる、又は内部ADC 31の代用品として二つの平行な過渡レコーダを使用することにより、 32。 </li><li>サンプルの暗状態のための基準として、約100プレトリガーポイントを保存します。注：ミリ秒の時間スケールでは、データの品質は、多くの場合、モバイル·ミラーの変動によって制限されます。 100の上方にプレトリガーポイントを増加させることは、従って、有意なデータ品質を改善することは期待されない。 </li><li>共同加算の回数を設定し、 すなわち 、ミラーPOSITあたりの光反応の平均数イオン。 bRのために、20の同時添加（10 Hzの励起速度での時間を計測する20分）を使用する。 ChR2を2共添加（0.25 Hzの励起速度での時間を計測する70分）を使用するため</li><li> bRのための実験の10倍を繰り返し、ChR2を3つの異なるサンプルフィルム上の35X、ミラー位置ごとに最終的に〜200の共同の追加を持っている。 </li></ol> 6。データ処理<ol><li>最初と最後の測定から得られた光誘起赤外差スペクトルを比較することにより、サンプルの状態を確認してください。差スペクトルの強度は最初の測定の60％を下回る任意の測定値を廃棄することを検討してください。 </li><li>記録された干渉画像を平均。 <ol><li> FTIR分光計からOPUSソフトウェアを使用して、平均して「スペクトル電卓」に追加し、時間分解干渉画像を選択します。 </li><li>インターフェログラムの平均を得るために、「=」をクリックしてください。 注：場合にはインターフェログラムの位相それは平均的な干渉画像またはシングルチャネルスペクトルに無関心で測定中は一定である。一定の位相を計算し、第一の位相スペクトル及び最後に記録されたインターフェログラムを比較することによって確認することができる。 </li></ol></li><li>フーリエ平均化時間分解単一チャネルスペクトルを得るために平均時間分解インターフェログラムの変換を行う。 <ol><li>ステップ6.2.1と同じソフトウェアを使用して、平均した時間分解干渉図形を選択し、「スペクトルと干渉図形」のアイコンをクリックしてください。メルツ位相補正方法、2のゼロ充填率（インストゥルメンタル解像度ごとに2つのデジタル点）、およびアポダイゼーション機能（ 例えば 、三角形、ブラックマン·ハリス3 -利用など）を使用してください。 </li><li>時間分解スペクトルに時間分解干渉画像を変換するために下の「変換」をクリックしてください。 </li></ol></li><li> 「データポイントテーブル」又はA」として時間分解単一チャネルデータをエクスポート; MATLAB」を使ってファイル &quot;OPUSソフトのアイコン&quot;として保存します。外部プログラムでのデータ処理を続行します。 <ol><li>レーザーの前に単一のチャネルスペクトルを平均化し、時間分解吸収差スペクトルを時間分解シングルチャネルのデータを変換します。 </li><li>レーザーの前の100シングル·チャネル·スペクトルの、ε、ノイズ標準偏差を用いて、波数の関数（ 図12）などの差スペクトルにおいて期待されるノイズ標準偏差のベクトルを計算し、平均値、S 0（ν）： ε/ S 0（ν）。 εの値は、連続した単一チャネルスペクトルを減算し、√2で補正標準偏差を計算すると推定される。 </li><li>の利用にはあまりにも騒々しいスペクトル領域を削除する（ たとえば 、1825センチメートル上記-1および850センチメートル下記-1）。 </li><li>準対数的に平均化（ 例えば 、20スペクトル/時間十年）を行います。 appearanデータのCEは改善し、スペクトルの数は、有意な情報がなくて〜10 2に〜10 4から減少します（ 図9）を失った。 </li><li>フーリエ補間を使用して（1ポイント/センチ-1）の点の4倍のスペクトル密度を増加させる（ゼロフィリングを掲示）。 注：私たちは、MATLABで実行されている自家製のプログラムの中で6.4.4に手順6.4.1を実行します。 </li></ol></li><li>特異値分解、SVD（ 図13）で得られた時間分解スペクトル（ 図10A）を処理する。有意なSVDコンポーネント（ 図10B）の限られた数のデータを再構成することによって、データノイズ除去を達成する。注：私たちは、ビルトインの「SVD」機能を使用して、MATLABでSVDを実行します。 </li></ol>

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

タンパク質上の時間分解ステップアンドスキャンFT-IR実験を行う際に考慮が必要な第一の側面の一つは、IR分光法に適した形態での試料の調製である。関心対象のタンパク質以外の物質からIR吸収を低減する必要があり、特に水からの。最も一般的なアプローチは、フィルムを形成するために、試料のバルク水を蒸発させることである。膜は、水溶液の一部滴を加えることにより又は制御された湿度の雰囲気に膜を曝露のいずれかによって再水和することができる。我々は、（ 図3および図5を参照）両方のケースでは、IR吸収分光法を用いて得られた水和レベルを推定することができる方法を示している。得られた水和レベルは、溶液中のものと比較して低い表示される場合がありますが、これらは機能的に関連するタンパク質の水和膜の研究を行う、実際に生きた細胞70に見られるものに近い。水の他に、知っていると、試料中の脂質または界面活性剤の量を制御することも重要である。両方とも、IR吸収を低減分光影響を与えるに十分に低く維持するが、目的のタンパク質の完全性および機能性を維持するのに十分に高くすべきである。 時間分解ステップ·スキャン分光法は、光によって再現可能にトリガできる可逆反応を示すタンパク質に対してのみ素直に適用されます（ただし、迅速なバッファー交換で、ステップ·スキャンをカップリングで進行状況を確認）71。反応工程スキャンにおいては、少なくとも〜500倍には8 cm -1の分解能で1,800-850 cm -1の領域を覆うインターフェログラムを完了するための最小数の再現可能である必要がある。しかし、実際には、付加的なデータ平均化は、一般的に雑音レベルを押し下げるために必要とされる。 200 co-additions/mirror位置（反応の10 5回の繰り返し）の場合は6.25秒解像度吸光度差スペクトルがノイズSTAを表示することができます伝送実験（ 図15）のために-5 2×10〜2×10 -4 ATRのための5×10 -6〜3×10 -5の間ndard偏差。その高い光子スループットのおかげで、トランスミッションは、ATR、成功裏などにChR2などの弱い吸収の変化を与えて、サンプルを研究するための重要な側面よりも〜7低い騒音レベルを可能にします。一方、ATRは伝送実験よりも5から25分のサンプルを必要とします。 時間分解ステップスキャンFT-IR分光法の適用は遅いphotocyclesを表示するタンパク質のための問題である。ステップ·スキャンによりインターフェログラムを記録することは、長い実用的になることができます。一部のソリューションは、多くの場合、増加したタンパク質摂取及び実験27,74複雑さを犠牲にして測定を高速化するために、複数の交換可能なサンプルを使用することに基づいて、このようなケース72,73に対処するために提示されている。場合によっては、元によってこの問題を回避することができる光サイクルを厳密に完了する前にサンプルを引用。 ChR2をするために、99％の回収のための光励起60秒後に必要とする光サイクルで、4秒での回復は、すでに80％の48のである。レーザパルス当たり10％の励起効率で、ChR2を分子の98％が0.25 Hzにレーザ繰り返し率で実験を行うことが可能となる、光励起後に暗状態4秒である。 データ処理は、可能な限り最高の結果を達成するために必要な最後の技術的な側面である。対数平均化は、ノイズを低減し、さらに重要な、歪みなしに特異値分解またはグローバルフィッティングを用いて、事後データ分析のための本質的な特徴をデータのサイズを減少させる。対数平均化は、しかし、測定中の携帯ミラーやその他の1 / fノイズ源（ 図9）の振動に起因する時間の痕跡の変動を平均で非常に成功していない。ベースラインにおけるこれらの変動ミリ秒の範囲内のノイズやデータの破損して品質を超えることができます。特異値分解は、ノイズを減らすためのデータの冗長性を活用し、いくつかの変更57で、それは同様に、ベースラインの変動を低減することができる。 最後に、時間分解ステップスキャンFT-IR実験の困難、最も時間のかかる部分は、バンドの割り当てにし、データのスペクトルと運動の解釈に対応しています。バクテリオロドプシンのIR差スペクトルに現れるバンドの多くは、数十年にわたる多くの研究者集団の累積仕事のおかげで割り当てられるか、または解釈されている。例えば、チャネルロドプシン2としてあまり研究された蛋白質、例えば、上記の時間分解IR実験は、部位特異的変異体に平行実験を伴い、機構的な解釈が48に到達するために相補的技術からの情報と組み合わされる必要がある。

完全タンパク質がその機能を実行する方法を解明するために、それらは、すなわち 、多くの場合、中間体の系列を含み、時間の数桁を拡張反応経路に沿って、動作するように、それらを測定する必要がある。タンパク質機能の重要なステップは、多くの場合、膜タンパク質の特定の骨格コンホメーション変化およびプロトン転送する反応において、時間範囲を1ミリ秒マイクロ秒で起こる。 X線結晶学、構造生物学の間違いなく柱は、膜タンパク質2と一緒に成長することが難しいことで知られ、よく回折するタンパク質結晶から静的な（時間平均）電子密度を提供します。まれに、水素原子の位置を含まないが、3D原子モデルは、電子密度に基づいて構築することができる。ラウエ回折3やフェムト秒X線パルス4のいずれかに依存し、時間分解X線結晶構造解析、の著しい進歩は、高い構造情報の中に、時間次元を追加X線結晶5にコヒーレント。しかし、技術的、分析的な課題はともかく、結晶格子は、バックボーン立体構造変化を損ない、タンパク質力学、タンパク質結晶5に基づく方法の避けられない欠点を変更することができます。限定された構造的な洞察力の全般的な欠点を持つが、フラッシュ光分解6,7によって開拓として、その結果、タンパク質の動的な側面は依然として最高の光学的方法で覆われている。 フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）は、タンパク質の構造、膜タンパク質8-11無数の静的な構造的および機能的な調査において活用最後の機能に貴重な感度の光学分光法の時間分解能を兼ね備えています。具体的には、FT-IR差分光法は、別の12月19日に1準安定状態からのタンパク質遷移などの小さなスペクトルの変化を研究するための理想的なツールであることが証明されています。 Studie単一分子レベル20,21以外でのタンパク質のダイナミクス、上のSは、同期のためのトリガのプロセスを必要とする。巡回光反応によるタンパク質の研究で行ったようにこの反応は、簡便、迅速かつ侵襲的にトリガとして光を使用していないが開始されます。良好なスペクトル分解能および適切な信号対雑音比を維持しながら、時間分解の研究に関連する主要な課題は、十分な時間分解能の達成である。また、十分に広いスペクトルおよび時間的な範囲をカバーすることが不可欠である。時間分解ステップスキャンFT-IR分光法は、公開された例が3,900-850 CMと同じ幅のスペクトル範囲をカバーする-1とダイナミクスは最大3.5センチメートル-1のスペクトルと時間の〜9桁を拡張して、これらの側面22の全てに優れそして30ナノ秒の時間分解能23-28。 フーリエ変換赤外分光計は、分散型のもの29以上のノイズを低減し、改善された測光精度を示している。 HowevER、通常の急速なスキャン記録モードでFT-IR分光計、干渉計の可動ミラーがスキャンを完了するために必要な最小時間の結果として≥5月10日ミリに限ら時間分解能に苦しんでいます。ステップアンドスキャン技術では、対照的に、動的イベントの時間依存性は、干渉計の走査期間から切り離される。簡単に説明すると、個別のステップでモバイルミラーが移動するのではなく、連続してスキャンを完了するためにスキャンする。これらのステップのそれぞれで（移動）ミラーが固定保持され、過渡が記録さ​​れる。従って、時間分解能は10〜100ナノ秒の範囲である水銀カドミウムテルル（MCT）検出器の立ち上がり時間によって制限される。実際には、（翼におけるセンターバーストと小信号中の強いシグナルを含む）インターフェログラムの大きなダイナミックレンジは、サンプリングをもたらす、できるだけ多くのビット16-24などとの適切なデジタルアナログ/デジタル変換器（ADC）のために必要と〜200 kHzのより高くはないレート（5秒）30。ナノ秒の時間分解能は、8〜12ビットのADCで十分である23,31-33れるインターフェログラムの変化のみを測定することによって達成することができる。時間分解ステップ·スキャンの技術的な側面30,34,35とアプリケーション36〜38は、他の場所で詳細に議論されてきた。 電流寄与の目的は、感光性膜タンパク質上の時間分解ステップアンドスキャンFT-IR分光法の実用性を説明するプロトコルを提供することである。透過と全反射減衰（ATR）：ここでは、この技術の性能は、2つのサンプリング方法のために示されている。 ATRの使用は、タンパク質の完全な水和状態を保証するだけでなく、試料のpHおよびイオン強度49,50の急性の制御を可能にするだけでなく、過剰な水の存在下での作業を可能にする。バクテリオロドプシンおよびチャネルロドプシン2：ステップスキャンの実験は、選択された2つのシステム上に示されている。 39,40のための多数の生物物理学的研究の対象となっている。ブロードの機能をFT-IR分光法の研究に適用される多数の技術の中では間違いなく最大の影響の1を与えてきた。すなわち、FT-IR分光法は、他の場所13,41,51占めたように、膜を横切るプロトン移動に関与してグループを解決するための鍵となっています。 チャネルロドプシン（CHR）は、自然界42,43で最初に見つかった光感受性イオンチャネルである。 CHRの光励起は、イオンチャネルの一過性の開口部をもたらす。その発見は、分子プロセスは、光44,45によって制御されている光遺伝学の発展の道を解決した。 CHRがはるかに少ないその機能的機構52について知られている、Brなど、微生物ロドプシンファミリーに限定bRは対照的に、属する。 ChR2をは、IOとしての機能を兼ね備えてプロトンポンプの活性46,47とnチャネル。最近、我々はイントラタンパク質プロトン移動反応およびChR2を48タンパク質骨格コンフォメーション変化のダイナミクスを解決するために、時間分解ステップアンドスキャンFT-IR分光法を適用した。

<table><tbody><tr><td>FT-IR分光器</td><td>Bruker</td><td>Vertex 80v</td><td>太陽光発電-MCT検出器、外部グローバル、オイルフリーポンプを装備。ファームウェア 2.3.</td></tr><tr><td>BaF2窓</td><td>korth Kristalle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond ATR アクセサリー</td><td>スミス検出</td><td></td><td>9反射 DuraDisk</td></tr><tr><td>サーモスタットバス</td><td>Julabo</td><td>F25</td><td></td></tr><tr><td>振動デカップリングテーブル</td><td>OPTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パルス Nd:YAG レーザー 第2高調波発生器付き</td><td>Continuum electro-Optics</td><td>Minilite&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>光パラメトリック発振器(OPO)</td><td>OPTA</td><td>BBO-355-VIS/IR S/N 1009</td><td></td></tr><tr><td>デジタルディレイ/パルス発生器&nbsp;</td><td>スタンフォードリサーチシステム</td><td>ズDG535</td><td></td></tr>パルス<tr><td>Nd:YAGレーザーと第3高調波発生器</td><td>Spectra-Physics</td><td>Quanta-Ray</td><td></td></tr><tr><td>さまざまな光学ミラーとレンズ</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPUS 7.0</td><td>Bruker</td><td></td><td>Vertex 80v分光計を制御するソフトウェア</td></tr><tr><td>MATLABランタイム</td><td>Mathworks</td><td></td><td>は、自家製の実行可能プログラムを実行するために使用されますデータの前処理</td></tr></tbody></table>

感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

タンパク質の機能の間にプロトン化し、タンパク質骨格コンフォメーション変化のダイナミクスを監視することは、そのメカニズムを理解するための重要なステップである。プロトン化およびコンフォメーション変化は、赤外線（IR）分光法の差によってプローブすることができ、どちらも、それぞれアミノ酸側鎖のペプチド結合の振動パターンを、影響を与える。その機能は繰り返し再現性と光によって誘発することができるタンパク質については、赤外線技術を変換するステップ·スキャン変換を用いて広いスペクトル範囲にわたって（サブ）マイクロ秒の分解能で赤外差スペクトルを得ることができる。の速度論に従うのに十分な、4 -光反応の〜10 2〜10 3反復で、最小数の合理的なスペクトル分解能及び帯域幅でスキャンを完了するために、吸収差スペクトルにおけるノイズレベルは約10限り低くすることができ単一のアミノ酸からプロトン化に変更されます。下段ノイズレベルは、より多くのデータの平均化および/または数学的に処理することによって達成することができる。最適な結果を得るために必要なタンパク質の量は、使用されるサンプリング技術に応じて、5〜100μgの間である。追加要件に関しては、タンパク質は、最初に低イオン強度緩衝液中で濃縮し、次いで膜を形成するために乾燥する必要がある。タンパク質膜は水のほとんどの小滴または制御大気湿度の下でいずれか、実験前に水和される。得水和レベル（タンパク質の水/ gをg）をIR吸収スペクトルから測られる。テクニックを披露するために、我々は、ネイティブ紫膜環境での光駆動プロトンポンプバクテリオロドプシンの光サイクルを学び、光感受性イオンチャネルチャネルロドプシン2の洗浄剤で可溶化した。

タンパク質機能の主要なステップ、特に骨格の構造変化とプロトン移動反応は、しばしばマイクロ秒からミリ秒の時間スケールで起こります。これらの動的プロセスは、特に光によって機能が引き起こされるタンパク質について、時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法によって研究することができます。

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

本手順の全体的な目的は、時間分解STEPスキャンFTIR分光法を用いて、2つの光感受性膜タンパク質のプロトン化および構造変化のダイナミクスを調べることです。これはまず、水和タンパク質膜を形成し、バクテリオプシンでは全反射減衰（ATR）構成で、チャネルロドプシン2では透過構成で赤外吸収を測定することで達成されます。次のステップでは、適切な波長のナノ秒レーザーフラッシュで試料を励起してタンパク質内の光サイクル反応を開始させ、試料と相互作用する赤外光の強度における時間分解変化を検出します。次に、2つの分割ビーム間の光路差を制御する干渉計の可動ミラーの不連続な位置において、完全な時間分解インターフェログラムが記録されるまで、上記の手順を繰り返します。最終ステップでは、フーリエ変換とランベルト・ベールの法則を用いて、時間分解インターフェログラムを時間分解IR差吸収スペクトルに変換します。最終的に、特にMI領域およびカルボキシ基のCO二重結合領域のバンドの時間変化を詳細に検討し、タンパク質のコンフォメーション変化およびプロトン化状態の変化のダイナミクスを解析します。既存の多くの実験手法における本技術の主な利点は、タンパク質における一過性のプロトン化変化を解明できることです。さらに、タンパク質の機能を調べる上で最も重要な時間領域であるマイクロ秒およびミリ秒の時間スケールでこれを実現します。本手法は、タンパク質の機能メカニズムにおいてどの残基がいつプロトン化されるか、あるいはタンパク質の大きな構造変化がいつ起こるかといった、分子生物物理学およびタンパク質科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチアソシエイトであるVictor Riaが行います。まず、減衰全反射（ATR）アクセサリーをFTIR分光計のサンプルチャンバーに装着します。従来のラピッドスキャンFTIR分光法を用いて、クリーンな内部反射素子表面の広範囲なエネルギースペクトルを4 cm⁻¹の分解能で測定します。その後、ATR表面に、後でサンプルの再水和に使用する高イオン強度緩衝液を20 µL添加します。次に、バッファーのIR吸収を測定します。続いて、バッファーを取り除き、表面に触れないように水で洗浄します。強力な気流で残留した液体を除去し、表面上に6 mg/mLの細菌Rodin紫色膜タンパク質溶液を約3 µL滴下します。タンパク質懸濁液を乾燥空気の緩やかな流れで、フィルム状になるまで乾燥させます。次に、乾燥フィルムの吸収スペクトルを測定します。その後、高イオン強度緩衝液を20～40 µLゆっくりと加え、乾燥フィルムを再水和させます。水分の蒸発を防ぐため、A TRホルダーに蓋をします。その後、吸収スペクトルを測定します。フィルムの再水和後、バッファーの吸収スペクトルを差し引くことで、表面付近に残っているサンプルの割合を推定します。この時点で、低イオン強度バッファーで調製したデカルサイド溶解チャネルオプシン2を、直径20 mmのフッ化バリウムウィンドウの中央に10 µL添加します。マイクロピペットのチップを用いて溶液を広げ、乾燥した空気の緩やかな流れを利用して、直径6〜8 mmの均一な温調フィルムを作成します。この直径は、最大絞りにおけるIRビームのサイズとおおよそ一致するようにします。次に、厚さ1 mmの平らなシリコンOリングを使用します。グリセロールと水の混合液を、乾燥フィルムの周囲に3〜5滴に分けて3〜5 µL添加し、フィルムを水和させ、2枚目のウィンドウでしっかりと閉じます。フッ化バリウムのサンドイッチ窓をホルダーに挿入します。次に、ホルダーを試料室に設置します。吸収スペクトルを測定します。A TRセットアップにおいて、アミドI領域の最大吸収が0.6から1.0の範囲にあることを確認します。A TR蓋の上に配置した光ファイバーを使用して、レーザーを試料に結合させます。試料におけるレーザーのエネルギー密度を、1パルスあたり2〜3 mJ/cm²に調整します。パワーメーターまたは透過実験を用いて、ミラーでレーザーを試料まで導き、必要に応じてレンズを使用してレーザービームをコリメートまたは偏向させ、試料フィルムのサイズよりわずかに大きい直径に調整します。Qスイッチを用いて、レーザーパルスとデータ記録を同期させます。ネオジウムドープ・イットリウム・アルミニウム・ガーネット（Nd:YAG）レーザーの電子回路からのSync out TTLパルスを使用して、分光計のアナログ-デジタルコンバータをトリガーします。時間分解測定を行うため、レーザーの励起率を設定する。1800から850 inverse centimeterのスペクトル範囲でステップスキャン測定を行う。1,950 inverse centimeter以上で不透過であり、1800 inverse centimeter以下で透過率の良いローパス光学フィルターを光路に配置する。次に、検出器をAC結合モードからDC結合モードに変更します。この時点で、検出器にバイアス電流を印加し、INTERFEROGRAM（干渉計）のDCレベルをゼロにします。アナログ-デジタル変換器のダイナミックレンジをより有効に活用できるよう、電子ゲインを再調整してください。次に、FTIR分光計のステップスキャンメニューを開始します。ステップスキャン測定のターゲットスペクトル帯域幅を、ヘリウムネオンレーザー波数の8分の1に設定します。スペクトル分解能を8 cm⁻¹、位相分解能を64 cm⁻¹にそれぞれ設定します。appe関数を選択します。次に、INTERFEROGRAMの取得モードをsingle side forwardに設定します。分光計のA/Dコンバータのサンプリングレートを、利用可能な最高値に設定します。実験のトリガーを外部（external）に設定します。次に、トリガー前の100ポイントを含む、記録する線形間隔のデータポイント数を設定します。続いて、ミラー位置ごとの光反応のコエディション数または平均回数を設定し、実験を開始します。最後に、細菌およびredsinについて10回、channel redsin twoの3種類の異なるサンプルフィルムについて35回、実験を繰り返し、ミラーポジションあたり約200回の共添加を行ってください。細菌redsinのドライフォーム吸収スペクトルでは、ペプチド結合のアミド振動に由来する特徴的なバンドが判別可能です。低イオン強度の緩衝液を使用すると、フィルムが過度に膨潤し、エバネッセント場によってプローブされるタンパク質の量が減少します。フィルムの膨潤と緩衝液のイオン強度との正確な相関関係は、他の要因に加え、脂質の種類によって異なります。水和後の膜の膨潤は、細菌のドシン（dosin）において安定状態に達するまで時間を要します。紫色の膜では、このプロセスは時定数12分で単一指数関数的に進行します。細菌を用いた典型的な時間分解ステップスキャンFDIR実験の3Dプロットです。ここにRedsinを示します。特定の時点でスペクトルを抽出することが可能です。例えば、細菌のRedsinフォトサイクルにおいて、中間状態の個体数が最大になると予想されるタイミングなどで抽出します。細菌性ロドプシンにおける、1,762 cm⁻¹での吸光度変化の時間追跡曲線は、Asp85のプロトン化・脱プロトン化ダイナミクスについて報告しています。また、1,741 cm⁻¹では、水素結合の変化およびAsp96の脱プロトン化・再プロトン化ダイナミクスについて報告しています。1,670 cm⁻¹および1,555 cm⁻¹における時間追跡曲線も示しています。ペプチド主鎖のコンフォメーションに感受性を持つMI 1および2の振動の変化について報告する。この手法に続き、部位特異的変異導入や網膜酵素分光法などの他の手法を適用することで、開発後にタンパク質内の特定の残基に振動バンドを割り当てることが可能である。この技術は、分子生物物理学分野の研究者が、多くの異なる光駆動タンパク質の機能メカニズムを探索するための道を切り拓いた。

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このビデオでは、フーリエ変換赤外分光法を使用して、アミロイドペプチドの自己組織化をベータシートに富む超分子構造に示します。屈折率の高い結晶に赤外線ビームを通過させ、結晶とサンプルの界面を横切るエネルギー吸収を記録します。サンプルタンパク質の二次構造は、赤外スペクトルの特定の領域で特徴的な吸収ピークを分析することによって同定され、超分子アセンブリの形成の同定に役立ちます。...

ペプチド自己組織化を研究するためのフーリエ変換赤外分光法

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本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。...

中性子スピンエコー分光法 による タンパク質ダイナミクスの研究

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タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

学ぶ時間分解ステップスキャンFTIR分光法による感光性膜タンパク質のプロトン化ダイナミクスと立体配座変化の観測手法。ナノ秒レーザー励起と赤外吸収変化の計測により、タンパク質機能のミクロ秒からミリ秒スケールの動態を解明する。

感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

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