感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

この手順の全体的な目標は、時間分解ステップスキャンFTIR分光法オコピーを使用して、2つの光感受性膜タンパク質のプロトン化と確認変化のダイナミクスを調査することです。これは、まず、バクテリアオプシンの減衰全反射配置、またはチャネルロディン2の透過構成のいずれかで赤外線吸収がプローブされる水和タンパク質膜を形成することによって達成されます。第2のステップは、適切な波長のナノ秒レーザーフラッシュでサンプルを励起し、タンパク質内で光環状反応を開始し、サンプルと相互作用する赤外光の強度の時間分解変化を検出することです。

次に、上記のプロセスを干渉計のモバイルミラーの離散位置で繰り返し、2つの分割ビーム間の光路差を制御して、完全な時間分解インタフェログラムが記録されるまで行います。最後のステップは、フーリエ変換とランバートビールの法則を使用して、時間分解インタフェログラムを時間分解IR差分吸収スペクトルに変換することです。最終的に、バンの時間発展、特にMI領域とCO二重結合カルボン酸領域で、タンパク質の確認およびプロトン化変化のダイナミクスを取得します。

この手法の主な利点は、タンパク質の一時的なプロトン化変化を解決できることです。さらに、タンパク質の機能を調べるのに最も関連性の高い時間範囲であるマイクロおよびミリ秒の時間スケールでそれを行います。この方法は、プロトン酸がどの残基で、タンパク質の機能メカニズムやタンパク質の大きな変化がいつ起こるかなど、分子生物物理学およびタンパク質科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

手順のデモンストレーションは、私の研究室のVictor Ria研究員によって行われます 最初に、減衰全反射率またはTRアクセサリをFTIR分光計のサンプルコンパートメントに取り付けます。4 逆センチメートルで広範囲のエネルギースペクトルを測定します。従来の高速スキャンFTIR分光法によるクリーンな内部反射素子表面の分解能は、後でサンプルを再水和するために使用される20マイクロリットルの高イオン強度バッファーでA TRの表面を覆います。

次に、バッファーのIR吸収を測定します。次に、バッファーを取り外し、表面に触れずに水ですすいでください。表面の上部に紫色の膜で細菌ロダンの6ミリグラム/ミリリットルのタンパク質溶液の約3マイクロリットルを広げる強烈な気流によって残留液体を除去します。

タンパク質懸濁液を乾燥空気の穏やかな流れの下で、フィルムができるまで乾燥させます。次に、ドライフィルムの吸収スペクトルを測定します。これに続いて、20〜40マイクロリットルの高イオン強度緩衝液を穏やかに加え、乾燥フィルムを再水和します。

A TRホルダーを蓋で覆い、水分の蒸発測定と吸収スペクトルを防ぎます。フィルムの再水和後に表面近くに残っているサンプルの割合を、バッファーの吸収スペクトルを差し引いて推定します。この時点で、直径20ミリメートルのフッ化バリウムウィンドウの中央にある低イオン強度のバッファーにdecアルサイドに溶解したチャネルオプシン2の10マイクロリットルを追加します。

マイクロピペットチップを使用して、最大開口部でのIRビームのサイズとほぼ一致する直径を持つ乾燥空気温かみのある均質フィルムの穏やかな流れを使用して、溶液を直径6〜8ミリメートルに広げます。次に、厚さ1mmのフラットシリコンOリングを使用します。乾燥フィルムの周囲に3〜5滴で分散したグリセロールと水の混合物を3〜5マイクロリットル加えてフィルムを水和させ、2番目のウィンドウでしっかりと閉じます。

フッ化バリウムをサンドイッチした窓をホルダーに挿入します。次に、ホルダーをサンプルコンパートメントに置きます。吸収スペクトルを測定します。

アミド1領域の最大吸収がA TRセットアップで0.6〜1.0の範囲にあることを確認します。A TRの蓋の上に配置された光ファイバーを使用して、レーザーをサンプルに結合します。サンプルでのレーザーのエネルギー密度を、パルスあたり1平方センチメートルあたり2〜3ミリジュールに調整します。

パワーメーターまたは透過実験を使用して、ミラーを使用してレーザーをサンプルに運び、必要に応じてレンズを使用してレーザービームをサンプルフィルムサイズよりわずかに高い直径に照合または迂回させます。Qスイッチを使用して、レーザーパルスをデータ記録と同期させます。ネオジムドープアトリウムアルミニウムガーネットレーザーの電子機器のTTLパルスを同期して、分光計のアナログからデジタルへのコンバーターをトリガーします。

レーザーの励起速度を設定して、時間分解を実行します。1800〜850の逆センチメートルスペクトル範囲でのステップスキャン測定。1, 950逆センチメートルより上で不透明で、1800逆センチメートル未満で良好な透過率を持つ光路にローパス光学フィルタを配置します。

次に、検出器をAC結合モードからDC結合モードに変更します。この時点で、検出器に電流バイアスを印加して、INTERFEROGRAMのDCレベルをゼロにします。アナログ-デジタルコンバーターのダイナミックレンジをより有効に活用するために、電子ゲインを再調整します。

これに続いて、FTIR分光計のステップスキャンメニューを開始します。ステップスキャン測定のターゲットスペクトル帯域幅をヘリウムネオンレーザー波数の8分の1に設定します。スペクトル分解能と位相分解能をそれぞれ 8 逆センチメートルと 64 逆センチメートルに設定します。

appe 関数を選択します。次に、INTERFEROGRAM取得モードを片側前方に設定します。アナログ-デジタルコンバーターのサンプリングレートを、分光計で利用可能な最高レートに設定します。

実験のトリガーを外部に設定します。次に、記録する線形間隔のデータポイントの数を設定します(100個のpretトリガーポイントを含む)。次に、ミラー位置ごとの写真反応のコエディション数または平均数を設定し、実験を開始します。

最後に、バクテリア、レッドシン、およびチャネルレッドシン2の3つの異なるサンプルフィルムで実験を10回繰り返し、ミラー位置あたり約200の共添加を持つように、ペプチド結合アマイト振動からの特徴的な禁止は、バクテリアレッドシン乾燥泡吸収スペクトルで区別できる。低イオン強度のバッファーを使用すると、フィルムが過度に膨張し、エバネッセントフィールドによってプローブされるタンパク質の量が減少します。フィルムの膨潤とバッファーイオン強度の正確な依存性は、脂質の性質に他の要因の中でも特に依存します。

水分補給後のフィルムの膨潤は、ドシンの細菌が安定するまでに時間がかかります。紫色の膜では、プロセスは12分の時定数でモノ指数関数的です。典型的な時間分解ステップスキャン、バクテリアのFDIR実験からの3Dプロット。

ここにはRedsinが示されています。スペクトルは特定の時間に抽出できます。たとえば、バクテリアの中間状態が写真サイクルのredsinで最も高い人口に達すると予想される場合です。

バクテリアロッドDossinフォトサイクルタイムでは、吸光度の痕跡は1、762逆センチメートルで変化します。アスパラギン酸85および1,741の逆センチメートルでの水素結合の変化とアスパラギン酸の脱プロトン化再現ダイナミクスに関する報告96。時間は1,670と1,555の逆センチメートルでトレースします。

MI 1および2の振動の変化について報告します。これらはどちらもペプチド骨格の確認に敏感です。この方法に続いて、部位特異的なニューロン新生または網膜酵素分光法などの他の技術を実施して、その発生後にタンパク質内の特定の残基に振動バンドを割り当てることができる。この技術は、分子生物物理学の分野の研究者が、さまざまな光駆動型タンパク質の機能メカニズムを探求する道を開きました。