のロテノン誘発性のパーキンソン病モデルにおける自発と驚愕誘発性歩行を特徴づけるための方法ショウジョウバエ
2014年8月17日
パーキンソン病は、運動欠陥を引き起こす中枢神経系におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に起因する神経変性疾患である。ロテノンモデルショウジョウバエのパーキンソン病。本論文では、ロテノンによって引き起こされる自発的かつ驚愕誘発性の両方歩行の欠陥を特徴づける2つのアッセイの概要を説明します。
次の実験の全体的な目標は、ショウジョウバエのロテノン誘発性パーキンソン病モデルにおける驚愕誘発性と長期の自発的な移動を決定することであり、これはロテノン添加食品でショウジョウバエを飼育して表現型を誘導することによって達成されます。第2のステップとして、ハエは驚愕応答アッセイとダブルバイアル装置および長期自発運動アッセイに供されます。ショウジョウバエ活動モニターでは、結果は、ロテノンへの曝露がショウジョウバエの運動障害を引き起こすことを示しています 驚愕と長期の自発的な移動の定量化に基づいて。
これらの方法は、ショウジョウバエ、驚愕誘発性運動の欠陥などの神経変性および運動障害のモデル、および長期的な自発的運動の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、1.5グラムのインスタントショウジョウバエ培地を追加します。標準的なフライバイアルでは、適切なロテノン用量を含む5ミリリットルの脱イオン水を含む媒体を構成します。
次に鎮静剤を投与すると、生後1〜3日齢の8〜12匹のオスのハエが二酸化炭素を使用して、薬の入ったバイアルに運びます。サプリメントを摂取した食品は、バイアルを水平位置にして20分間ハエが鎮静から回復することを可能にします。次に、バイアルを直立させて、実験の残りの部分で摂氏25度の12時間の明るく暗いインキュベーターに置きます。
次に、別のバイアルの上に標準的なフライバイアルを反転させ、継ぎ目をテープで密封してダブルバイアル装置を作成します。次に、バイアルの周りの円に油性マーカーで印を付けて、ダブルバイアルを6.33センチメートルの3つの等しいセクションに分割します。薬物曝露の3日後、移送はダブルバイアル装置に飛んで行きます。
縫い目をテープで覆うと、ハエが新しい環境に15分間順応できるようになります。次に、バイアルを白い背景に置き、デジタルカメラをセットアップします。装置全体が1つの額縁に表示され、ダブルバイアル装置とタイマーが視界に入っており、すべてのハエに焦点が合っていることを確認します。
カメラとバイアルの位置をマークして、試験間で一貫したフレームを維持し、カメラビューに試験番号と薬物治療を明確に表示します。次に、ダブルバイアル装置をカウンタートップに3回しっかりと叩き、すべてのハエがバイアルの底に落ちることを確認し、すぐにタイマーを開始します。装置の写真を5秒ごとに1分間撮ります。
その後、ハエが1分間邪魔されずに回復するのを待ちます。アッセイをさらに2回繰り返し、各試行の間に1分間の回復時間を設けます。写真を確認し、各セクションのハエの数を経時的に記録して、計算が3グラムのインスタントoph、15ミリリットルの脱イオン水と適切なロテノン用量を含む培地を再構成するようにします。
5分後、チューブを垂直に透明なバイアルに慎重に置き、チューブをひねって固い食品を高さ1センチメートルにロードします。次に、チューブの端にあるプラスチックキャップをそっと押して、気泡の発生を防ぎます 落ち着いた。ある日、老齢のオスが二酸化炭素を含んでハエを飛ばし、絵筆で各チューブに1匹ずつ慎重にハエを挿入します。
次に、チューブの端を小さなコットンボールで差し込みます。チューブを水平にしてハエが二酸化炭素から回復するのを15分間許可し、すべてのハエが生きていて活動していることを確認します。チューブをショウジョウバエ活動モニターまたはDAMに挿入し、すべてのチューブがDAMに対して同じ位置にあることを確認します。
DAMを摂氏25度の12時間の明るく暗いインキュベーターに入れます。次に、DAM をデータ収集システムに接続します。次に、設定でDAMソフトウェアを開きます。
ビンの長さを 10 分にしてデータ収集を開始し、プログラムが 7 日間データを収集できるようにします。次に、DAMファイルスキャンプログラムを開き、[入力データの選択]をクリックしてモニターデータにアクセスします。次に、適切なモニター範囲を選択し、ビンの長さを 10 分間隔に設定します。
次に、出力ファイルの種類で、チャネルファイルを選択し、他のすべてのオプションはデフォルトのままにします。次に、[データのスキャン]をクリックして、ファイルを指定されたフォルダに保存します。最後に、概日データ解析ソフトウェアにデータをインポートして、1分あたりのカウントを取得します。
ルーン野生型の異なる用量への曝露の3日後、カントンのハエは、増加した投与量にさらされ、驚愕反応の欠乏を示しました。ハエのより低いパーセントは、サラール応答の欠損を示す装置の上部セクションにおよびより高いパーセントで、30秒後には、自発的移動アッセイのハエについても同様の傾向が見られた。1分あたりのカウントは、ショウジョウバエ活動モニターまたはDAMで測定されました。
曝露後4日目に、250マイクロモルと500マイクロモルのロテノンに曝露されたハエは、1分あたりのカウントの有意な減少を示します。これらのアッセイは、他の疾患の食道モデルにおける運動障害や治療薬の有効性を特徴付けるために便利に適合させることができます。
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概要
本研究では、ロテノンによって誘発されたパーキンソン病のショウジョウバエモデルにおける運動機能不全について調査します。研究では、自発的運動と驚愕誘発運動の両方に焦点を当て、神経変性疾患に関する知見を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 神経変性疾患
背景
- パーキンソン病は、ドパミン作動性ニューロンの変性を特徴とする。
- ショウジョウバエは、運動機能障害を研究するためのモデル生物として利用されている。
- これらのハエにおいて、パーキンソン病に似た症状を誘発するためにロテノンが使用される。
- 運動能を理解することは、神経変性のメカニズムに関する洞察を得ることにつながる。
研究の目的
- Drosophilaにおける驚愕誘発性運動能を評価する。
- ロテノン誘発モデルにおける長期的な自発的運動能を評価する。
- ロテノンが運動行動に及ぼす影響を検討する。
使用された手法
- ロテノンを添加した餌でDrosophilaを飼育した。
- ショウジョウバエを用いて驚愕反応アッセイを行った。
- 移動能の評価にはダブルバイアル装置を使用した。
- Drosophila activity monitorを用いて、長期的な自発的移動能を測定した。
主要な結果
- ロテノンへの曝露により、顕著な運動機能障害が認められた。
- 定量分析により、驚愕反応誘発性の運動能の低下が明らかになった。
- 長期的な自発的運動能も、ロテノン曝露の影響を受けていた。
- これらの知見は、神経変性モデルにおける運動障害の理解に寄与するものである。
結論
- 本研究は、パーキンソン病のショウジョウバエモデルにおける運動能を評価するための枠組みを提供する。
- 結果から、神経変性疾患の研究におけるロテノン（rotenone）の有用性が浮き彫りになった。
- 今後の研究では、これらの手法を基盤として、さらなる神経生物学的な課題を追求することが可能である。
よくある質問
業界における重要性
本研究では、パーキンソン病のショウジョウバエモデルにおいて、運動機能低下を定量化するためのスケーラブルでハイスループットなアプローチを提供し、神経変性疾患治療薬における初期段階のターゲット検証およびメカニズムに基づくリスク軽減を可能にします。自発的な運動表現型と驚愕反応による運動表現型の両方を捉えることで、本アッセイはパスウェイ調節および表現型スクリーニングキャンペーンにおける予測的な信頼性を担保します。この手法は、創薬から前臨床評価に至るまで翻訳的な連続性を提供し、ドーパミン作動性ニューロンの完全性およびミトコンドリア機能に影響を与える化合物の、リスク調整に基づいた優先順位付けを促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： ドパミン作動性ニューロンの生存およびミトコンドリア複合体I阻害に関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： パスウェイの解明およびミトコンドリア標的の生物学的リスク低減のための、定量的かつ再現可能なリードアウトを提供する。
- 予測的価値： ロテノン誘発性の欠損に効果のない化合物と、運動機能を回復させる化合物を区別することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 神経変性疾患に焦点を当てたスクリーニングにおける、後続の化合物評価のための検証済み生物学的システムを提供する。
- 運用の価値： ダブルバイアル装置およびDrosophila activity monitorを用いることで、アッセイの標準化とハイスループットへの適合性を確保する。
- 拡張性： 一貫した運動表現型解析のため、複数のrotenone投与量および遺伝的背景にわたるプラットフォームの再利用を容易にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ロテノン誘発性の酸化ストレスと、ヒトのパーキンソン病の進行に並行した運動機能低下をモデル化することで、疾患との関連性を維持します。
- 運用的価値：7日間にわたる自発的運動の縦断的な追跡を可能にし、化合物の慢性的な影響を評価します。
- 予測的価値：急性の驚愕反応と長期的な活動量を神経変性メカニズムに結びつけることで、リスクを調整した開発推進の意思決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、化合物スクリーニング前に運動機能のベースラインを確立することで初期創薬ワークフローに組み込まれ、さらに作用機序の確認に向けたリード最適化へと継続されます。
- 発見生物学： 神経変性におけるミトコンドリア機能不全および酸化ストレス経路の仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 自動画像解析や用量反応プロファイリングに適した、ビンベースの定量的な運動出力を提供します。
- 分析： 1分あたりのカウント数および位置分布データを生成し、治療効果の経時的な統計比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 急性的な驚愕反応の欠損および慢性的な自発活動の喪失を、前臨床モデルで見られる進行性の運動機能低下に関連付けます。
- 企業における再利用： 他のDrosophila疾患モデルや治療有効性試験にも適応可能な、再利用可能な運動表現型解析プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 運動機能表現型のメカニズム的な曖昧さを排除することで、標的バリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用の価値： 定義されたタッピングプロトコル、回復間隔、およびイメージングパラメータを通じて、ラボ間の再現性と標準化を向上させる。
- 戦略的価値： 神経細胞の完全性とミトコンドリア機能の早期かつ定量的なバイオマーカーを提供し、go/no-go決定の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： rotenone誘発性の運動機能低下を修飾する化合物のリスクベースの優先順位付けを可能にし、後期段階での失敗リスクを低減する。
実施上の検討事項
- Drosophilaの取り扱い、鎮静、および行動アッセイのセットアップに関する専門知識が必要です。
- データ収集のため、イメージングインフラ（デジタルカメラ、照明）およびDrosophila活動モニターシステムに依存します。
- アッセイ間の整合性を確保するため、バイアルのマーキング、タッピングの強度、および回復時間のチーム間での標準化が必要です。
- 異なる遺伝的背景や環境条件にアッセイを拡張する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 自動トラッキングを導入しない限り、驚愕反応アッセイにおける手動の画像確認が必要であるという制限があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Startle-induced Locomotion Assay and Setup
3:11
Startle-induced Locomotion Experimentation and Data Analysis
4:04
Spontaneous Locomotion Assay Setup
5:19
Spontaneous Locomotion Data Collection and Analysis
6:36
Results: Rotenone-induced Response Deficiency
7:35
Conclusion
