のロテノン誘発性のパーキンソン病モデルにおける自発と驚愕誘発性歩行を特徴づけるための方法

本実験の全体的な目的は、ロテノン誘発性ショウジョウバエ・パーキンソン病モデルにおける、驚愕反応誘発性および長期自発的移動能を測定することです。これは、ロテノンを添加した餌でショウジョウバエを飼育し、表現型を誘発させることで達成されます。第2段階として、ハエを驚愕反応アッセイ、およびダブルバイアル装置を用いた長期自発的移動能アッセイに供します。ショウジョウバエ活動モニターを用いた結果、驚愕反応および長期自発的移動能の定量化に基づき、ロテノンへの曝露がショウジョウバエに移動能欠損を引き起こすことが示されます。

これらの手法は、驚愕誘発性移動の欠損や長期的な自発的移動など、神経変性疾患および運動機能障害のモデルであるショウジョウバエ分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、インスタントショウジョウバエ培地を1.5 g加えます。標準的なフライバイアル内で、適切な用量のロテノンを含む脱イオン水5 mLを用いて培地を調製します。

次に、二酸化炭素を用いて、日齢1〜3日の雄のハエ8〜12匹を鎮静させ、薬剤を含むバイアルへ移します。補完食を入れたバイアルを水平に置き、20分間静置して、ハエを鎮静状態から回復させます。その後、実験の残りの期間、バイアルを垂直に立てた状態で、25 °Cの12時間明暗サイクルインキュベーター内に安置します。

次に、標準的なフライバイアルを別のバイアルの上に逆さまに重ね、継ぎ目をテープで密閉してダブルバイアル装置を作成します。その後、油性マジックでバイアルに円を描き、ダブルバイアルを6.33 cmの3つの等しい区間に分割します。薬剤に3日間曝露させた後、フライをダブルバイアル装置に移します。

継ぎ目のテープを貼り替えて、ショウジョウバエを新しい環境に15分間慣らします。次に、バイアルを白い背景の上に置き、デジタルカメラを設置します。装置全体が1つのフレームに収まり、2連バイアル装置とタイマーが見え、すべてのハエにピントが合っていることを確認してください。

試行間でフレームを一定に保つため、カメラとバイアルの位置をマークし、試行番号と薬剤処理の内容がカメラの視野に明確に表示されるようにします。次に、ダブルバイアル装置をカウンタートップに3回強く叩きつけ、すべてのショウジョウバエがバイアルの底に落ちたことを確認し、すぐにタイマーを開始します。1分間、5秒ごとに装置の写真を撮影します。

その後、ハエを1分間静置して回復させます。各試行の間に1分間の回復時間を設け、このアッセイをさらに2回繰り返します。写真を検討し、時間経過に伴う各セクションのハエの数を記録して計算を行います。インスタントOPH 3gを、脱イオン水15mLと適切な用量のロテノンを含む培地で再構成します。

5分後、チューブを透明なバイアルに垂直に慎重に配置し、チューブをひねることで硬い餌を1 cmの高さまで充填します。次に、気泡が生じないように注意しながら、チューブ端のプラスチックキャップをゆっくりと押し込みます。二酸化炭素で1日齢の雄フライを鎮静させ、絵筆を用いて各チューブに1匹ずつ慎重に導入します。

次に、チューブの端を小さな脱脂綿で塞ぎます。チューブを水平に置いた状態で、ショウジョウバエを15分間二酸化炭素から回復させ、すべての個体が生存し、活発に動いていることを確認します。チューブをショウジョウバエ活動モニター（DAM）に挿入し、すべてのチューブがDAMに対して同じ位置にあることを確認してください。

DAMを25 °C、12時間明暗サイクルのインキュベーター内に設置します。次に、DAMをデータ収集システムに接続します。その後、DAMソフトウェアの「Preferences（設定）」を開きます。

データ収集を開始するために、ビン幅を10分に設定し、7日間データを収集させます。次に、DAMファイルスキャンプログラムを開き、「select input data」をクリックしてモニターデータにアクセスします。その後、適切なモニター範囲を選択し、ビン幅を10分間隔に設定します。

次に、出力ファイル形式でチャネルファイルを選択し、その他のオプションはすべてデフォルトのままにします。その後、「scan data」をクリックし、ファイルを指定したフォルダに保存します。最後に、データを概日リズムデータ解析ソフトウェアにインポートし、1分あたりのカウント数（counts per minute）を取得します。

異なる用量のrooneに3日間曝露した後、高用量に曝露した野生型Canton sショウジョウバエでは、驚愕反応の低下が認められました。装置の30秒後の状態で、上部に留まる個体の割合が低く、下部に留まる個体の割合が高かったことは、驚愕反応の低下を示しています。同様の傾向は、自発的運動能試験のショウジョウバエでも見られました。1分間あたりのカウント数は、ショウジョウバエ活動モニター（DAM）を用いて測定しました。

曝露から4日後、250 µMおよび500 µMのロテノンに曝露されたショウジョウバエは、cpm（counts per minute）の有意な減少を示します。これらのアッセイは、他の食道疾患モデルにおける運動機能障害の特性評価や、治療薬の有効性評価に容易に応用することが可能です。