Name: T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用インビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学ぶ蛍光ターゲット配列を用いたT細胞応答の評価法。CFSEやCTVで標識したリンパ球をMHC結合ペプチドでパルス処理し、マルチパラメーター流式細胞法で250以上のパラメーターを同時測定する。

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この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、肝炎やHIVのウイルス学EOIのためのオーストラリアのセンターから＃1010395（BQとCP）と＃525431（CR）、プログラムグラント＃455395（CP）を付与し、プロジェクトによってサポートされていました2012助成金（CRとRJJ）とゴードンとグレーテルうしかい座財団（BQとCR）からの助成金。我々はJCSMRのFACS研究室のその優れたメンテナンスのためHarpreet Vohra著、マイケルデヴォイに感謝したい、ペプチド合成のためのオーストラリアのがん研究財団生体分子資源施設、JCSMR、ANU、およびデビッド·ボイル、CSIROのアニマルヘルス研究所、ジーロン、オーストラリア親HIVワクチン株を提供するため。

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

FTAに基づくアッセイの利点は、フローサイトメトリーによる単一の宿主動物から&gt; 250生存および完全に機能する標的細胞集団の識別を可能にすることである。これは以前には不可能であったin vivoでのフローサイトメトリーベースのアッセイに複雑さのレベルを提供します。これは、6の濃度で7の異なるウイルスエピトープに対する応答は、AUCおよびEC 50などのパラメータは、インビボで T細胞応答に対して決定されることを可能にする単一の動物において同時に6回繰り返して監視することができる上に示した2動物実験で強調表示され。 in vivoで T細胞応答を測定することに加えて、FTAに基づくアッセイは、インビトロで 1応答を測定するように修飾することができる。これは、本質的に、インビトロで数時間にわたって反応を測定するために、培養中のT細胞へのFTAを添加することを含む。のFTA を用いたin vitroベースのアッ...

T細胞は、適応免疫応答において中心的な役割を果たし、多くの場合、免疫療法における操作のために標的化される。 CD4 +エフェクターT細胞が免疫の多くの局面を調節し、直接抗体を製造するためにB細胞を助けることができるサイトカインを分泌することによって外来抗原に応答する。 CD8 +細胞傷害性T細胞（CTL）は、サイトカインを分泌すること、ならびに直接に外来抗原を発現する細胞を死滅させる中心的な役割を再生することにより、外来抗原に応答することができる。これらのT細胞エフェクター機能を開始する基本的な相互作用は、細胞表面上のMHC分子上に表示された外来ペプチドとT細胞受容体（TCR）との相互作用を伴う。 CD4 + T細胞は、抗原提示細胞上のMHCクラスII分子上に提示されるペプチドを認識し、CD8 + T細胞は、典型的には、微生物に感染した細胞上に表示されるMHCクラス-I分子上に提示されるペプチドを認識する。 順番にT細胞は免疫応答において果たす役割を評価するためには、それらのエフェクター機能が確実かつ敏感な技術によって測定することが必須である。 T細胞応答の評価のための一般的な方法としては、 MHC class-I/II/peptide四量体の反応性; ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色によるサイトカイン産生; 51 Cr放出アッセイによって容量を殺す。これらのアッセイは、しかしながら、典型的には、 インビトロ刺激によりエクスビボで行うか、またはT細胞機能に制限された洞察を提供している。 T細胞応答を測定する際に、発生したin vitro刺激によって起こり得る機能的パラメータの変化を回避するように理想的には、T細胞の無操作に、in vivoで、in situでそれらを評価することが有益であろう。最も一般的にインビボで T細胞機能アッセイにおいて使用されるのいくつかは、インビボで列挙されるMHCクラスI結合ペプチドをパルスした標的細胞のCTL媒介死滅を測定することに基づいているこのようCFSEなどの重要な染料で蛍光標識を通じて検出による。これらのタイプのアッセイは、それらがインビボで起こる場合、それらは以前に定性的なパラメータは、例えば可能にするために必要とされる、異なる濃度のペプチドエピトープの異なるタイプを提示する複数の標的の死滅を評価するための比較的限られた能力を持っていた標的のCTL媒介死滅を監視することができるがなどの官能アビディティおよびエピトープ変異体の交差反応性を評価することができる。これらのアッセイはまた、CD4 + T細胞媒介応答に関するあらゆる情報を提供しない。 T細胞応答を評価するために使用される現在の方法で制限の多くを克服するために、我々は最近ずつの動物に同時に&gt; 250標的細胞に対するT細胞応答のモニタリングを可能にする蛍光性標的アレイ（のFTA）に基づいて、多重アッセイを開発した1、2フローサイトメトリー。自由貿易協定は、SEVで標識されたリンパ球から構成されているERAL濃度およびCFSE、CTV及びCPDのような生体染色色素の組み合わせは、ユニークな蛍光の&gt; 250細胞クラスターが生成されることを可能にする。これらの細胞は生存可能で、完全に機能的なままであるので、それらは、インビボ3におけるエフェクターT細胞との相互作用のモニタリングを可能にするために動物に注射することができる。例えば、FTA細胞クラスターは、標的細胞1の抗原特異的CTL媒介死滅の評価を可能にするためにMHCクラス-I結合性ペプチドでパルスすることができる。また、FTA細胞クラスタはまた、CD69、CD44および/ ​​または活性化マーカーを評価することによって（活性化を評価することによって、抗原特異的Tヘルパー細胞（T H）活性の評価を可能にする、MHCクラス-II結合性ペプチドでパルスすることができる同族ペプチド2を有するFTA内のB細胞のCD62L）。 250以上の標的を同時に検出することができるので、n個でパルス多くの標的細胞クラスタに対するCTLおよびT H応答を測定することが可能である異なる濃度や多くの反復を含めることでumerousペプチド。 FTAのアッセイは、したがって、in vivoでのT細胞エフェクター応答評価の前例のないレベルを提供します。 ここでは、詳細にFTAの構成を説明し、それらはin vivoで T細胞応答の評価に適用することができる方法を示す。手順は、MHCクラスIおよびII結合ペプチドをパルスした42細胞クラスターの6反復から成る3の重要な染料を使用することで252識別可能な細胞クラスターで構成される自由貿易協定（FTA）の構築を記載する。標識の量を減少させることによって、必要に応じて42細胞クラスターの標識は、チューブ底の10mlの円錐形で発生し、それを表1に示すように管ラックにこれらを配置することが有用である。この方法は、識別可能なクラスタの少ない数のために調整することができる各色素の1を行った。 我々は、それが的応答を測定することができますどのように示すことによって、アッセイの有用性を強調マウスの小さなコホートにおける複数のエピトープに対する組換えポックスウイルスワクチン接種によって生成されたES。これは、FTAアッセイは、それぞれを通る曲線（AUC）の評価および半最大応答（EC 50）を生成するために必要な効果的なペプチド濃度の被測定領域の使用を累積応答および機能的結合活性を測定するために使用することができる方法を示している。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69brilliant violet 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer (Fortessaまたは青、赤、紫のレーザー光源と同等品)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

t細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

in vivoで T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答および免疫療法の設計の我々の理解の開発のために重要である。赤色レーザ励起可能染料（細胞増殖色素eFluor 670：CPD：ここでは、そのようなカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）などの重要な染料を利用した蛍光ターゲット配列（FTA）技術、紫色レーザー励起可能染料（CTV CellTraceバイオレット）の使用を記載）&gt; 250識別可能な蛍光細胞のクラスタにラベルをマウスリンパ球を、組み合わせた。これらのFTA内の細胞クラスタは、主要組織適合性複合体（MHC）クラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドでパルスし、それによって、それぞれCD8 +およびCD4 + T細胞のための標的細胞として作用することができる。これらのFTA細胞は生存可能で、完全に機能的なままであり、したがって、FTA標的細胞およびCD4 + T細胞瞑想HELのCD8 + T細胞媒介死滅の評価を可能にするためにマウスに投与することができるフローサイトメトリーによるインビボでリアルタイムにFTA B細胞標的細胞におけるp。 &gt; 250標的細胞を一度に評価することができるので、この技術は、いくつかの濃度では、複数の反復のいくつかの抗原エピトープに対するT細胞応答のモニタリングを可能にする。このように、この技術は、定量的（ 例えば、累積的な応答の大きさ）および定性的（ 例えば、機能性アビディティおよび応答のエピトープの交差反応性）レベルの両方でT細胞応答を測定することができる。ここで、我々はこれらのFTAを構築する方法を記述し、それらは、組換えポックスウイルスワクチンによって誘導されるT細胞応答を評価するために適用することができる方法の例を与える。

FTAアッセイの使用の一例として、BALB / cマウスを、HIV-I CTLエピトープにHIV-Iエピトープ（VV-HIV）と応答を発現する組換えワクシニアウイルス（VV）で免疫化したGag、ギャグたmut、のEnvおよびPol、VV CTLエピトープF2LとのF2Lたmut、およびHIV-I T H細胞エピトープ 、Thをギャグ（2に記載のように）252パラメータFTAアッセイ（ 図1B）を使用して評価した。ギャグ（ギャグのmut）およびF2L（撮影地のmut）のエピトープ変異体は、VV-HIVベクターで発現され、したがって、これらのエピトープに対する応答は、エピトープの変異体交差反応性T細胞応答の反射でもない。ナイーブマウスを、陰性対照としてFTAを注射した。 FTAは、フローサイトメトリー（ 図1Aおよび1B）を介しB220抗体染色によって区別PKH-26標識およびFTA B細胞による宿主マウスの細胞と区別した。 6内の動物の複製物の各々は、CPD蛍光（ <st...

インビボで詳細に T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答の我々の理解の開発のために重要である。ここでは、フローサイトメトリーで同時に&gt; 250のパラメータを評価するin vivoでの T細胞アッセイにおける蛍光の標的配列（のFTA）の使用を記載している。

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

この手順の全体的な目的は、マルチパラメーターフローサイトメトリーを用いた免疫アッセイのために、最大252種類の個別にラベル化された蛍光標的細胞のアレイを生成することです。これは、まず標的リンパ球をCFSEやCTVなどの生存染色の独自な組み合わせと強度でラベル化することによって達成されます。次のステップでは、それぞれの独立した標的リンパ球集団に、候補となるMHCクラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドエピトープをパルス的に添加します。続いて、エピトープの特異性を維持するために細胞を十分に洗浄し、その後、細胞をプールして動物に注入します。最終ステップでは、特定の組織から蛍光タグアレイ細胞を回収して標識し、MHCペプチド特異的な応答を評価します。最終的に、フローサイトメトリーの結果から、標的細胞の死滅を測定することでCTL応答を、またB細胞標的における活性化マーカーの上方制御を測定することでCD4陽性Tヘルパー応答を示すことができます。従来のin vivo CTLアッセイに対するこの手法の大きな利点は、1匹の動物で250種類以上の標的細胞を同時に測定できることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチフェローであるBen Quireが行います。本手順では、マウスから単離した脾臓またはリンパ節から回収したリンパ球をろ過し、5%胎児牛血清を含むRPMI 11.5 mL中で、最大200 million cells/mLの濃度で再懸濁させる必要があります。FDAの調製はラベル付けから始まります。1から42までの番号を付けた10 mLコニカルチューブ42本を用い、すべての細胞に対して7種類の異なるペプチドエピトープを6つの異なる濃度で処理し、これを6回繰り返すことで、計252個の識別可能な細胞クラスターを生成します。次に、チューブを数回反転させ、リンパ球を十分に再懸濁させます。その後、1.9 mLの細胞懸濁液を、37から42の番号が付けられた10 mLチューブに加えます。この際、チューブの上半分を濡らさないように注意してください。次に、チューブ38のキャップを取り外し、チューブ38の上に水平に置きます。PBSを83 µL加えます。その後、テキストプロトコルの表2に示されている適切なCTVストック溶液を17 µL加えます。チューブに分注したら、ボルテックスで撹拌します。チューブ39から42についても同様に操作し、表2に記載されている通り、各チューブに異なるCTVストックが入るようにしてください。次に、細胞を室温で少なくとも5分間インキュベートします。その後、各チューブに5% FCS含有RPMIを5 mL加えます。各チューブをボルテックスして、細胞を十分に再懸濁させます。推奨されるロードパターンに従って、懸濁液1 mLを他の6本のチューブに分注します。分注の際は、ロードしたチューブの上部を濡らさないようにすることが重要です。CFSEで細胞を標識するため、1 mLの細胞を含むチューブ31から36のキャップを取り外し、各チューブの横に水平に並べます。まず、103 µLのPBSを加え、乾燥した上壁に噴射させます。次に、テキストプロトコルの表3に従って適切なCFSEストックを7 µL加え、直ちにチューブをボルテックスします。表3でグループ化された他のチューブについても同様に繰り返します。各チューブに異なるCFSEストック液が入っていることを確認します。すべてのチューブを室温で少なくとも5分間インキュベートします。5分後、細胞を洗浄してラベル化を完了させます。各懸濁液を、室温の5% FCS含有RPMI 9 mLで希釈します。室温にて300 gで10分間遠心分離して細胞をペレット化し、トランスファーピペットを用いて上清を吸引除去します。MHCクラスIおよびMHCクラスII結合ペプチドの調製については、テキストプロトコルに記載されています。本セクションでは、これらのペプチドを用いて細胞をパルスラベルする方法を示します。まず、チューブをグリルに沿って転がすなどの方法で、細胞ペレットを残留培地で再懸濁します。次に、5% FCS含有PMIを用いて、細胞懸濁液の全量を250 µLにします。各細胞ペレットにつき、約200 µLの培地が必要となります。次に、表5に記載されているあらかじめ調製したペプチドストック液を250 µLずつ、指定のチューブに加えます。表1に示されたパターンに従い、T細胞応答を算出するためのPBSのみのコントロールチューブを必ず含めてください。各ペプチドエピトープおよび各ペプチド濃度を単一のチューブに割り当て、そのチューブ内の細胞に期待される蛍光に基づいて明確に記録することが極めて重要です。このクラスターの蛍光シグネチャーによってこのペプチドが定義されるため、各細胞懸濁液をボルテックスで混合し、その後、細胞を37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞の洗浄を行います。まず、各細胞懸濁液に5% FCSを含む氷冷したRPMIを5 mL加え、チューブを転倒混和して細胞を再懸濁します。次に、各細胞懸濁液の下に、氷冷したFCS沈殿物3 mLを慎重に層状に加えます。この際、細胞は4 °Cで300 Gにて10分間遠心分離します。各チューブ内で溶液界面が維持されるよう、緩やかな加速および減速を用いてください。その後、RPMIを慎重に吸引し、続いてFCSを吸引し、洗浄後の細胞ペレットを乱さないように回収します。ペレットを分離した後、細胞を再度洗浄します。2回洗浄した細胞ペレットを、5% FCSを含む氷冷RPMI 10 mLに再懸濁し、遠心分離を繰り返します。遠心後、上清を除去します。次に、すべての細胞集団を5% FCS含有氷冷RPMI 6 mLを入れた新しい10 mLチューブにまとめ、遠心分離によってプールした細胞を沈殿させ、転送ピペットで上清を吸引します。これで全手順のこの工程が完了します。ペプチドパルス細胞を6つの異なる濃度のCPDでラベルすることで、6つのアッセイ内反復を生成できます。まず、室温の5% FCS含有RPMI 11.4 mLをプールした細胞ペレットに加え、ピペッティングによって十分に再懸濁します。次に、細胞懸濁液1.9 mLを、AからFまでラベルした6本の新しい10 mLチューブに加え、チューブの上半分を濡らさないように注意します。CPDのキャップなしチューブBを用いて細胞の標識を開始するために、まずチューブを乾燥した壁に沿って水平に置きます。次に、92 µLのPBSを加え、続いて表4に従って規定量のCPDストック溶液を加えます。その後、混合液をボルテックスで撹拌します。チューブCからFに対しても、表4の通り各チューブに異なるCPDストック溶液が入るようにして、この手順を繰り返します。すべてのチューブを混合した後、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞を2回洗浄します。まず、室温の培地10 millilitersで再懸濁します。次に、遠心分離を行い、最後に転送ピペットで上清を吸引除去します。その後、この手順を繰り返します。次に、チューブAからFのすべての細胞を、8 mLの氷冷培地を入れた単一のチューブにまとめて回収します。遠心分離により細胞を回収し、動物への細胞注入およびその後のフローサイトメトリー解析に進みます。詳細はテキストプロトコルに記載されています。BCマウスにHIV V oneエピトープを発現する組換えワクシニアウイルスを免疫し、さまざまなエピトープに対する応答を252パラメータFTAアッセイを用いて評価しました。2つのエピトープ変異体であるgag muteおよびFTL muteをベクターで発現させず、ナイーブマウスにも同様にFTAを注入した。TAと宿主マウス細胞の区別にはPKH26標識を用い、FTAB細胞の区別にはフローサイトメトリーによるB220抗体染色を用いた。6つの動物内反復試験のそれぞれについて、CPD蛍光に基づいてゲーティングを行った。また、さまざまな濃度のエピトープを発現するFTA標的細胞は、CFSEおよびCTV蛍光に基づいてゲーティングした。各リプリケートにおける特異的殺傷分率は、感作動物におけるFTAクラスターの細胞死を、未感作動物の対応するFTAクラスターと比較することで評価した。ヘルパーT細胞活性は、感作動物におけるFTA B細胞のCD 69の上方制御を、未感作動物の対応するFTA B細胞クラスターと比較することで評価した。この解析から、V-V-H-I-V感染は、免疫優位なVVエピトープF two Lに対して最強のCTL応答を誘導し、0.001 micromolar以上のエピトープでパルスしたFDA標的細胞の100%が脾臓から除去された。CTL応答に加えて、FTAアッセイでは、H-I-V-M-H-CクラスII結合エピトープ HIV gag th を発現するFTAB細胞の活性化を評価することで、ヘルパーT細胞応答も測定しました。これにより、感作動物において抗原特異的なB細胞活性化が起こったことが示され、HIV gag特異的なヘルパーT細胞エフェクターが生成されたことが示唆されました。このビデオを視聴することで、250個以上の標的細胞からなる蛍光標的アレイを生成する方法について十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

それゆえ、それが関与するタンパク質の空間的および時間的挙動を調べることが重要であるシグナリングを理解するために、細胞膜内や細胞内の場所にどちらかのタンパク質の棲み分けが大幅にシグナル伝達の結果に影響を与えることができる1調節機構である。ここではT細胞のシグナル伝達を研究するための全反射顕微鏡ベースのシステムを説明しますが、広く適用可能である。...

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

このビデオは、蛍光ベースのアッセイによる免疫調節化合物のスクリーニングを示しています。トランスジェニックマウス由来Tリンパ球に緑色蛍光タンパク質発現カセットを添加したこれらの化合物で処理します。GFPシグナルの増強と減少により、化合物の刺激効果と阻害効果をそれぞれ同定することができます。...

免疫調節化合物のスクリーニングのための人工リンパ球を用いた蛍光ベースのアッセイ

我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター -...

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

私たちは、ワクチン接種のマウスモデルにおいて、ナノ粒子による免疫に対する抗原特異的CD8+...

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。...

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

炎症部位でのCD4エフェクターT細胞の間質運動を支配するメカニズムは、比較的知られていません。我々は、in vitroで視覚化して操作するための非侵襲的なアプローチは、その場でこれらの細胞の動的挙動の研究を可能にする、炎症を起こした耳の真皮中のCD4 T細胞を-primed提示します。...

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

このプロトコルでは、イメージの居住者腫瘍浸潤 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍スライス内結合蛍光抗体で標識する方法について説明します。この手法は、共焦点顕微鏡を用いた CD8 T...

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング...

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

このプロトコールは、臨床的に利用可能なプラットフォームを用いて 、インビボで...

[18F]テトラフルオロホウ酸陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影によるキメラ抗原受容体T細胞の動的イメージング

学ぶ蛍光ターゲット配列を用いたT細胞応答の評価法。CFSEやCTVで標識したリンパ球をMHC結合ペプチドでパルス処理し、マルチパラメーター流式細胞法で250以上のパラメーターを同時測定する。

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用

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