T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用インビボ

この手順の全体的な目標は、マルチパラメーターフローサイトメトリーを使用した免疫アッセイ用に、最大252の明確に標識された蛍光標的細胞のアレイを生成することです。これは、まず、CFSEやCTVなどの重要な色素のユニークな組み合わせと強度で標的リンパ球を標識することによって達成されます。次のステップは、各異なる標的リンパ球集団に候補のMHCクラス1およびMHCクラス2の結合ペプチドエピトープをパルスすることです。

これに続いて、エピトープの特異性を維持するために細胞を広範囲に洗浄し、細胞をプールして動物に注入します。最後のステップは、特定の組織から蛍光タグアレイ細胞を採取し、それらを標識し、MHCペプチド特異的応答を評価することです。最終的に、フローサイトメトリーの結果は、標的細胞死を測定することによってCTL応答を示すことができ、彼らは活性化マーカーのB細胞ターゲットアップレギュレーションを測定することにより、CDの4つの正のTヘルパー応答を示すことができます 従来のin vivo CTLアッセイに対するこの技術の主な利点は、それが1匹の動物で250以上の標的細胞を同時に測定できることであり、手順がベン・クワイアになります。 私の研究室の研究員です。

この手順では、マウスの単離された脾臓および/またはリンパ節から採取したリンパ球をろ過し、5%のウシ胎児血清を含む11.5ミリリットルのRPMIに1ミリリットルあたり最大2億細胞で再懸濁する必要があります。FDAの準備は、ラベリングから始まります。すべての細胞で 1 から 42 までの 42 10 ミリリットルの円錐形の底付きプラスチック チューブに、6 つの異なる濃度の 7 つの異なるペプチド エピトープをパルス化し、6 回繰り返して 252 個の識別可能な細胞クラスターを生成します。

次に、チューブを数回反転させることにより、リンパ球を懸濁させます。次に、1.9ミリリットルの細胞懸濁液を、37から42とラベル付けされた10ミリリットルのチューブに加えます。チューブの上半分を濡らさないように注意してください。

ここで、チューブ38のキャップを外し、チューブ38の上部に対して水平に置きます。83マイクロリットルのPBSを追加します。次に、テキストプロトコルの表2に示されているように、適切なCTVストックの17マイクロリットルを追加します。

チューブに負荷がかかったら、ボルテックスします。これをチューブ39〜42で繰り返します。各チューブが表2に記載されているように、異なるCTVストックを取得することを確認します。

次に、細胞を室温で少なくとも5分間インキュベートします。次に、5%FCSを含む5ミリリットルのRPMIを各チューブに加え、各チューブからボルテックスして細胞を完全に再懸濁します。1ミリリットルの懸濁液を他の6本のチューブに移す テキストプロトコルで概説されている推奨ローディングパターンに従って、すべての転送中に、ロードされたチューブの上部を濡らして細胞をCFSEで標識し、1ミリリットルの細胞を含むチューブ31〜36のチューブキャップを取り外し、チューブを各チューブの隣に水平に置くことが重要です。

まず、103マイクロリットルのPBSを追加し、乾燥した上部壁に排出します。次に、テキストプロトコルの表3に従って適切なCFSEストックを7マイクロリットル追加し、すぐにチューブをボルテックスします。表3にグループ化されたチューブでこれを繰り返します。

各チューブに異なるCFSEストックが供給されるようにします。すべてのチューブを室温で少なくとも5分間インキュベートします。5分待ってから、細胞を洗浄して標識を終了します。

各懸濁液を9ミリリットルの室温RPMIで5%FCSで希釈します。室温で300GSで10分間細胞をペレット化し、トランスファーピペットを使用して吸引することにより上清を除去し、MHCクラス1およびMHCクラス2結合ペプチドの調製がテキストプロトコルに示されている。このセクションでは、これらのペプチドで細胞をパルス標識する方法を示します。

まず、例えば、チューブをグリルに沿って走らせることにより、細胞ペレットを残留培地に再懸濁します。次に、細胞懸濁液の総量を5%FCSを含むPMIで250マイクロリットルにします。各細胞ペレットには、約200マイクロリットルの培地が必要です。

次に、表5に記載されている250マイクロリットルの調製済みペプチドストックを所定のチューブに加えます。表1に示されているパターンに従い、T細胞の応答を計算するためにPBSのみのコントロールチューブを必ず含めてください。各ペプチドエピトープと各ペプチド濃度を1つのチューブに割り当て、このチューブ内の細胞の予想される蛍光に基づいて明確に記録することが重要です。

このクラスターの蛍光シグネチャーがこのペプチドを定義するため、各細胞懸濁液をボルテックスして混合し、細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を洗浄するために細胞の洗浄を進めます。まず、5mLの氷冷RPMIと5%FCSを各細胞懸濁液に加え、チューブを反転させて細胞を再懸濁します。

次に、各細胞懸濁液を3ミリリットルの氷冷FCS沈殿物で慎重に下敷きし、細胞を300Gで10分間回転させて摂氏4度に保ちます。ゆっくりとした加速とブレーキを使用して、各チューブで溶液のインターフェースが維持されるようにします。RPMIを慎重に吸引し、次にFCSを吸引し、洗浄した細胞ペレットを邪魔しないようにします。

ペレットを単離した後、細胞を2回洗浄した細胞ペレットresusまで再度洗浄します。それらを5%FCSを含む10ミリリットルの氷冷RPMIに懸濁し、スピンが上清を注いだ後に遠心分離を繰り返します。次に、すべての集団を新しい10ミリリットルのチューブにプールし、5%FCS沈殿物を含む6ミリリットルの氷冷RPMIをプールし、遠心分離によってプールされた細胞を遠心分離し、全手順のこの時点で移送ピペットでSUP被清を吸引します。

ペプチドパルス細胞を6つの異なる濃度のCPDで標識することにより、6回のアッセイ内複製を生成できます。まず、プールした細胞ペレットに5%FCSを含む室温RPMI11.4ミリリットルを加え、ピペッティングで十分に再懸濁します。次に、AからFとラベル付けされた6本の新しい10ミリリットルチューブに1.9ミリリットルの細胞懸濁液を追加し、チューブの上半分を濡らさないように注意します。

CPDキャップなしチューブBでセルの標識を開始し、乾式壁に沿って水平にチューブを置きますまず、表4に従って92マイクロリットルのPBSを追加し、続いてストックCPDの量を追加します。次に、混合物をボルテックスします。チューブCと2Fでこの手順を繰り返し、表4のように各チューブが異なるCPDストックを取得することを確認します。

すべてのチューブを混合した後、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞を2回洗浄し、最初に10ミリリットルの室温培地に再懸濁します。次に、それらをスピンダウンし、3番目にトランスファーピペットで上清を吸引します。

次に、プロセスを繰り返します。次に、チューブAからFまでのすべての細胞を、8ミリリットルの氷の中の1つのチューブにプールします。コールドメディア。

細胞をスピンダウンして細胞を採取し、動物への細胞注入とその後のフローサイトメトリー解析を進めます。詳細はテキストプロトコルに記載されています。BCマウスをHIV V 1エピトープを発現する組換えワクシニアウイルスで免疫し、252パラメータFTAアッセイを用いて種々のエピトープに対する応答を評価した。

2つのエピトープ変異体gag muteおよびFTL muteはベクターでは発現せず、ナイーブマウスにもFTAを注入した。TAはP KH 26標識によって宿主マウス細胞から識別され、FTAB細胞はフローサイトメトリーによるB two 20抗体染色によって識別されました。6つの動物内複製のそれぞれをCPD蛍光に基づいてゲーティングし、エピトープの様々な濃度を発現するFTAターゲットをCFSEおよびCTV蛍光に基づいてゲーティングしました。

各複製の特異的死滅の割合は、プライミングされた動物におけるFTAクラスター細胞死をナイーブ動物における対応するFTAクラスターと比較することによって評価された。ヘルパーT活性は、プライミングされた動物におけるCD 69のFTA B細胞のアップレギュレーションを、ナイーブ動物の対応するFT A細胞クラスターと比較することによって評価されました。この分析から、V-V-H-I-V感染は、免疫優位のVVエピトープF two Lに対して最も強いCTL応答を生成し、FDA標的細胞の100%が脾臓から0.001マイクロモル以上のエピトープをパルスで除去しました。

CTL応答に加えて、FTAアッセイは、FTAB細胞の活性化を評価することによりヘルパーT応答も測定し、H−I−V−M−H−Cクラス2結合エピトープHIVギャグを発現させるこのことは、抗原特異的B細胞の活性化がプライミングされた動物で起こったことを示し、HIVギャグ、T特異的ヘルパーT細胞エフェクターの世代を示唆する。このビデオを見れば、250種類以上のターゲット細胞からなる蛍光ターゲットアレイの作製方法について十分に理解できるはずです。