組み合わせたDNA-RNA蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

この手順の全体的な目標は、C 2ハイブリダイゼーションまたはD-N-A-R-N-A魚のDNAとRNA蛍光を同時に組み合わせることにより、分化した雌マウス胚性幹細胞のX染色体不活性化を研究することです。これは、まず雌マウス胚性幹細胞に分化を誘導することによって達成されます。このプロセスでは、着床後の正常な胚発生をシミュレートするため、X染色体の不活性化が開始され、その結果、シストRNAの転写と蓄積が促進され、将来の不活性なX染色体がコードされます。

2番目のステップは、パラアルデヒドを使用して分化した胚性幹細胞を固定することです。次に、X染色体と嚢胞RNAの両方からDNAを検出するためのプローブを、DNA断片をビオチンまたはジゴゲニンで標識することにより調製します。ニック翻訳を使用。

最後のステップは、D-N-A-R-N-A FISH手順を実行することです。分化した胚性幹細胞は、透過性、変性、標識された魚のプローブにハイブリダイズされ、その後、ビオチンまたはディゲンをハプスで検出する蛍光標識抗体を使用して検出されます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法は、女性細胞の2つの染色体の位置を示し、不活性化を受けたX染色体からの嚢胞RNAの発現を視覚化するためのSUです。

この手法の主な利点は、RNAとDNAがその後検出されるFISH法などの他の方法と比較して、当社のプロトコルを使用すると、2日以内に同じ検体で両方のタイプの核酸を同時に検出できることです。DNAとRNAを組み合わせた魚は、DNAまたはRNAを検出するのに最適な条件が大きく異なるため、実行するのが難しい場合があります。本明細書に提示されたプロトコルを使用して、我々は、分析された事実上すべての細胞において、両方のX染色体に由来する存在するRNAおよびDNAを検出することができる。

これにより、雌マウス胚性幹細胞の分化または雌マウスの異常な発生中にX染色体の活性化を研究することができました。この方法は、初期のマウス胚発生中に発生する重要で魅力的なプロセスである活性化プロセスにおけるXへの洞察を提供することができますが、ノンコーディングRNAが生物学的システムにおける重要性についてますます評価され、多くの場合、シングルセルアプローチが代替アプローチよりも好まれているため、ネイティブクロマチンに由来するRNA転写産物を検出することが重要である他の生物学的システムにも適用できる可能性があります細胞の全集団が評価されている場所。このプロトコルは、幅広い科学コミュニティに役立つと予測しています。

雌マウス胚性幹細胞またはE ESLは、マウス胚性線維芽細胞ORMでコーティングされたゼラチン化培養皿上で標準的なESL条件下で増殖し、分化誘導の手順を開始します。ESL培養液からES培地を取り出し、細胞培養PBSで2回洗浄します 摂氏37度に予温した1.5ミリリットルのTRIPSIN EDTAを加え、細胞を摂氏37度で7分間インキュベートします。3.5分後、皿を静かに振ってコロニーを砕きます。

細胞に分化培地の3.5ミリリットルを添加し、細胞を上下にピペットで動かして単一の細胞溶液を取得し、15ミリリットルのチューブに収集することにより、トリプシンEDTAを不活性化します。分化培地10ミリリットルに細胞を採取した後、ゼラチン化していない10cmの培養皿に細胞懸濁液を加え、1時間インキュベートします。細胞培養インキュベーターでは、MESはゼラチン化されていない培養皿に接着することができますが、ES細胞は懸濁液のままになります。

その間に、滅菌ガラスカバーを6つのウェルプレートに滑り込ませ、0.2%ゼラチンを加えて、最低5分間インキュベートします。1時間後に室温で、主に非接着性のESLで構成されるprepl ESL培養物のスナットを収集します。E ESLsプレートをカバースリップを含む6枚のウェルプレートに希釈した後。

この手順は、分化培養物から分化培地を取り出し、細胞培養PBSで2回洗浄することから始めます。細胞が洗い流されないように、PBSを慎重に追加してください。4%パラホルムアルデヒドPBSを添加し、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。

10分後、パラホルムアルデヒドを取り除き、カバースリップを70%エタノールで3回洗います。標識用のDNAプローブを調製するには、まず、各DNAをそれぞれ1マイクログラムを水で合計16マイクロリットルに希釈します。次に、ボルテックス混合して混合した4マイクロリットルのoxゲニンまたはビオチン標識溶液を加え、摂氏16度で90分間インキュベートします。

これにより、ビオチンが組み込まれるか、NIC翻訳によって酸素標識ヌクレオチドが掘り下げられます。その間にG50列を用意しておきましょう。非組み込みヌクレオチドを除去するには、2ミリリットルの注射器を取り、スタンパーを取り外し、滅菌した綿を注射器に加えます。

G 50ボールと溶液を加えてシリンジを充填します。次に、シリンジを642GSの15ミリリットルチューブ遠心分離機に1分間入れます。遠心分離後、シリンジの約80%をG 50で満たす必要があります90分後、各NIC翻訳反応混合物に40マイクロリットルの水を加え、反応をG 50カラムに移します。

カラムの下に空のチューブを追加し、642 Gで2分間遠心分離します。反応チューブに流れを回収します。ピペットで流れの量を測定し、次に水を加えて総量200マイクロリットルに到達します。

流れを沈殿させるために、サケ精子、DNA酵母TRNAマウスを捕獲した1D NAおよびボルテックスにより混合した2モル酢酸ナトリウムを添加する。氷冷した100%エタノールの533マイクロリットルを追加し、4°Cで30分間16、200Gsでチューブ遠心分離機を振る。遠心分離の完了時に、上記ナタントを除去し、ペレットを70%エタノール遠心分離機で16,200Gで4°Cで5分間2回洗浄し、ペレットを風乾します。

ペレットが乾いたとき。50マイクロリットル、50以上のハイブリダイゼーション溶液を加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。浸透前の溶解を容易にするために、固定された細胞は70%エタノールを除去し、細胞培養PBSを細胞に添加することにより、スリップを発見します。

5分間インキュベートし、細胞を動員するように合計3回繰り返します。細胞培養PBSを取り出し、6枚のウェルプレートに0.2%pepinを添加します。プレートを摂氏37度の水浴で4分間インキュベートします。

その後、ピピンを取り外し、RNAフリーウォーターで不活化します。固定後、細胞を4%パラホルムアルデヒドPBSと室温で5分間インキュベートし、細胞培養またはPBSで5分間2回洗浄します。70%エタノールで3分間、90%エタノールで3分間、100%エタノールで3分間インキュベートして、細胞を脱水します。

その後、6つのウェルプレートからカバーが滑り落ち、カバースリップを追加して数分間乾燥させます。ホットプレート上でカバースリップを摂氏65度で1時間インキュベートすることにより、細胞を老化させます。その間に、マウスコート1D NAを備えた魚のプローブを事前にハイブリダイズし、分析するすべてのカバースリップを一緒に追加します。

25マイクロリットルの50プラスハイブリダイゼーションソリューション。ビオチンの1マイクロリットル、嚢胞プローブ、ジゴ酸素の1マイクロリットル、X染色体を検出し、0.5マイクロリットルのマウスコート1D NAを検出し、渦巻きによって、99°Cで5分間自然界で測定したBACプローブを標識しました。直ちに摂氏37度で45分間インキュベートし、ベビーベッドの1D NAがハイブリダイズしてプローブに存在する配列を繰り返すようにします。

カバースリップ上の細胞が老化したら、スライドガラス上に50マイクロリットルのde-matulationバッファーをスポットし、de-mamaturityationバッファーに面した細胞の上にカバースリップを置きます。摂氏65度で2分間インキュベートします。カバースリップを氷冷、70%エタノールで予め充填した6つのウェルプレートに戻して細胞をポストフィックスし、5分間インキュベートします。

その後、70%エタノールで3分間、90%エタノールで3分間、100%エタノールで3分間インキュベートすることにより、細胞を脱水します。6つのウェルプレートからカバースリップを取り外し、数分間自然乾燥させます。スライドガラスとインキュベーター上にプレハイブリダイズプローブを見つけ、上部にカバースリップ

スライドを50ミリリットルの50%IDE2XSSCで満たされた加湿チャンバーに入れ、摂氏37度で一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、トランスファーカバーはスライドガラスから、摂氏42度に予温された2つのXSSCで満たされた6枚のウォールプレートに滑り込みます。摂氏42度で5分間インキュベートします。

2つのXSSCを削除し、50%form MIを2つのXSSCに追加します。摂氏42度で10分間インキュベートします。50%form IDEで2つのX-S-S-C-Aを合計3回、42°Cで10分間洗濯します。

3回目の洗浄後、50%form私の2つのXSSCを取り外し、トリス生理食塩水BSAまたはTSAのスポット50マイクロリットルをブロックするために室温で5分間、トリス生理食塩水トゥイーンまたはTSTでスライドを洗浄します。新しいスライドガラスにカバーを滑り込ませ、カバースリップを逆さまにしてスライドガラスに置き、TST加湿ダークチャンバーで室温で30分間インキュベートします。30分後、カバースリップを6つのウェルプレートに戻し、最初の抗体インキュベーションスポットとしてTSTで5分間2回洗浄し、カバースリップごとに50マイクロリットルのヒツジ抗原と抗体を新しいスライドガラスに置き、カバースリップを逆さまにしてスライドガラスに置き、TST加湿ダークチャンバーで室温で30分間インキュベートします。

その後、カバースリップを一連の蛍光標識抗体とインキュベートして、添付の原稿に詳述されているように元のシグナルを増強します。蛍光標識された一連の抗体とインキュベートした後、70%エタノール、90%エタノール、および100%エタノールでそれぞれ3分間インキュベートすることにより、細胞を脱水します。6つのウェルプレートからカバースリップを取り外し、数分間自然乾燥させます。

最後に、各スライドガラスにダッピー付きの封入剤の滴を見つけます。上にカバースリップを逆さまに追加し、スライドをネイルワニスで密封します。このプロトコルをD-N-A-R-N-Aの組み合わせに使用すると、FISHのX染色体の不活性化を分化している女性ES細胞で視覚化できます。

この図は、嚢胞RNAとX染色体の領域の両方が同時に検出されるA-D-N-A-R-N-A魚類実験の代表的な例を示しています。嚢胞、RNAは、X染色体の不活性化のプロセスに不可欠な非コードRNAです。女性のESLをここで区別する際には、RNAはビオチン標識CD NAプローブを使用して検出され、これはルーミンに結合した抗体を使用して視覚化され、赤で示されています。

X染色体は、標識BACプローブ中のxigenを使用して検出され、緑色の核で示されるFITCに結合した抗体を使用して視覚化され、青色で示されるDPIで対比染色されます。ほとんどすべての細胞で、2つのx染色体が検出されます。不活性なX染色体または嚢胞雲上の大きな嚢胞の蓄積と、活性X染色体または嚢胞ピンポイントからの基底嚢胞の発現の両方が検出されます。

嚢胞のピンポイントは、分化時にこの基底嚢胞の発現が将来の活性X染色体で停止するため、すべての核で検出されるわけではありません。X染色体に由来するピンポイント信号の一部は、嚢胞雲内に位置しており、これにより、嚢胞雲が実際にX染色体に沿って局在し、一度習得されるとX染色体をコードしていることを示していることに留意されたい。この手法は2日未満で完了し、適切に実行すれば信頼性の高い結果が得られます。

このビデオを見れば、雌マウス胚性幹細胞の分化を誘導する方法、これらの細胞をどのように固定するか、そしてD-N-A-R-N-Aフィッシュの組み合わせを行うための準備方法についてよく理解できるはずです。このプロトコルで示されているように、実験を成功させるためには、温度とインキュベーション時間を一定に保つことが重要であることを忘れないでください。また、清潔な環境での作業も大切です。

異なる細胞タイプを使用している場合、または異なる生物学的システムを研究している場合、最適な結果を得るためには、何らかの最適化が必要になることがあります。あなたの実験に頑張ってください。