Name: 組み合わせたDNA-RNA蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: 学ぶ DNA-RNA蛍光インプローブハイブリダイゼーション（FISH）を用いて、分化した雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化のメカニズムを研究する方法です。遺伝子発現の調節を理解する上で重要な技術です。

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著者は、過去数年間のエラスムスMCの生殖開発部門の過去および現在のメンバー全員に感謝します。また、有益なフィードバックを提供してくださった 3 人の匿名のレビュアーにも感謝します。Gribnau研究室での研究は、オランダの研究評議会(NWO-VICI)からの資金提供とERCの設立助成金によって支えられています。

1。女性の胚性幹細胞における分化の誘導X染色体の不活性化を誘導するために注：（ご要望に応じて入手可能）雌マウスの胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞（MEFに）でコーティングされたゼラチン化培養皿上で、標準的なES細胞条件下で増殖されています。ここでは、読者は、標準的な細胞培養技術39〜41に精通していることを前提としています。分化を誘導するために、T25皿中で増殖させたES細胞は、MEFのから分離され、分化培地にプレーティングする。 <ol><li> ES細胞培養からES培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。 </li><li> 1.5ミリリットルのトリプシン-EDTAを（37℃に予め温めておいた）を追加し、7分間37℃で細胞をインキュベートする。 3.5分後、コロニーを分割する優しく料理を振る。 </li><li>細胞への分化培地の3.5ミリリットルを追加することにより、トリプシン-EDTAを不活性化する。上下にピペット細胞は、単一細胞溶液を取得し、収集する15mlチューブ中。 200×gで5分間スピンし、分化培地10ml中で細胞を集める。 </li><li>非ゼラチン化培養皿に細胞懸濁液を追加し、細胞培養インキュベーター中で1時間インキュベートする。注：ES細胞懸濁液中に残るのに対し、MEFのは、非ゼラチン化培養皿に接着することができるようになります。 </li><li>一方で、6ウェルプレートに滅菌したガラスカバースリップ（24×24 mm）を追加し、0.2％ゼラチンを追加し、室温で最小5分間インキュベートする。 </li><li> 1時間後、主に非接着ES細胞からなるであろうプレめっきES細胞培養物の上清を回収。カバーグラスを含有する6ウェルプレートにプレートES細胞。注：使用⅙6ウェルプレートの6ウェルについてコンフルエントT25皿の目 。これはよく分化の3日後にコンフルエントの差別化を可能にする。日常的にメディアを変更します。長い分化タイムコース、細菌皿で分化培地中でプレート事前メッキES細胞、およびincub用細胞培養インキュベーター中に組み込ま細胞シェーカー上で食べた。これは、細胞が1〜2日前固定をカバーグラスにメッキすることができる胚様体を形成することができます。 </li></ol>その後、DNA-RNA FISH分析のための分化したES細胞の2。固定<ol><li>分化培養物から分化培地を外し、細胞培養、PBSで2回洗浄します。注：細胞は洗い流されるのを防ぐために慎重にPBSを追加します。 </li><li>細胞培養PBSを除去し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）/ PBSを加えることによって細胞を固定し、室温で10分間インキュベートする。注意：PFAは毒性があり、吸入する場合や、皮膚や目に接触した時に重大な健康リスクを引き起こす可能性があります。さらに、PFAは発がん性がある。 </li><li> 4％PFA / PBSを削除し、70％エタノールでカバースリップ3回洗う。注：PFAの痕跡は、後続のFISH手順を妨害するように正しい洗浄が重要です。カバースリップの前にF数カ月間-20℃で70％エタノール中で保存することができるISH解析。 </li></ol> FISH実験のためのDNAプローブの3。の標識注：目的の遺伝子のDNA断片を得る（RNA FISHのための最小限の長さ&gt; 2キロバイト、またはDNA魚&gt; 20キロバイト）、あるいは目的の遺伝子をカバーするBAC。 RNA検出のために、小さなプローブが最も可能性の高い転写を同時に検出することができる、複数の転写をもたらすので、DNAの検出と比較して十分であることができる。単一コピーDNA鎖上の強い信号は、より長いプローブは、組み込まれたハプテンの十分な数を検出することができるように、必要とされる。好ましくは、非転写ゲノム領域を、DNAプローブを設計するために選択される。 RNAを検出するための小さなプローブを使用する場合に加えて、これは完全に排除できないが、RNAが転写されたゲノム遺伝子座を合わせ、DNA-RNA FISH法で検出されることが防止される。マウスXistのを検出するために、5.5キロバイトのcDNAプローブを用いた。 DET用X染色体のECTION、いくつかのBACプローブを使用することができる。良好な結果がのXist遺伝子座のすぐ近くに位置していたBAC RP23-100E1およびBAC CT7-474E4、の混合物で得られている。目的の遺伝子や染色体に応じて、いくつかの異なるプローブが最適な結果を得るために必要とされる場合があります。たびに、滅菌フィルターチップを使用し、RNA-FISHのために使用される材料を扱う、RNA分解酵素フリーのH 2 O、およびクリーンな環境で動作します。 <ol><li> 1μgのDNAを取り、16μlの全容量を H 2 Oに希釈する。ジゴキシゲニンまたはビオチン標識液4μl加え（試薬を参照）、ボルテックスで混和し、90分間16℃でインキュベートする。注：ビオチンまたはジゴキシゲニン標識ヌクレオチドは現在、ニックトランスレーションによって組み込まれます。 </li><li>一方、非統合型ヌクレオチドを​​除去するためにG50の列を用意しております。 、2ミリリットルの注射器を取るスタンパーを削除し、シリンジに滅菌綿を追加します。解TにG50ボールを追加O 1分間642×gで15ミリリットルチューブおよび遠心分離器で注射器を配置し、注射器を埋める。注：注射器の約80％が現在、G50で埋めなくてはなりません。少ないG50が存在するときに繰り返します。 </li><li> 90分後、ニックトランスレーション反応混合物に、H 2 Oを40μLを追加し、G50カラムへの反応を追加します。列の下にある空のチューブを追加し、2分間642×gで遠心する。反応チューブ内を通る流れを集める。 </li><li>ピペットで通る流れの体積を測定し、総容量200μlに到達するために、H 2 Oを加える。 13.3μlのサケ精子DNA（10 mg / ml）を、13.3μlの酵母tRNA（10 mg / ml）を、26.7μlのマウス用ベッド-1 DNA（1 mg / ml）を28μlの2 MのNaAc、pHを添加することによって通る流れを沈殿させる5.6。ボルテックスで混和し、533μLの氷冷100％エタノールを加える。 4℃で30分間16200×gでチューブ、遠心分離を振る</li><li>上清を除去し、70％エタノールで2回ペレットを洗浄。で5分間16200×gで遠心分離4℃、空気ペレットを乾燥する。 50 +ハイブリダイゼーション溶液の50μlを加えて、溶解を容易にするために30分間37℃でインキュベートする。 NOTE：標識プローブは、-20℃で数年間保存することができる注意：50 +ハイブリダイゼーション溶液は、毒性があり、皮膚、目や呼吸器系を刺激することができ、また、催奇形物質であるホルムアルデヒドが含まれています。 </li></ol> 4。透過処理、複合DNA-RNA魚固定した細胞の前処理及びハイブリダイゼーション<ol><li> 70％エタノールおよび6ウェルプレートに細胞培養PBSの添加を除去することにより、カバースリップ上に固定した細胞を再水和する。 5分間インキュベートします。合計3回繰り返します。 </li><li>細胞培養、PBSを外し、6穴プレートに0.2％のペプシンを加え、細胞を透過する。 4分間37℃の水浴中で6ウェルプレートをインキュベートする。ペプシンを削除し、RNA分解酵素フリーのH 2 Oで不活性化する</li><li>室温で5分間、4％PFA / PBSでインキュベートすることにより接尾細胞。 fixati後に上で5分間、細胞培養をPBSで2回洗浄する。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノールでインキュベートすることによって細胞を脱水する。転送は、6ウェルプレートのうちカバースリップ、数分間空気乾燥したカバースリップ。 </li><li>熱板上で1時間65℃でカバースリップをインキュベートすることによって、年齢細胞。 </li><li> 、分析しようとするすべてのカバースリップのために一緒に追加することにより、マウスCOT-1 DNAとFISHプローブをプレハイブリダイズ50 +ハイブリダイゼーション溶液25μL、0.5μLマウスCOT-1 DNA、ビオチン標識のXistプローブの1μLおよびジゴキシゲニンの1μL X染色体を検出するラベルされたBACプローブ。ボルテックスで混和し、5分間99℃で変性する。プローブ中に存在する配列を繰り返すようにハイブリダイズする簡易ベッド-1 DNAを可能にするために、45分間37℃で直ちにインキュベートする。 </li><li>熟成後、スライドガラス上に（SSC/10 10mMのリン酸緩衝液formamide/2x 70％からなる）変性緩衝液50μlをスポットし、細胞がtowarに対向して上にカバースリップを置く変性緩衝DS。 2分間65℃でインキュベートする。 </li><li> 5分間氷冷70％エタノール中でインキュベートすることによってバック6ウェルプレートにカバースリップ、およびポストフィックスセルを追加する。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。 </li><li>スライドガラス上に事前にハイブリダイズしたプローブを見つけ、その上にカバースリップをインキュベートする。場所のSSC formamide/2x 50ミリリットル50パーセントで満たされた加湿チャンバー内にスライドし、37℃で一晩インキュベート</li></ol> 5。ハイブリダイゼーション後の洗浄およびプローブの抗体仲介検出<ol><li> 2×SSCで6ウェルプレートに充填し、前加温42℃まで一晩のインキュベーションの後にカバースリップを追加し、5分間42℃でインキュベートする。 </li><li> 2×SSCを取り外し、42℃で10分間50％formamide/2x SSCでカバースリップをインキュベート合計3回（全部で洗浄30分）に繰り返します。 </li&gt; <li> SSC formamide/2x 50％を削除して、室温で2×5分間トリス生理食塩水 - ツイーン（TST）でスライドを洗浄します。 </li><li>スポット50μlの新しいスライドガラス上カバースリップあたりのトリス - 生理食塩水-BSA（TSBSA）し、TST加湿暗室において室温で30分の間に遮断するための上下を逆にカバースリップをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>新しいガラススライド上にスポットカバースリップあたりのヒツジ抗DIG抗体（TSBSA中1:500）を50μl、およびTST加湿暗室において室温で30分間の最初のインキュベーション工程のためのカバースリップの逆さまをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50ウサギ抗ヒツジ新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合した抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第2のインキュベーション工程のために逆さまカバースリップを下にインキュベート。 </li><li>トランスFERはバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりFITC（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗ウサギ抗体液、およびTST加湿暗室中、室​​温で30分間の第三のインキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりのマウス抗ビオチン抗体の液（TSBSA中1:200）とTST加湿暗室において室温で30分間の第四インキュベーション工程のために逆さまにカバースリップをインキュベートする。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50新しいガラススライド上にカバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と共役ロバ抗マウス抗体μlの、および逆さまTST加湿暗CHAMB中、室温で30分間の第五のインキュベーション工程のためにカバースリップをインキュベートするER。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。 </li><li>スポット50の新しいスライドガラス上カバースリップあたりローダミン（TSBSA中1:250）と結合したヤギ抗馬の抗体のμL、およびTST加湿暗室において室温で30分間の第六のインキュベーションステップのために逆さまにカバースリップをインキュベート。 NOTE：ヤギ抗ウマ抗体は、ロバ抗マウス抗体を認識するであろう。とき研究者が利用できる、ヤギ抗ロバ抗体も同様に動作します。 </li><li>転送はバック6ウェルプレートにカバースリップし、TSTで2×5分を洗う。トリス生理食塩水（TS）でさらに5分間洗浄します。 </li><li> 3分間、3分間、3分間、100％エタノール、90％エタノール、70％エタノール中に後続のインキュベーションによって細胞を脱水する。 6ウェルプレートからカバースリップを外し、数分間空気乾燥してみましょう。 </li><li>スライドガラス上に（試薬を参照）DAPIで封入剤のドロップを見つけ、その上に逆さまにカバースリップを追加します。マニキュアでスライドをシールし、蛍光顕微鏡によってFISH結果を評価（ 図1）。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

DNAの魚に適した条件が少なく、安定したRNA分子のためにあまりにも過酷なように組み合わせたDNA-RNA FISHは、技術的に挑戦することができます。いくつかのアプローチは、DNAおよびRNAの両方を検出するプローブとの同時インキュベーションの必要性を回避し、同じ細胞においてDNA及びRNAの両方を研究するために適用されている。例えば、重畳アプローチにおいて、最初のRNA FISHが行われ、細胞が撮像され、その座標が取られる。その後、同じスライドをRNA FISHの信号が失われている間、DNA FISHのために使用される。 DNA FISH後、細胞を再び撮像して、RNAおよびDNA FISHの両方から得られた画像が重畳される。固定した細胞のDNAは安定しており、初期のRNA FISHのために必要な処置によって影響を受けないように、このアプローチは、ほとんどの場合では使えますが、これは、少なくとも4日間の費用がかかりますが非常に手間のかかるアプローチです。別のアプローチでは、第一のRNA FISHが行われ、RNAのFISH信号はoを添加することによって固定されているDNAのFISHを適用した後のfの固定剤、。また、このアプローチは動作...

蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用いて細胞や組織を研究することは、1、1970年代後半に導入されて以来、細胞内レベルでのクロマチン組織と遺伝子発現、研究者は遺伝子を研究することができました。 DNAのFISHは、しばしば細胞遺伝学、核型2、癌診断3と着床前遺伝子検査4で使用され、それはそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にするので、分子の研究5-6において重要な役割を有している。 RNA FISHによる単一細胞発現解析は、天然の一次転写産物を検出することができるし、非コードRNAは、染色体から転写され、例えばを含む集団レベルでの遺伝子発現を評価する他の技術に利点を提供する定量的RT-PCR、ゲノムワイド発現分析またはノーザンブロッティング。それらの起源部位から直接由来するRNA転写産物を可視化することにより、例えばあった遺伝子発現は7確率的であり、時には8対立遺伝子特異的であることができることに気づいた。技術の改善はあっても、細胞9月11日内の単一mRNA分子の検出および定量を可能にした。 FISHの基本原理は非常に特異的ワトソンとクリックの塩基対形成によって、核酸プローブに細胞内の核酸のハイブリダイゼーションで構成されています。プローブは、顕微鏡的に可視化することができるシグナルを生じる、直接的または間接的に検出することができる。最初の試みは、安全性の問題、制限された空間分解能と時間12月14日に1つだけの標的を検出する能力に基づいて欠点を持っていた放射性標識プローブ、から構成されていた。蛍光色素、ハプテン、および酵素などの非放射性標識のその後の開発は、ルーチン的な分子生物学技術としてFISHの普及使用を可能にした。 FISHプローブは、直接的fluorochで標識することができる核酸の蛍光分子の化学結合によるromes 15及び蛍光標識ヌクレオチドの組込み16-19配列、またはプローブを間接的にコンジュゲートしたハプテン特異的抗体によって（ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む）ハプテンの統合およびハプテンの免疫学的検出の後に可視化することができる蛍光レポーターは、20〜21の分子が含まれる。後者のアプローチは、元の信号を増強するために使用される蛍光標識された抗体のいくつかの層を用いてシグナル増幅を可能にし、低レベルで発現されるRNA種の検出を可能にする。直接的および間接的な標識技術および種々のハプテンを組み合わせることによって、いくつかのターゲットが同時に同じ細胞内で可視化することができる。 FISHプロトコルにおける最も重要な工程の一つは、その標的へのプローブのハイブリダイゼーションである。理論的には、プローブは、具体的には、実際には、唯一のその標的へのこの特異的に結合するであろうがプローブは相同領域に結合すること、およびハイブリダイゼーション条件は、常に特定のDNA領域またはRNA種のための理想的ではないでしょう、いつものように、達成されない。それらはFISH手順のストリンジェンシーを増加させることができ、背景雑音の高レベルをもたらすFISHプローブの非特異的結合を防止することができるように、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、したがって、特に重要である。 RNA分子は、一本鎖されると、それらは容易にFISHプローブにハイブリダイズすることができる。対照的に、二本鎖DNA分子は、第一プローブがハイブリダイズすることができ、その後の変性工程を必要とする。これは、通常、DNAの変性をもたらす試料の加熱によって達成される。しかし、これらの過酷な条件下では、壊れやすい、一本鎖RNA分子が失われる可能性があります。したがって、合わせたDNA-RNA FISH条件の有意な最適化を必要とし、唯一のRNAまたはDNAの分離検出と比較して、より技術的に困難である。 ここでは、プレゼン私たちは、雌マウスの胚性幹細胞の22〜24の差別化X染色体の不活性化（XCI）を研究することができました組み合わせて、同時DNA-RNA魚TA詳細なプロトコル。 XCIは、女性の胚発生25のために重要なエピジェネティック機構であり、ヘテロクロマチンをもたらし、ひいては女性の個体では2本のX染色体の1 26〜27のサイレン。このプロセスに不可欠RNF12 22〜23とREX1 24タンパク質によって制御されている非コードRNAはXistの 28〜30は 、ある。Xistの発現は、胚発生中またはin vitroでのES細胞の分化の際に、将来の不活性X染色体（XI）にアップレギュレートになる、およびX染色体に沿って広がり、それによってX染色体31の転写シャットダウンするクロマチンリモデリング酵素を引き付けることができる。このXistの RNAの広がりは、X染色体のコーティングとしてRNA FISHによって可視化することができるいくつものXist雲とも呼ばれる。女性のES細胞は、ゲノム不安定性に起因し、そのX染色体の1を失う可能性がありますので、他は唯一の核型、安定した細胞は、この重要なプロセス22,32の分析で評価していることを確認するために、XCIを研究するために結合するDNA-RNA魚を採用している-34。すべての分子生物学技術と同様に、いくつかの異なるプロトコルが優れた35-38を公開されている。ここでは、プローブのハイブリダイゼーション、透過処理およびその後のプローブの取り込みを可能にするために、マウスES細胞、細胞の固定、ニックトランスレーションによるFISHプローブを標識する、固定された細胞の前処理における分化誘導から始めて、我々の方法を提示ターゲット、そして最終的に蛍光標識した抗体によるプローブの検出。プロトコルは提示され、ここには2日間の期間内のXist RNA及びX染色体の忠実な検出を可能にし、この技術の基本はそうOTに適合させることができる彼女のシステムや研究の分野。

<table><tbody><tr><td>雌マウス胚性幹細胞</td><td></td><td></td><td>は、</td></tr><tr><td>E13.5胚から、または商業的なソース例えばミリポア</td><td></td>ES細胞培養培地に由来することができます。<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>DMEM、15%ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン、非必須アミノ酸、0.1 mM &#947;-メルカプトエタノール、および1,000 U/ml LIF。フィルター滅菌し、4&#176で保管します。Cは最大2週間。</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash;ストレプトマイシン (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES 細胞分化培地</td><td></td><td></td><td>IMDM-Glutamax, 15% 熱不活化ウシ胎児血清, 100 U/ml ペニシリン, 100 mg/ml ストレプトマイシン, 非必須アミノ酸, 37.8 &#956;l / Lモノチオグリセロールおよび50&#956;g/ml アスコルビン酸</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸 (50 mg/ml)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>6-well 細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養グレード PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.25% (v/v) トリプシン/0.2% (w/v) PBS</td><td>の EDTA Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 mm カバースリップ</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>0.2% ゼラチン/細胞培養 PBS 溶液を準備し、オートクレーブ</td>します。</tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>0.01 M HCl (pH 2.0)で0.2%に希釈</td></tr> <tr><td>絶対100%エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>絶対100%エタノールとRNAseフリー水を使用して70%および90%エタノール溶液を作る</td></tr><tr><td></td><td>バクスター</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターチップ</td><td>レイニンバイオクリーン</td><td>GP-L10F、GP-L200F、RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>ジゴキシゲニンラベリングキット(DIG-Nick翻訳)</td><td>ロシュ</td><td>11745816910</td><td></td></tr><tr><td>ビオチンラベリングキット(ビオチンニック翻訳)</td><td>ロシュ</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>セファデックスG50</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>2mlシリンジ</td><td>BDプラスティパック</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブエ</td><td>ッペンドルフ</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>酵母 tRNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子 DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>マウスベビーベッド-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフベンチトップ微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>モデル 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc、pH 5.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ ハイブリダイゼーション溶液</td><td></td><td></td><td>50% ホルムアミド、2x SSC、50 mM リン酸緩衝液 pH 7、10% デキストラン硫酸塩 pH 7</td></tr><tr><td>ホルムア</td><td>ミド Acros 有機物</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸</td>塩 <td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 mM リン酸緩衝液、pH 7</td><td></td><td></td><td>57.7 mLの1 M Na2HPO4と42.3 mLの1 M NaH2PO4を追加します。DEPC 処理水およびオートクレーブ</td></tr><tr><td>変性緩衝液</td><td></td><td></td>を使用 <td>70% ホルムアミド/2x SSC/10 mM リン酸緩衝液 pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7.5 溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-saline-Tween 洗浄液 (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x 生理食塩水、50 ml 2M Tris、500 &#956;l Tween-20、1 L</td></tr><tr><td>10x生理食塩水</td><td></td><td></td><td>85 gのNaClを1 L RNAseフリーH2Oに溶解</td></tr>するまでRNAseフリー水を加え、オートクレーブ<tr><td>Tris-saline-BSA(TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956;l 10x生理食塩水、250 &#956;l 2 M Tris、1 mL 100x BSA、3.25 ml RNAse フリー H2O</td></tr><tr><td>BSA、精製、100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>羊抗 dig 抗体</td><td>Roche diagnostics</td><td></td><td>使用 1:500 を TSBSA</td></tr><tr><td>ウサギ抗羊抗体</td>で希釈し、FITC <td>Jackson で結合 Jackson labs</td><td></td> で 1<td>:250 を TSBSA</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ抗体</td>で希釈<td></td><td></td>ラボでは、TSBSAマウス抗ビオチン抗体<td>で希釈した1:250</td></tr>を使用 <tr><td></td><td>ロシュの診断</td><td></td>では、ローダミン・ジャクソンと結合したTSBSAロバ抗マウス抗体<td>で希釈した1:200</td></tr>を使用 ラボ<tr><td></td><td></td>では、ローダミン・ジャクソン<td></td>と結合したTSBSAヤギ抗ウマ抗体で希釈して1:250を使用 ラボでは、TSBSAトリス生理食塩水洗浄液(TS)<td>で希釈した1:250</td></tr>を使用<tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10 ml 10x 生理食塩水、5 ml 2 M Tris、85 ml RNAse free H2O</td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤、DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ネイルワニス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光ミスクロスコープ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

組み合わせたdna-rna蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（fish）差別雌マウス胚性幹細胞におけるx染色体の不活性化を研究するために、

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞中の核酸の検出を可能にする分子技術である。 DNAのFISHは、多くの場合、細胞遺伝学および癌の診断に使用され、多くの場合、重要な臨床的意義を有するゲノムの異常を検出することができる。 RNA FISHは、細胞内でRNA分子を検出するために使用することができ、遺伝子発現の調節において重要な洞察を提供した。同じセル内でDNAとRNA FISHを組み合わせることにより、DNAのFISHに適した条件が壊れ、一本鎖RNA分子に対する厳しすぎるかもしれないような、技術的に困難である。ここでは、X染色体にコードされるのXist RNAとDNAの複合、同時検出を可能にし、容易に適用可能なプロトコルを提示する。この結合されたDNA-RNA FISHプロトコルは、おそらくRNAとDNAの両方を検出する必要がある他のシステムに適用することができる。

合わせたDNA-RNA FISHのための上述したプロトコルを用いて、我々は、女性の胚性幹細胞を分化におけるX染色体不活性化を可視化することができた。1は、我々 は Xistの （あるの両方を検出したDNA-RNA FISH実験の代表例を示す図不活性X染色体上のいわゆるのXist RNAの雲とアクティブX染色体上の基礎転写ピンポイント）と、ピンポイント信号として表示されているX染色体の領域として見える。それによってXistの雲が実際に沿って局在化、およびX染色体を被覆していることを示す、ピンポイント信号のいずれかがXistのクラウド内に配置されている。細胞の99％以上では（データは示していない）正しいDNAシグナルを我々のプロトコルを使用して検出する。 RNA-FISHと比較して、Xistの雲が組み合わされ、DNA-RNA FISH法を用いて可視化変性したDNAが大きな面積を占めるように見えるように、時には大きく見える。私たちは、OBを持っているヒト...

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

本手順の全体的な目的は、DNAとRNAの蛍光in situハイブリダイゼーションを同時に組み合わせた手法（DNA-RNA FISH）を用いて、分化した雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活化を研究することです。これは、まず雌マウス胚性幹細胞に分化を誘導することによって達成されます。正常な着床後の胚発生を模倣するこの過程において、X染色体不活化が開始され、その結果、将来的に不活化されるX染色体をコードするXist RNAの転写促進と蓄積が起こります。第2ステップでは、パラアルデヒドを用いて分化させた胚性幹細胞を固定します。次に、ニックトランスレーション法を用いてDNA断片をビオチンまたはジゴゲニンで標識し、X染色体由来のDNAおよびcyst RNAの両方を検出するためのプローブを調製します。最終ステップは、DNA-RNA FISH法を行うことです。分化した胚性幹細胞を透過処理し、変性させた後、標識されたFISHプローブをハイブリダイズさせます。その後、プローブ中のビオチンまたはジゴゲニンを検出する蛍光標識抗体を用いて検出を行います。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、女性細胞における2本の染色体の位置を確認し、不活性化が起こるX染色体からのcyst RNAの発現を可視化します。RNAとDNAを逐次的に検出するFISH法などの他の手法と比較した本手法の主な利点は、本プロトコルを用いることで、2日以内に同一検体中の両方の核酸を同時に検出できる点にあります。DNAとRNAの検出に最適な条件は大きく異なるため、DNAおよびRNAの複合FISHの実施は困難な場合がありますが、ここに提示したプロトコルを用いることで、解析したほぼすべての細胞において、両方のX染色体に由来するRNAおよびDNAを検出することが可能です。これにより、雌マウス胚性幹細胞の分化過程や、雌マウスの異常な発生過程で起こっているX染色体の活性化を研究することが可能になりました。この手法は、マウスの初期胚発生における重要かつ興味深い過程であるX染色体の活性化プロセスの知見を提供しますが、ネイティブなクロマチン由来のRNA転写物を検出することが重要な他の生物学的システムにも適用できると考えられます。非コードRNAが生物学的システムにおいて重要であることがますます認識されており、細胞集団全体を評価する代替手法よりも、シングルセルアプローチが好まれる傾向にあるためです。本プロトコルが幅広い科学コミュニティにとって有用であることを期待しています。分化誘導の手順を開始するため、雌マウス胚性幹細胞（ESL）を、マウス胚性線維芽細胞（MEFs）でコーティングしゼラチン化した培養皿を用い、標準的なESL条件下で培養します。ESL培養液を除去し、細胞培養用PBSで2回洗浄します。37°Cに予熱したTRIPSIN EDTAを1.5 mL加え、細胞を37°Cで7分間インキュベートします。3.5分後、培養皿を軽く揺らしてコロニーを分散させます。細胞に3.5 millilitersの分化培地を加えてtrypsin EDTAを不活化し、ピペッティングにより単一細胞懸濁液として回収して15 milliliterチューブに移します。200 Gsで5分間遠心分離します。10 millilitersの分化培地で細胞を回収した後、細胞懸濁液を非ゼラチンコートの10 centimeter培養皿に加え、1時間インキュベートします。細胞培養インキュベーター内では、MESは非ゼラチンコートの培養皿に接着しますが、ES細胞は懸濁状態のままとなります。その間に、滅菌済みのガラスカバースリップを6ウェルプレートに入れ、0.2%ゼラチンを加えて最低5分間インキュベートします。1時間後、室温で事前調製したE SL培養液の上澄み液を回収します。これは主に非接着性のE SLで構成されています。E SLを希釈した後、カバースリップを入れた6ウェルプレートに播種します。分化培地を分化培養液から除去し、細胞培養用PBSで2回洗浄することからこの手順を開始します。細胞が洗い流されないよう、PBSは慎重に加えてください。4%パラホルムアルデヒドPBSを加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。10分後、パラホルムアルデヒドを除去し、カバーガラスを70% ethanolで3回洗浄します。ラベル化用のDNAプローブを調製するには、まず、それぞれのDNA 1 µgを水で希釈し、全量を16 µLにします。次に、ボルテックスで混合したdigoxigeninまたはbiotinラベル化溶液を4 µL加え、16 °Cで90分間インキュベートします。これにより、NIC翻訳によってビオチンまたはdig酸素標識ヌクレオチドが組み込まれます。その間に、G 50カラムを準備します。未統合のヌクレオチドを除去するため、2 mLシリンジを用意し、プランジャーを外して滅菌綿をシリンジに入れます。G 50ボールと溶液を加え、シリンジを満たします。次に、シリンジを15 milliliterチューブに入れ、642 GSで1分間遠心分離します。遠心分離後、シリンジの約80%がG 50で満たされているはずです。90分後、各NIC翻訳反応混合物に40 microlitersの水を加え、反応液をG 50カラムに移します。カラムの下に空のチューブを配置し、642 Gsで2分間遠心分離します。流出液を反応チューブに回収します。ピペットで流出液の量を測定し、その後、全量が200 microlitersになるまで水を加えます。フロースルーを沈殿させるため、サケ精子DNA、酵母tRNA、マウスCaught 1D NA、および2 Mの酢酸ナトリウムを加え、ボルテックスで混合します。氷冷した100%エタノールを533 µL加え、チューブを振盪させた後、4°Cで16,200 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを70%エタノールで2回洗浄します。4°Cで16,200 ×gにて5分間遠心分離し、ペレットを風乾させます。ペレットが乾燥したら、50 µLの50×ハイブリダイゼーション溶液を加え、37 °Cで30分間インキュベートします。透過処理前に溶解を促進するため、70% ethanolを除去して細胞培養用PBSを細胞に加えることで、固定細胞を再水和させ、スライドガラスを露出させます。5分間インキュベートし、細胞を完全に遊離させるため、この操作を計3回繰り返します。細胞培養用のPBSを除去し、6ウェルプレートに0.2% trypsinを添加します。プレートを37°Cのウォーターバスで4分間インキュベートします。その後、ペプシンを除去し、RNA free waterで不活性化します。固定後、細胞を4%paraform aldehyde PBS中で室温で5分間インキュベートして後固定し、細胞培養液またはPBSで5分間、2回洗浄します。70%ethanolで3分間、90%ethanolで3分間、そして100%ethanolで3分間インキュベートし、細胞を脱水します。その後、カバーガラスを6ウェルプレートから移し、数分間乾燥させます。ホットプレートを用いてカバーガラスを65 °Cで1時間インキュベートし、細胞をエージングさせます。その間に、解析予定のカバーガラス1枚につき、FISHプローブとマウスコート1D NAを合わせて加え、プレハイブリダイゼーションを行います。50×ハイブリダイゼーション溶液25 µL、ビオチン標識cystプローブ1 µL、X染色体を検出するジゴキシゲニン標識BACプローブ1 µL、およびマウスCot-1 DNA 0.5 µLを加え、ボルテックスで混合した後、99 °Cで5分間変性させます。直ちに37 °Cで45分間インキュベートし、Cot-1 DNAをプローブ中の反復配列にハイブリダイズさせます。カバーガラス上の細胞を熟成させた後、ガラススライド上に脱成熟緩衝液を50 µL点滴し、細胞面を脱成熟緩衝液に向けてカバーガラスを載せます。65 °Cで2分間インキュベートします。氷冷した70% ethanolをあらかじめ満たした6ウェルプレートにカバーガラスを戻し、5分間インキュベートして細胞を後固定します。70% ethanolで3分間、90% ethanolで3分間、次に100% ethanolで3分間、順次インキュベートして細胞を脱水します。6ウェルプレートからカバーガラスを取り出し、数分間自然乾燥させます。ガラススライド上にプレハイブリダイズ済みのプローブをスポットし、その上にカバーガラスを載せてインキュベートします。スライドを50 mLの50% IDE 2 X SSCを満たした加湿チャンバーに入れ、37 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、ガラススライドからカバーガラスを、42 °Cに予熱した2 X SSCを満たした6ウェルプレートに移します。42 °Cで5分間インキュベートします。2X SSCを除去し、50% formamide含有2X SSCを添加します。42°Cで10分間インキュベートします。50% formamide含有2X SSCで、1回あたり42°Cで10分間の洗浄を計3回行います。3回目の洗浄後、50% 形式の2 XSSCを除去し、スライドをTris Saline Tween（TST）で室温にて5分間2回洗浄します。ブロッキングのため、50 µLのTris Saline BSA（TSBSA）を滴下します。カバーガラスを新しいガラススライドに乗せ、カバーガラスをスライド上で裏返しにします。TSTを用いた室温の加湿暗室内で30分間インキュベートします。30分後、カバーガラスを6ウェルプレートに戻し、TSTで5分間2回洗浄します。一次抗体インキュベーションのため、新しいガラススライド上の各カバーガラスに50 µLの羊抗原抗体を滴下し、カバーガラスをスライド上で裏返しにします。TSTを用いた室温の加湿暗室内で30分間インキュベートします。その後、付属の論文に詳述されている通り、元のシグナルを増強するために、一連の蛍光標識抗体を用いてカバースリップをインキュベートします。一連の蛍光標識抗体によるインキュベーション後、70% ethanol、90% ethanol、100% ethanolの順にそれぞれ3分間インキュベートし、細胞を脱水します。6ウェルプレートからカバースリップを取り出し、数分間自然乾燥させます。最後に、各ガラススライドに封入剤を1滴滴下します。カバーグラスを逆さまに乗せ、ネイルバニッシュでスライドを密封します。このDNA-RNA FISH併用プロトコルを用いることで、分化中の雌性ES細胞におけるX染色体不活性化を可視化できます。この図は、シストRNAとX染色体領域の両方を同時に検出したA-D-N-A-R-N-A FISH実験の代表的な例を示しています。Cyst RNAは、X染色体不活性化の過程に不可欠な非コードRNAです。ここでの分化中の雌性ESLにおいて、Cyst RNAはビオチン標識CD NAプローブを用いて検出され、ルミニに接合させた抗体を用いて可視化され、赤色で示されています。X染色体は、標識されたBACプローブを用いて検出され、FITC結合抗体を用いて可視化されます（緑色で表示）。核はDAPIで対比染色されています（青色で表示）。ほぼすべての細胞において、2つのX染色体が検出されます。不活性化X染色体上の大きなシグナルの集積（シストクラウド）と、活性化X染色体からの基底的なシグナル発現（シストピンポイント）の両方が検出されます。分化に伴い、将来の活性化X染色体においてこの基底的なcyst発現が停止するため、すべての核でcyst pinpointが検出されるわけではありません。X染色体由来のpinpointシグナルの一部がcyst cloud内に位置していることに注目してください。これは、cyst cloudが実際にX染色体に沿って局在し、習得後はX染色体をコーディングしていることを示しています。この手法は、適切に実施すれば2日未満で完了し、信頼性の高い結果を得ることができます。このビデオを視聴することで、雌マウス胚性幹細胞の分化誘導方法、これらの細胞の固定方法、およびDNA-RNA FISHの併用解析を行うための準備方法について十分に理解できるはずです。実験を成功させるためには、本プロトコルに記載されている温度とインキュベーション時間を一定に保つことが重要であることを忘れないでください。また、清潔な環境で作業することも重要です。別の細胞種を使用する場合や、異なる生物学的システムを研究する場合は、最適な結果を得るためにいくつかの最適化が必要になる可能性があります。実験の成功をお祈りしております。

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶ DNA-RNA蛍光インプローブハイブリダイゼーション（FISH）を用いて、分化した雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化のメカニズムを研究する方法です。遺伝子発現の調節を理解する上で重要な技術です。

組み合わせたDNA-RNA蛍光

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