一チャネルセル付パッチクランプ法

この手順の全体的な目標は、単一のイオンチャネルを流れる電流を測定することです。これは、最初に目的のイオンチャネルを異種発現させることにより、取り扱いが容易で実験目標に有利な細胞に存在します。2番目のステップは、ファイヤーポリッシュピペットを使用して、細胞膜に安定したシールを得ることです。

次に、実験者はパッチに存在するチャネルの数を決定する必要があり、それが単一チャネルの記録電流である場合、最後のステップはデータの処理と分析です。最終的には、単一のイオンチャネルからの電流を記録することで、これらの膜タンパク質が作用する生物物理学的特性を調べることができ、神経細胞やその他の興奮性細胞のコミュニケーションの基礎となります。複数の活性イオンチャネルを流れる電流を測定する方法とは対照的に、このアプローチの利点は、個々のイオンチャネルを流れる電流を測定することで、特定のイオンチャネルに固有の幅広い応答パターンを可視化し、分離できることです。

この方法は、生理学的および治療的モジュレーターがニューロン間のコミュニケーションに影響を与えるなど、神経科学分野の重要な質問に答えるために使用できます。一般に、この手法に不慣れな人は、単一のイオンチャネルのみを含む低ノイズ記録を取得するのが難しいため、苦労するでしょう。この方法を最初に試みるとき、誰かがそれを行うのを見るのは本当に便利です、なぜなら、この方法で最も重要なことである本当に安定したシールを得るためには、特定の角度で細胞に穏やかにアプローチする必要があり、そして最も重要なことは、トランスフェクションの準備を粘り強く行う必要があるからです。

HEK 2 93細胞は、1日前に35ミリメートル皿に播種され、滅菌チューブ内で50〜60%のコンフルエントになります。トランスフェクション混合物を調製します。対象の各CDNAの1マイクログラム、315マイクロリットルの二重蒸留水、および350マイクロリットルの42ミリモルヒープを追加します。

最後に、35マイクロリットルの塩化カルシウムを滴下して沈殿物を形成します。チューブを5秒間ボルテックスし、4つのディッシュのそれぞれに175マイクロリットルのトランスフェクション懸濁液を追加します。前日に盛り付けました。

細胞を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、PBSで洗浄します。次に、2ミリリットルの成長培地を追加し、2ミリモルの塩化マグネシウムを補充して、MDA受容体を介した興奮毒性を防ぎます。

まず、垂直プーラーを使用して、男の子のケイ酸塩ガラスから2つの対称的な記録ピペットを引き出します。次に、適切な直径と抵抗を得るためには、火磨きが必要です。次に、QUBデータ集録ソフトウェアを開き、集録ウィンドウを選択して、集録用に設定します。

レイアウトの下。新しいデータをクリックして新しいQUBデータファイルを開き、使用する実験パラメータを入力します。振幅スケーリングを0.1ボルト/ピコに調整するにはampデータファイルを右クリックし、プロパティを選択して、データタブをクリックします。

培地をカルシウムとマグネシウムを含む2ミリリットルのPBSと交換した後、細胞の皿を顕微鏡ステージに取り付けます。位相差顕微鏡を使用して細胞野に焦点を当て、細胞が健康で単層的に皿によく付着していることを評価します。蛍光検出に切り替えて、トランスフェクションが成功したことを確認します。

次に、シングルチャンネル録音のパラメータを設定します。モードを電圧に設定しますtageclamp 電圧保持コマンドで印加電圧をプラス100ミリボルトにします。オフの位置で、蛍光と全体的な外観に基づいてシールテストボタンを選択します。

パッチを適用する細胞を選択し、位相差の下で、細胞が皿にしっかりと付着していること、パッチのために細胞表面の大部分が露出していること、それ以外は健康に見えることを確認します。研磨したばかりのピペットにNMDA受容体や細胞付着実験に適した溶液を入れ、静かにフリックして気泡を取り除きます。録音ピペットをに固定します amplifierヘッドステージで、銀線がピペット溶液に浸されていることを確認して、浴液がピペットに入るのを防ぎます。

アプローチ中は、ピペットホルダーに接続された小さなプラスチック製シリンジを使用して、陽圧を静かに加えます。次に、マイクロマニピュレーターを使用してピペットをバスに向けます。電気回路を閉じ、パッチ適用用に選択したセルの真上に配置します。

お風呂に入るときはオシロスコープに注意してください。ピペットの抵抗は、顕微鏡でパイプの位置を視覚的に監視し、オシロスコープで電気的に耐性を監視しながら、最適な範囲内にある必要があります。ピペットが細胞に穏やかに衝突するまで、少しずつアプローチを続けます。

テスト信号はわずかに減少し、抵抗の増加を示します。シールを形成するには、シリンジを手に取り、横方向のチューブを通してわずかに負圧を静かに加えます。シリンジを引くと、プランジャーシールの形成は、オシロスコープ上のテスト信号波形が完全に平坦化することによって示されます。

アンプで。外部コマンドのトグルをシールテストからオフに切り替えます。電圧保持コマンドをオフから正に切り替え、ゲインを 10 x から 100 x に増やします。

オシロスコープでチャネルのアクティビティを観察します。チャネルアクティビティが存在する場合は、以前は平坦だったベースラインから直角の下向きのたわみとして表示されます。オシロスコープにチャンネル・アクティビティが表示されている場合は、再生ボタンを押してから録音ボタンを押して、QUBで前に開いたデジタル・ファイルへのデータ集録を開始します。データ集録を停止するには、QUBの停止ボタンを押してQDFファイルを保存します。信号が完全に平坦化しないか、ベースラインがノイズが多く不安定になる場合は、シールが弱いことを示している可能性があります。

この場合、ピペットを取り外して廃棄し、適切なシールが得られるまで新しいピペットで進行手順を繰り返します。データ解析プロセスを開始するには、記録したデータファイルをQUBで開き、プレインターフェースで現在のトレースを検査します。レイアウトの下。

デジタル フィルタを取り外して、記録されたトレースを全帯域幅で表示するには、[fc] というラベルの付いたボックスをオフにします。トレースを視覚的にスキャンして、不規則性やアーティファクトを見つけます ブリーフ。電流スパイクは、同じコンダクタンスクラスの隣接するクリーン領域を強調表示することで修正できます。

右クリックして[最初に消去バッファを設定]を選択し、個々のサンプルポイントが表示されるまでスパイクを拡大します。置き換える領域を、この領域のみを強調表示して選択します。右クリックして [消去] を選択し、レコード全体のベースラインを修正します。

ゼロ電流ベースラインを定義するには、ベースラインが安定しているレコードの早い部分を選択します。右クリックを強調表示し、[ベースラインの設定]を選択します。基本ガイドラインが表示されたら、ベースラインレベルを正確に表していることを目視で確認します。

レコード内で、生データのベースラインが設定されたベースラインから目に見えて逸脱しているポイントを特定します。これを修正するには、逸脱領域内のベースラインの小さなセクションを選択します。右クリックして、[ベースライン ノードの追加] コマンドを選択します。

レコードに過剰なノイズやアーティファクトがあり、簡単に修正できない期間が時折含まれている場合は、これらの部分を削除する必要がありますが、最初に連続するセグメントに分割する必要があります。破棄する領域の直前を強調表示します。右クリックして[セグメントの分割]を選択します。

これに続いて、破棄するセクションを強調表示し、右クリックして選択し、削除し、Enterキーを押してレコードを理想化します。レイアウトの下のMODインターフェースに切り替えます。データ表示パネルで、クローズ・イベントとオープン・イベントの両方を含むレコードの小さな部分を選択します。

カーソルを下の高解像度パネルに移動し、選択したトレース内で、ベースラインを表すクリーンなセグメントをハイライト表示します。カーソルを下のモデルパネルに移動し、閉じた状態を表す黒い四角を右クリックして、グラブを選択します。チャネル開口部の手順を繰り返して、開コンダクタンスを表す特性の一部を強調表示します。

モデルパネルの赤い四角形を右クリックし、[グラブ]を選択します。データ ソースの下にある [SEL] ボタンを選択して、レコードの選択した部分の理想化を実行します。次に、ポップアウトパネルのモデリングセクションの下にある理想的なタブを右クリックします。

解析に必要なパラメータが正しいことを確認し、[実行]をクリックします。理想化の結果と選択した部分の振幅ヒストグラムがデータにオーバーレイされ、理想化を視覚的に検証できます。必要に応じて、最適な結果を得るために理想化パラメータを調整し、データソースの下のファイルボタンを選択してファイル全体の理想化を実行します。

次に、理想化されたタブを右クリックして、[実行]をクリックします。ファイル全体の結果が表示されます。データを重ね合わせ、理想化されたトレースと記録されたデータとの一致を慎重に検査します。

場合によっては、理想化されたトレースから除外できるイベントが誤って識別されます。falseイベントを右クリックし、[Join IDL]を選択します。ここに示されているのは、HEK 2 93細胞内の単一のNMDA受容体を通るカルシウムイオンのみの電流です。

セルアタッチパッチクランプ技術を使用すると、データの理想化により振幅ヒストグラムが生成され、このセルの2つの異なるコンダクタンスクラスにうまく適合します。HEK2 93セルからの添付録音により、1つのMeno感度チャンネルがマイナス20ミリメートルで活性化されます。電圧の一定の印加中のパッチピペットを通る水銀圧力。

赤い点線は、電流レベルがゼロであることを示します。これらのネイティブチャネルからの記録は、ラット胚の前頭前皮質から解離し、5日間または27日間培養に維持されたニューロンの体細胞から記録された継続的なNMDA受容体活性を示しています。一度マスターすれば、録音の時間にもよりますが、この手順は30分から1時間で完了します。

この手順に続いて、速度論解析や状態モデリングなどの他の方法を実行して、チャネルのゲーティングメカニズムを決定し、反応速度を推定できます。このビデオを見た後、1つのイオンチャネルタンパク質を介して電流を記録し、分析を開始する方法についてかなりよく理解しているはずです。