Name: 一チャネルセル付パッチクランプ法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 学ぶ一チャネルセル付パッチクランプ法でイオンチャネルの電流を測定し、神経細胞の信号伝達メカニズムを解明する方法。この技術は単一チャネルの開閉挙動を可視化し、膜タンパク質の生物物理学的特性を詳細に調べることができます。

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この作品は、F31NS086765（KAC）、F31NS076235（MAP）、およびR01 NS052669（GKP）とEIA9100012によってサポートされていました。著者らは、分子生物学および組織培養に関する専門知識と支援のためのアイリーンKasperekに感謝。そしてジェイソン·マイヤーズ早期前頭前皮質ニューロンから得られたデータを共有するための。

1。細胞培養およびタンパク質発現<ol><li> HEK293細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM中で単層培養中で、ATCCにより行わ通路を含み、通路22と40との間（ATCC番号CRL-1573）、および5％CO 2で1％ペニシリン/ストレプトマイシン混合物を維持する37℃実験の間、10mlの最終体積の5〜20倍希釈でT25フラスコに継代細胞。注：これらの通路の間に細胞を使用することで、最適なシール形成及びパッチの安定性を可能にする、良好な細胞の健康を保証します。 </li><li>トランスフェクションのために、皿当たり細胞懸濁液を〜0.5〜0.6ミリリットルに相当〜10 5細胞/皿の密度で35mmディッシュにHEK293細胞をプレート18〜24時間、2ミリリットル培地中で細胞を増殖させる。 </li><li>無菌1.5ミリリットル遠心管では、（この順序で）追加することにより、4 35mmディッシュ用のトランスフェクション混合物を準備し、それぞれのcDNA（GluN1、GluN2A、およびGFP）の（1）1μgのを。 （2）315μlを蒸留水（のddH 2 O）; （3）42mMの350μlの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、沈殿物を形成するために使用されている通り2.5 M CaCl 2を降下、（4）35μLを。 </li><li> 5秒間ボルテックスチューブと4 35mm皿のそれぞれにトランスフェクション懸濁液​​175μLを加え、今50から60パーセントの集密度で細胞を含有し、2時間37℃で細胞をインキュベートした、前日に播種した。 </li><li>トランスフェクション培地を吸引除去オフは、PBSで洗浄し、NMDA受容体媒介興奮毒性9を防止するために2mMのMgCl 2を補充した増殖培地2mlと交換してください。注：細胞は電気生理学的記録の24〜48時間後、トランスフェクションのために使用することができる。 </li></ol> 2。電極の準備<ol><li>垂直プラーとホウケイ酸ガラス管を引くことによって2対称記録ピペットを生成します。その結果、チップの大きさや形状に基づいて、さらに形状ピペット研磨機を使用して。注：先端サイズを視覚的かつ電気的に評価することができる。視覚的には、外径が1.4から5.6程度の範囲でなければならない。電気的には、細胞外液で満たされた、最適なサイズのチップは、（ 図2B参照 ）12月24日MΩの範囲の抵抗を生成する必要があります。 </li><li>セル添付の実験のために、最大のチャネル活性と高い電流振幅を生成する細胞外環境を表しピペット溶液を使用してください。注：（NMDA受容体の場合、これは、アゴニスト（グルタミン酸およびグリシン）の飽和濃度を含有する溶液に対応する二価の陽イオン性阻害剤および遮断剤をキレート1mMのEDTA、及び唯一つの透過イオンとしてナトリウム（150ミリモル）の生理的濃度を有するmM単位：1グルタミン酸、0.1グリシン、1N NaOHでpHを8.0に緩衝さ150のNaCl、2.5 KClを、1 EDTA、および10 HEPBS、）。 </li></ol> 3。セルに接続されたパッチクランプ法<ol><li>オープンQUBデータ取得ソフト制（www.qub.buffalo.edu）RE、および「レイアウト」の下で取得ウィンドウを選択します。 「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューの下に「新しいデータ」をクリックして新しいQUBデータファイル（QDF）を開き、次の初期パラメータに入力します。サンプリングレート、40 kHzと; A / Dスケーリング、3,000;出力チャネル、1;とA / Dデータサイズ、2は、データファイルを右クリックして[プロパティ]を選択し、「データ」タブをクリックすることで、0.1V / PAに振幅スケーリングを調整します。注意：これらのパラメータは、セルに接続されたモードでモデル細胞を用いて、各セットアップのために改良することができる。 QUBソフトウェアとQDF特性を備えたデータ収集に関する追加指示がwww.qub.buffalo.eduでオンラインになっている。 </li><li>細胞を発現するイオンチャネルを含有する35mmディッシュを選択して、カルシウム及びマグネシウムを含有する2mlのPBSに成長培地を交換し;顕微鏡のステージ上に料理をマウントして、細胞が健康で、よくお皿に付着していることを評価するために、位相差顕微鏡を使用してセルラーフィールドに焦点を当てる単層のファッション（ 図1A）であった。トランスフェクションは（ 図1B）成功したことを確認するために蛍光検出に切り替えます。注：蛍光強度の範囲は、タンパク質発現の粗尺度として用いることができる。 </li><li>単一チャネルの記録のために、×10、アンプ出力ゲイン= 1βに対するパッチ構成、10 kHzのアナログフィルタ、クランプを電圧モードに設定し、100 mVの電圧を適用した。電圧がOFFの位置にコマンドを保持して、「シールテスト」ボタンを選択します。 </li><li>蛍光と細胞の健康に基づいて、パッチを適用するセルを選択します。細胞がウェルディッシュに接続されていることを位相コントラスト下で確認し、パッチ適用のために露出細胞表面の大部分を有し、他の点では健康に見える。注意：アプローチとパッチクランプの間に細胞を漂白避けるために、位相差照明を維持します。 </li><li>それはelectrodに接触するようにちょうど足りるだけの水でたての研磨ピペットを埋めるE、ゆっくり振る先端に捕捉された気泡を取り除くために。ピペットホルダーのシールねじを締めると銀線をピペット溶液に浸漬されることを確認することで、アンプのヘッドステージ上に記録ピペットを固定します。 </li><li>チュービングによりピペットホルダに接続されている小（5ccの）プラスチックシリンジを用いて、穏やかなアプローチ（ 図2A）の間にチップを入力し、目詰まりを防止するために、不純物の正の圧力を加える。 </li><li>マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを指示し、電気回路を開閉する ​​（ 図1C）をパッチするために選択したセルの上に直接配置します。アンプのシールテスト信号（ 図2B）に対応した矩形波を示す必要があり、これをオシロスコープに注意してください。注意：お風呂に入ると、最適な範囲内でピペット抵抗は、12月24日MΩです。 5 mVの試験信号は、測定された電流rをANGEは、〜20〜40 PAに対応している。 </li><li>オシロスコープで電気顕微鏡ピペット抵抗を介して視覚的にピペットの位置を監視しながら、ピペットは、細胞を軽く当たるまで、少しずつアプローチを続け、テスト信号が増加した抵抗（ 図2B）を示すために、わずかに減少します。 </li><li> 、シールを形成する注射器を手に取り、記録ピペットの先端に細胞膜を引っ張り、GΩ抵抗シール10の形成を開始シリンジプランジャを引いて、横方向のチューブを通して若干の負圧を適用する。シール形成が見えるだけの容量トランジェント（ 図2B）で、その完全な平坦で示されているオシロスコープでテスト信号波形に注意してください。注：信号が完全にフラット化しない場合、またはベースラインにノイズになると、これはシールの周りにかなりの電流リークと弱シールを示している。これはRを防ぐことができます1チャネル電流をesolving。この場合は、セルからピペットを撤回し、離れてお風呂から、ヘッドステージから削除し、それを廃棄します。適正な範囲（≥1GΩ）にシールを得るまでたて研磨ピペットを用いて処理を繰り返します。 </li><li>アンプに、「オフ」に「シール·テスト」から外部コマンドトグルを切り替える。 （「オフ」にあらかじめ設定された）正にコマンドを保持して電圧を切り替える。およびX100にゲインを上げる。存在する場合、以前にフラットベースライン（ 図2C）からの方形上向き振れとして表示されますが、チャネル活性のためのオシロスコープを、観察します。 </li><li>チャネル活性をオシロスコープに表示されている場合は、「録画」ボタンが続く「プレイ」ボタンを押すことで、QUBで以前に開かれたデジタルファイルにデータを取得する。 、データの取得を停止QUBに停止ボタンを押して簡単にretrievにQDFファイルを保存するには「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューで[名前を付けて保存データを保存...」を選択することにより、コンピュータのハードドライブ上のことができる場所。 </li></ol> 4。データの前処理や理想化注：重要情報（最も簡単な場合には、閉じているか開いて）適切な伝導度クラスに、各データ点を割り当てる統計分析により、単一チャネル記録から抽出することができる。このプロセスは、データの理想化と分節K手段（SKM）QUBのメソッド11を以下に説明されているとのデータ理想の簡単な説明と呼ばれている。 <ol><li> QUB内のデータファイルを開き、「レイアウト」の下の「前」のインターフェイスの現在のトレースを表示。というボックスオフにして（デジタルフィルタを削除します）フィルタリングされていない記録されたファイルを表示する」のFcを。 &#39; </li><li>視覚的に凹凸や成果物（ 図4A）を発見するレコードをスキャンしてください。そのoccu正しい短時間の電流スパイクRトレース内で、同じコンダクタンスクラスの隣接するクリーンな領域を選択する、この領域をハイライトして右クリックして選択することで（ 図4A） &#39;を設定、消去バッファを。&#39;個々のサンプル·ポイントが表示されるまでのスパイクにズームイン、交換する地域を選択して、この領域のみとし、右クリックして「消去」を強調することで消去する。 </li><li>ベースラインが安定しているレコードの初期の部分を選択することで、レコード全体のためにゼロ電流のベースラインを定義して、ハイライトして右クリックし、「設定のベースライン]を選択します。正確に表示されるガイドラインは、（ 図4Bの紫）ベースラインレベルを表していることを確認します。 </li><li>生データのベースラインが設定されたベースラインから目に見えて外れたレコード内のポイントを特定します。逸脱した領域内のベースラインの小さなセクションを選択することにより、これを修正し、右クリックして「ベースライン·ノードを追加」コマンドを選択します。 </li><li> Tの領域を識別彼は簡単に（ 図4C）を補正することができない過剰ノイズやアーチファクトを含む記録。破棄されるべき領域をハイライト表示し、右クリックして選択し「削除してください。 &#39;注：この場合、運動の情報が失われます。処理されたレコードが短くなり、接続点の後に発生するポイントは、事前にノイズ領域に連続して表示されます。 </li><li> SKMアルゴリズム11を使用してレコードを理想化するには、オープンとクローズの両方のイベントを含むトレースの一部を強調表示し、下の「モッズ」インターフェースに入力&#39;レイアウト。&#39; 「モデル」パネルで、黒四角（閉じた状態）を右クリックして、「グラブ」を選択し、ファイル全体のベースラインを表している微量のきれいな部分を強調表示します。オープンコンダクタンスを強調することによってチャネル開口部のために同じことをする、右「モデル」パネルで、赤い四角をクリックして、「グラブ」を選択します。 </li><li> idealizaを実行下の「ファイル」ボタンを選択して、レコード全体のためのTiON「データソース」。分析用に必要なパラメータが正しいことを確認し、[]をクリックする「モデル」セクションの下に「理想化」タブを右クリックして「ファイル名を指定して実行。 &#39;理想化の結果は、ファイル全体に対する振幅ヒストグラムと一緒に、理想の目視検査（ 図5）を可能にするデータと重ねられる。注意：不適切な理想化はQUBが実際に発生していないチャネル開口部とクロージャを検出する「偽のイベント、 &#39;の発生につながる可能性があります。アンプのアナログフィルタとサンプリングレートによって設定された記録解像度内では、SKMの開閉イベントを検出すると解像度が分析のためデッドタイムを設定することによって制御することができる。最適なデッドタイムは、試行錯誤によって選択する必要があり、サンプリング·レートに依存しますが、経験則である2〜3のサンプル12でデッドタイムを選択します。 </li><li>理想化が正確に生データを表していることを確認するには、手動で理​​想化トレースをスキャンします。理想の誤差の同定に、偽のイベントの上にトレースをハイライト、右クリックし、「IDLに参加してください。 &#39;注意：追加のオプションやQUBにおける様々なコマンドおよび機能の詳細な説明については、QUBマニュアルオンライン（www.qub.buffalo.edu）を参照してください。 </li></ol>

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</ol>

この原稿の著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

イオンチャネルフィールドで、研究の重要な領域は、開口部またはチャネルのゲート機構をチャネルにつながるイベントのシーケンスを理解するに捧げられています。ほとんどのチャネルの場合、このプロセスは複雑であり、巨視的なマルチチャネル信号から推定することができないいくつかの動力学的工程を含む。対照的に、実験は、単一チャネル記録内のオープン/クローズイベントのシーケンスを観察する機構をゲーティングに関するより詳細な情報を得ることができる場所に設計することができる。ここに記載される方法において、NMDA受容体が有する外部に配置リガンド結合ドメインは、一定の条件下で実施される最小侵襲性パッチクランプ記録を可能にする。このプロトコルは、リガンドと受容特性の両方に依存する他のリガンド依存性イオンチャネルを調査するのに適しているために適合される必要があり得る。 単一チャネル活性のレコードは、貴重な情報の2種類を提供する。まず、単一の電流振幅を直接測定することができるので、実験は、そのようなチャネルコンダクタンス、透過性及び選択性のような細孔特性についての情報を得るように設計することができる。第二に、開閉...

生体膜を横切る高速通信は、一般にチャネルと呼ば膜タンパク質を形成するオリゴマーの細孔にほぼ排他的に依存している。これらのタンパク質は、活性化信号、ゲーティングメカニズム、コンダクタンス特性において大きく異なっている。細孔がイオンに対して選択的であるチャネルタンパク質をイオンチャネルとして分類される;それらの活性化は、膜を横切るイオン電流を生成し、その応答は、電気生理学的技術を使用して、即座に高解像度で記録することができる。活性化信号は、濃度勾配、機械的および電気的な力、および温度などの化学的および物理的入力の幅広いまたがる。従って、さらなるゲートさリガンドへのイオンチャネルを分類する機械受容電圧は、ゲート、または敏感型を加熱する。この記事では、プロトコルは、パッチクランプ技術を用いて、リガンド依存性チャネル、NMDA受容体、および機械受容チャネル​​、PIEZO1から1チャンネル活性を記録するために記載されている。0; パッチクランプ電気生理学は、単一分子1,2の観察を可能にするのに十分な感度最初の最も広く使用された実験方法である。この優れた感度に加えて、それは非常に電気生理学的記録に従う生物学的製剤を拡大しており、また、無傷の膜におけるイオンチャネルの観察を可能にした。電圧クランプと電流の記録の両方が同じ電極を用いて達成されているので、まず、小さな細胞または膜パッチを横切って信号を記録するために使用することができる。技術は、イオンチャンネルがカエルの筋肉、ウナギelectroplaques、またはイカ巨大軸索3,4の興奮性膜に限定されないことが明らかになったのではなく、それらは、膜貫通シグナル伝達機構のユビキタス器具を表し、単方向または全ての細胞膜の種類に固有であること多細胞生物、また細胞内膜へ。インポートantly、単に無傷の細胞にガラスピペットを取り付けることにより、貫通電流を記録する機能は、ネイティブ破壊されていない膜内のイオンチャネルからの活動を記録するために前例のない機会を提供した。したがって、このプロトコルに記載されているセル取り付けパッチクランプ技術は、数十分又はそれらの天然の環境においてより長い連続イオンチャネルの活性をモニター可能にする。 通常の熱揺らぎの下では、イオンチャネルタンパク質を含む全てのタンパク質は、側鎖の動きと全体の再配置によって表される非常に遅く、あまり頻繁に変更することによって最も可能性の高い表現最速かつ最も頻繁に再編成に、幅広い時間スケールにわたる構造的な変化を受けるドメインまたはサブユニット、または翻訳後修飾またはタンパク質-タンパク質相互作用5,6によっていくつかの場合において。 1分子によって生成された活動の長い期間を観察すると、機能を理解するのに役立ちます完全な生理的膜におけるイオンチャネルのtionalダイナミクスと観測され、分子の動作メカニズムについての貴重な情報を提供します。 細胞型および発生段階を横切るイオンチャネルの多様性の増加理解とは対照的に、天然の膜におけるイオンチャネルの分子組成についての知識は、依然として限られている。すべてのイオンチャネルは、多量体タンパク質であり、天然イオンチャネルの大部分は、多くの場合、多様なコンダクタンスとゲーティング特性を伴う広い分子多様性のタンパク質を産生するサブユニットのいくつかのタイプから組み立てる。このため、規定された分子組成物のイオンチャネルは、異種系での発現の際に検討されている。具体的には、不死化したヒト胚性腎細胞のクローンライン7であるHEK293細胞は、組換え型イオンチャネルの異種発現のための好適なシステムとして広く受け入れを得た。男の中イオンチャネルの電気生理学のための選択シス​​テムは、培養の容易さと低価格であり、長寿命、安定した培養物を維持するように、哺乳動物タンパク質の翻訳後フォールディング、プロセシングおよび輸送を行う能力をHEK293細胞を上昇yの利点は、多くの場合、その低レベルまたは対象7、8のチャネルのための内因性発現のさえない状態。組換えイオンチャネルを発現し、HEK293細胞におけるそれらの機能的特性を研究することは構造 - 機能イオンチャネルの特性ならびにイオンチャネルアイソフォームおよび天然組織におけるそれらの役割の特定のプロパティに関する情報を取得する価値のあるアプローチであり続けている。この資料に記載されているプロトコルは、HEK293細胞において発現された組換えイオンチャネルおよび天然イオンチャネルにも同様に適用することができる。 要約すると、その前例のない能力を介してパッチクランプ技術は、信号を解決するために一つの分子からのsは、今日まで、単一分子の挙動を観察するための最も直接的な方法のままである。その細胞結合型モードでは、パッチクランプ記録は、一分子のために行わ、長い観察期間を可能にするイオンチャネルの動作中に例外的な洞察を提供することができる。以下に一つのイオンチャネルタンパク質を含む細胞取り付けパッチから高分解能電流記録を取得するためのプロトコルが提供される。

<table><tbody><tr><td>化学薬品</td><td>シグマ</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>ホウ珪酸ガラス</td><td>サッター</td><td>BF-150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>明視野倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>1x51</td><td>ニコンも同様の顕微鏡を持っています</td></tr><tr><td>蛍光ボックス</td><td>X-cite</td><td>シリーズ120</td><td></td></tr><tr><td>液体ライトガイド</td><td>X-cite</td><td>OEX-LG15</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>Tektronix</td><td>TDS1001</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Table</td><td>TMC</td><td>63561</td><td></td></tr><tr><td>NIDAQカード</td><td>National Instruments</td><td>776844-01</td><td></td></tr><tr><td>プーラー</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>ポリッシャー</td><td>成重</td><td>マイクロフォージ MF-830</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>TMC</td><td>8133306</td><td></td></tr><tr><td>高速圧力クランプ</td><td>ALA サイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>ALA HSPC</td><td></td></tr><tr><td>プレス/バキュームポンプ</td><td>ALA サイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>ALA PV-PUMP</td><td>HSPC-1用</td></tr></tbody></table>

一チャネルセル付パッチクランプ法

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

イオンチャネルタンパク質は、生体膜を通過高速通信用の汎用デバイスである。それらが生成するイオン流束の時間的なシグネチャは、各チャネルタンパク質ならびにその生成および制御される機構の固有の性質に依存しており、現在の研究の重要な領域を表す。イオンチャネルタンパク質の操作動力学に関する情報は、単一の分子によって生成される電流の長いストレッチを観察することによって得ることができる。リガンド依存性イオンチャネル、NMDA受容体に対する1チャネルセル付きパッチクランプ電流記録を取得するためのプロトコルがここに記載され、皮質ニューロンでHEK293細胞においてネイティブまたは異種発現。また、機械刺激感受性チャネルPIEZO1の例を提示することによって、関心のある他のイオンチャネルにメソッドを適応させる方法についても提供される。この方法は、チャネルのコンダクタンス特性とOPEの時系列に関するデータを提供することができますこのように健康と病気にそれらの機能を理解するために貢献し、チャネルの活性化機構を構成しているN-クローズコンフォメーション。

組換えNMDA受容体 NMDA受容体は、結合して、2コアゴニストの同時動作に対応：グルタミン酸およびグリシン。彼らはGluN1サブユニットとGluN2サブユニットを結合2グルタミン酸結合2グリシンのヘテロ四として組み立てる。 GluN2サブユニットは、4つの遺伝子（A〜D）でエンコードされており、これらの脳の中で最も広く、転写形式はGluN2A少年動物で大人とGluN2Bである。なぜなら（ 図1A）サブユニット組成の制御、並びに微細研磨したガラスピペット（ 図1C）を用いてチャネルからの電流を記録する機能を可能にするHEK293細胞において受容体を発現する天然の調製物中のNMDA受容体サブタイプの多様性。 ピペットが細胞に接触した後、試験パルス波形の振幅の明らかな減少が、シールを形成する能力を示す（ 図2B）が発生する。一つを含む十分なシールチャネルは、正の電圧（ 図2C）...

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

この手順の全体的な目的は、単一イオンチャネルを流れる電流を測定することです。これは、まず、取り扱いやすく実験目的に適した細胞に、目的のイオンチャネルを異種発現させることで達成されます。次のステップでは、火・研磨したピペットを用いて、細胞膜上に安定したシールを形成させます。次に、パッチ内に存在するチャネル数を決定し、単一チャネルの電流記録である場合は、最終ステップとしてデータの処理と解析を行います。最終的に、単一イオンチャネルからの電流記録は、これらの膜タンパク質が機能する生物物理学的特性を調査するために用いられ、これはニューロンやその他の興奮性細胞がどのように通信するかという基礎となります。複数の活性イオンチャネルを介した電流を測定する方法とは対照的に、このアプローチの利点は、個々のイオンチャネルを介した電流を測定することで、特定のチャネルに固有の幅広い応答パターンを可視化し、分離できることです。この手法は、生理学的および治療的なモジュレーターがニューロン間の通信にどのように影響するかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するために利用できます。一般的に、この技術に不慣れな人は、単一のイオンチャネルのみを含む低ノイズの記録を得ることが困難であるため、習得に苦労します。この手法を初めて試みる際は、実際に誰かが行う様子を見るのが非常に有益です。なぜなら、この手法において最も重要な「極めて安定したシール」を得るには、特定の角度から慎重に細胞にアプローチする必要があり、そして何よりも根気強く取り組まなければならないからです。次に、トランスフェクションの準備を行います。HEK 293細胞を、前日に35 mmディッシュに播種し、滅菌チューブ内でコンフルエンシーが50〜60%になるように調整します。トランスフェクション混合液を調製します。目的の各cDNA 1 µg、2回蒸留水 315 µL、および42 mM HEPES 350 µLを添加します。最後に、塩化カルシウムを35 µL滴下して沈殿を形成させます。チューブを5秒間ボルテックスし、前日に播種した4枚のディッシュそれぞれに、トランスフェクション懸濁液を175 µLずつ加えます。細胞を37°Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を除去し、PBSで洗浄します。次に、MDA受容体介在性の興奮性毒性を防ぐため、2mMの塩化マグネシウムを添加した増殖培地を2mL加えます。まず、垂直型プラーを用いてホウケイ酸ガラスから2本の対称的な記録用ピペットを製作します。次に、適切な直径と抵抗を得るために火炎研磨を行います。その後、QUBデータ収集ソフトウェアを起動し、収集ウィンドウを選択して記録の準備を整えます。「layout」メニューを選択します。「new data」をクリックして新しいQUBデータファイルを開き、使用する実験パラメータを入力します。データファイルを右クリックして「properties」を選択し、「data」タブをクリックして、振幅スケーリングを0.1 volts per pico ampに調整します。培地をカルシウムおよびマグネシウム含有PBS 2 mLに交換した後、細胞が入ったディッシュを顕微鏡ステージに設置します。位相差顕微鏡を用いて細胞視野にピントを合わせ、細胞が健康的であり、ディッシュに単層状に良好に接着していることを確認します。続いて蛍光検出に切り替え、トランスフェクションが成功したことを検証します。次に、シングルチャンネル記録のパラメータを設定します。モードをボルテージクランプに設定し、電圧保持コマンドを用いて印加電圧を+100 millivoltsに設定します。オフの状態のまま、蛍光および全体的な外観に基づいてシールテストボタンを選択します。パッチクランプを行う細胞を選択します。位相差顕微鏡下で、細胞がディッシュにしっかりと接着しており、パッチ形成に十分な細胞表面が露出していること、および細胞が健全な状態であることを確認してください。新しく研磨したピペットに、NMDA受容体およびセルアタッチ法実験に適した溶液を満たし、軽く弾いて気泡を除去します。記録用ピペットをアンプのヘッドステージに固定し、浴液がピペット内に浸入するのを防ぐため、銀線がピペット溶液に浸かっていることを確認してください。アプローチの際、ピペットホルダーに接続した小型プラスチックシリンジを用いて、緩やかに正圧をかけます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをバス内へ誘導します。電気回路を閉じた状態で、パッチ適用に選択した細胞の直上に配置します。バスに進入する際は、オシロスコープを確認してください。顕微鏡でピペットの位置を視覚的に、そしてオシロスコープで電気的抵抗をモニタリングしながら、ピペット抵抗が最適範囲内にあることを確認します。ピペットが細胞に軽く接触するまで、少しずつ接近させてください。抵抗の増加を示すため、テスト信号はわずかに減少します。シールを形成するには、シリンジを持ち、側面のチューブを通して緩やかに軽い陰圧をかけます。シリンジのプランジャーを引いた際、オシロスコープ上のテスト信号の波形が完全に平坦になれば、シールが形成されたことを示します。アンプの操作について。外部コマンドのトグルスイッチをseal testからoffに切り替えます。電圧保持コマンドをoffからpositiveに切り替え、ゲインを10 xから100 xに上げます。オシロスコープでチャネル活性を確認します。活性がある場合は、それまで平坦だったベースラインから下向きの矩形波として表示されます。オシロスコープにチャネル活性が表示されたら、QUBの再生ボタンを押し、次に記録ボタンを押して、先に開いたデジタルファイルへのデータ収集を開始します。データ収集を停止するには、QUBの停止ボタンを押し、QDFファイルを保存します。信号が完全に平坦にならない場合や、ベースラインにノイズが乗り不安定な場合は、シールが不十分であることを示している可能性があります。この場合、ピペットを取り除いて廃棄し、適切なシールが得られるまで新しいピペットで以降の手順を繰り返します。データ解析プロセスを開始するには、QUBで記録されたデータファイルを開き、プリインターフェースで現在のトレースを確認します。「レイアウト」の下で確認してください。fcと表示されたボックスのチェックを外してデジタルフィルタを解除し、記録されたトレースを全帯域幅で表示します。トレースを視覚的にスキャンし、不規則な箇所やアーティファクトを確認します。電流スパイクは、同じコンダクタンスクラスの隣接するクリーンな領域をハイライトすることで補正可能です。右クリックして「erase buffer」を最初に設定し、個々のサンプルポイントが見えるまでスパイク部分を拡大します。置換する領域のみをハイライトして選択します。右クリックして「erase」を選択し、記録全体のベースラインを補正します。ベースラインが安定している記録の初期部分を選択し、ゼロ電流ベースラインを定義します。右クリックでハイライトし、「ベースラインを設定」を選択します。ベースラインが表示されたら、目視で確認し、ベースラインレベルが正確に反映されていることを確かめてください。生のデータのベースラインが、設定したベースラインから目に見えて逸脱している箇所を特定します。逸脱している領域内のベースラインの狭い範囲を選択し、右クリックして「ベースラインノードの追加（add a baseline node）」コマンドを選択することで、これを修正します。記録に、容易に修正できない過剰なノイズやアーチファクトを含む期間が散見される場合は、それらの部分を削除する必要がありますが、まず連続したセグメントに分割する必要があります。破棄する領域の直前をハイライトします。右クリックして「break segment（セグメントを分割）」を選択してください。次に、破棄するセクションをハイライトし、右クリックして「delete」を選択し、Enterキーを押してレコードを理想化します。レイアウトにあるMODインターフェースに切り替えます。データ表示パネルで、クローズドイベントとオープンイベントの両方を含むレコードの一部を選択します。下の高解像度パネルにカーソルを移動させ、選択したトレース内でベースラインを代表するクリーンなセグメントをハイライトします。次に、下のモデルパネルにカーソルを移動させ、閉状態を表す黒い正方形を右クリックして「grab」を選択します。チャネルの開口についても同様に、オープンコンダクタンスを表すトレースの一部をハイライトして、この手順を繰り返します。モデルパネル内の赤い正方形を右クリックし、[grab]を選択します。データソースにある[SEL]ボタンを選択し、レコードの選択部分に対して理想化を実行します。次に、ポップアウトパネルのモデリングセクションの下にある[idealized]タブを右クリックします。解析用の希望パラメータが正しいことを確認し、「run」をクリックします。選択した部分の理想化の結果と振幅ヒストグラムがデータに重ねて表示されるため、理想化の状態を視覚的に確認できます。必要に応じて、最良の結果を得るために理想化パラメータを調整して繰り返してください。「data source」の下にある「file」ボタンを選択することで、ファイル全体の理想化を実行できます。次に、「idealized」タブを右クリックし、「run」をクリックします。ファイル全体の結果が表示されます。データに重ね合わせて、理想的なトレースと記録されたデータの整合性を注意深く確認してください。時折、理想的なトレースから除外できる誤ったイベントが識別されることがあります。誤ったイベントを右クリックし、join IDLを選択してください。ここに示されているのは、HEK 293細胞における単一のNMDA受容体を介したカルシウムイオンのみの電流です。細胞膜付着パッチクランプ法を用いてデータを理想化すると振幅ヒストグラムが得られ、この細胞では2つの明確なコンダクタンスクラスにうまく適合します。HEK 293細胞からの付着記録において、電位を一定に印加している間にパッチピペットを通じて-20 mMの水銀圧を加えると、1つのMeno感受性チャネルが活性化されます。赤色の点線は電流ゼロのレベルを示しています。これらの天然チャネルからの記録は、ラット胚の前頭前皮質から分離し、5日間または27日間培養したニューロンの細胞体から記録された継続的なNMDA受容体活性を示しています。この手順に習熟すれば、記録時間に応じて30分から1時間で完了させることができます。この手順に続き、キネティック解析や状態モデリングなどの他の手法を行うことで、チャネルのゲーティング機構の特定や反応速度の推定が可能になります。このビデオを視聴することで、単一イオンチャネルタンパク質を流れる電流の記録方法および解析の開始方法について、十分な理解が得られるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。...

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。...

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。...

Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

この原稿は、パッチクランプ録音のための無傷の後根神経節の準備方法を説明しています。この調製物は、ニューロンおよびサテライトグリア細胞の微小環境を維持し、解離したDRGニューロンを使用して見られる表現型および機能的変化を回避します。...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

この記事では、HEK293細胞を用いた電気生理学的全細胞パッチクランプ記録により、チャネルロドプシンのイオン選択性がどのように決定されるかを説明しています。ここでは、陰イオン選択性チャネルロドプシンの塩化物選択性を調べるための実験手順を示します。しかしながら、この手順は、異なる選択性を有する他のチャネルロドプシンに移管可能である。...

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

学ぶ一チャネルセル付パッチクランプ法でイオンチャネルの電流を測定し、神経細胞の信号伝達メカニズムを解明する方法。この技術は単一チャネルの開閉挙動を可視化し、膜タンパク質の生物物理学的特性を詳細に調べることができます。

一チャネルセル付パッチクランプ法

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