の透過方法ショウジョウバエ胚

次の実験の全体的な目標は、導入された低分子薬物または毒素の生理活性をテストするために、透過性の卵殻を備えた生存可能なショウジョウバエの胚を準備することです。これは、最初に発生段階の胚を希薄な漂白剤で処理して、外側の絨毛性卵殻層を除去することによって達成されます。2番目のステップは、低分子溶質をブロックする薄いワックス状の卵殻層を枯渇させる溶媒を胚に浸透させることです。

3番目のステップは、胚を薬物または毒素と染料で処理して、卵殻の透過性を測定し、関心のある化合物を導入することです。さらなる開発後、胚を直接画像化するか、免疫組織化学のために処理することができます。最終的に、結果は、免疫試薬またはバイタルタイを使用した蛍光顕微鏡法によって決定される、組織の発達に対する薬物または毒素の活性を示すことができます。

今日は、低分子活性のアッセイのためのショウジョウバエ胚の浸透法を紹介します。この技術の主な利点は、ヘプタンからパーメへの従来の有機溶媒の使用のような既存の方法よりも優れています。卵殻は、私たちの胚透過溶媒、またはEPSが水を逃がし、比較的無毒であるということです。

これらの特性により、胚処理が容易になり、溶媒曝露をより正確に制御し、生理学的に関連性のある培地で実施することができ、どちらも胚の生存率が向上します。私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、卵の殻のワックス状の層を取り除く方法を考えたときでした。スキーヤーである私は、スキーのベースから残留ワックスを取り除くために柑橘系の溶剤が一般的に使用されていることを考えました。

これにより、このアプリケーションをハエの胚の卵殻に変換するように促され、試行錯誤の末、EPS組成物の解決につながり、所望の系統の少なくとも500匹の交配年齢のハエを含む個体群ケージを準備しました。ケージには10センチのグレープジュースが入っている必要があります。イーストペーストを軽くたたくことで通気します。

これらのプレートは1日2回交換してください。数日後、ハエは培養物に順応し、より定期的に胚を産むようになります。EPSは界面活性剤と制限溶剤溶液でできており、2か月間有効です。

室温で保存する場合は、新鮮なEPSを混ぜるときは界面活性剤を摂氏37度に温めます EPS治療の場合、胚は3センチメートルのバスケットで扱われるため、50ミリリットルのポリプロピレンチューブとナイロンメッシュが粗くなります。プラスチックのエッジは、後の開発ステップでメッシュに溶けやすくなります。胚は、50ミリリットルのチューブのキャップから作られたバスケットでも扱われます。

キャップには穴あけと切り欠きがあり、キャップとチューブの間のねじ切りでメッシュが固定されます。あるいは、局所的に機械化されたスライドチャンバーを使用し、酸素透過性で調製します。胚を収穫するために、リテーナーリングで開口部に膜を固定します。

朝、酵母ペーストを添えた新鮮なブドウのプレートを培養物にセットします。1時間後、プレートを交換し、最初に収集したプレートを廃棄します。2番目のプレートに胚を25°Cで2時間収集させます。

次に、プレートを集めて摂氏18度に移します。胚が目的の段階まで発達するのを待ちます。胚の準備ができたら、EPS治療の前に胚をデコレーションします。

プレートから水と絵筆を使用してマッシュバスケットに洗い流します。次に、穏やかな流水ですすいで、破片を取り除きます。第三に、漂白剤溶液を定期的に循環させながら、50%漂白剤に2分間浸します。

その後、すぐに流水で洗い流してください。次に、6つの60ミリメートル皿にそれぞれ10ミリリットルのPBSを入れて浴として機能し、MBIMでEPSストックを1〜40希釈してミックスを渦巻きます。白いエマルジョンは、ワイプを使用してメッシュバスケットの底から余分な水分を吸い取り、胚を一定の渦巻き運動でEPS希釈液に浸します。

EPSで胚を30秒間渦巻かせた後、胚を取り出し、余分な溶液をふるい取ります。次に、バスケットを6つのPBSバス間で移動し、穏やかに潮吹きしてすすぎ、染料と薬物治療を進めます。透過性と生存率の最適化は、このプロトコルの最も難しい部分です。

透過性は胚の発生段階に敏感です。胚が老化する温度は、ハエの個々の系統間でも大きく異なる可能性があります。EPS希釈と曝露時間の最適なパラメータは、経験的に導き出す必要があります。

まず、マイクロフィッシュチューブに1ミリリットルのMBI-M-T中のSFカルボン酸染料の50マイクロモル溶液を調製するだけで十分です。この段階で毒素または薬物を追加して、急性治療の渦を混ぜることができます。パーメ胚をバスケットからマイクロフュージチューブに絵筆で移します。

チューブにキャップをして、数回反転させます。次に、チューブをミューテーターにロードし、15分間インキュベートします。胚が落ち着いたら、ピペットで染料を取り除き、1ミリリットルのM-B-I-M-Tを再び加えて洗浄します。レザス。

胚を吊り下げ、落ち着かせてM-B-I-M-Tを交換します。次に、これを3回目と4回目行います。4回目の洗浄が完了したら、すべてのM-B-I-M-Tを取り出し、胚を発生バスケットに移して長い発生期間を過ごします。

開発バスケットの場合、最初に70%エタノールのすすぎでバスケットを準備し、次に水、ラボワイプで血液を乾かします。完了したら。次に、バスケットを60ミリメートルの皿に移し、目的の薬物または毒素を含む6ミリリットルのインキュベーション培地を入れます。

胚をペイントブラシでバスケット内のメッシュに移し、インキュベーション培地を静かに落下させ、胚を単層に分散させます。メッシュの下に気泡が挟まらないように注意してください。最初にスライドチャンバーを使用するには、チャンバーを準備し、スライドチャンバーを反転させ、開口部の端に真空グリースの薄いビーズを置きます。

次に、150マイクロリットルの所望の媒体を開口部内のdo膜の表面にロードします。次に、絵筆を使用して胚を培地に移し、メンブレン上に分散させます。25mmの円形のカバースリップを貼って仕上げ、メディウムを平らにします。

周囲に軽い圧力をかけて、シールを確保します。摂氏18度で胚を育てることは、EPSによって透過され、発生の後期に色素を取り込む能力に強力な効果があります。これは、摂氏25度で育てられたEPS処理胚にルミネBDが取り込まれないことによって示されています。ここで赤で見られるSFカルボン酸染料の取り込みは、EPS処理された胚に通常見られるさまざまなレベルの透過性を明らかにしています。

発生中の遠赤色のSF染料の動的分布と、青色の自家蛍光で見られる発達した腸内の卵黄でのその固化は、生存率を評価するために使用される基準を明らかにしています。SF染料は、ホルムアルデヒド固定および免疫染色後の以前の胚透過性も決定できます。EPS胚をSF染料とメチル水銀毒素で処理した後、運動ニューロンを標識するために緑色で見られるAntifa2で染色し、ニューロン細胞体を標識するために赤色のAntiEラボで染色します。

SF染料は青で擬似色されています。メチル水銀は、対照治療胚の矢印でマークされたコルトンニューロン細胞体のパターン形成に影響を与えます。これらのニューロンは、ここに白で示されている2つのより整然とした筋膜を持っており、矢印で示した制御処理における分節ニューロンの正常な分岐を示しています。

これに対し、メチル水銀処理は、緑色の実線の矢印で示されているように分岐パターンを変化させます。中空の緑色の矢印は、分岐が移動した場所を示しています。この技術で習得すると、胚透過治療は適切に行われれば、約30分または40分で行うことができます。

この手順に続いて、胚の固定や免疫染色などの他の方法を実行して、発生中に薬物や毒素によって標的とされる特定の組織などの追加の質問に答えることができます。この手順をご覧いただきありがとうございます、そしてこれらの方法をあなたの研究室でうまく活用できるように頑張ってください。