Name: ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶルシフェラーゼアッセイを用いた哺乳類嗅覚受容体のハイスループット活性測定法。H3A細胞への遺伝子導入と発光検出により、受容体リガンド同定を効率化し、嗅覚コードの理解を促進します。

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この作品はR01 DC013339、R03 DC011373、ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞T32 DC000014によってサポートされていました。作品の一部は、NIH-NIDCDコアグラントをP30 DC011735からの資金によって部分的にサポートされていモネル化学感覚受容体シグナルコアを用いて行った。著者は、データ収集のヘルプのために-80 Sezilleに感謝します。

1。Hana3A細胞の培養に<ol><li> 10％（V / V）FBSを最小必須培地（MEM）を補完することにより、M10のメディアを準備します。 </li><li>培養維持<ol><li> M10培地中で細胞を維持する。注：RTP1L、RTP2、REEP1、Gのための発現ベクターは、Hana3A細胞にピューロマイシン耐性を付与するαolfますが、この抗生物質で細胞を維持することは、大幅に検定結果には影響しません。 </li><li> 10cmの皿で1:8の比率を2〜3日ごとにサブカルチャー。 </li><li> 5％のCO 2、37℃でインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2。トランスフェクションのために細胞をプレーティング<ol><li> Hana3A細胞を100％コンフルエント10cmディッシュから培地を吸引。 </li><li> 、10mlのPBSを加える料理を旋回し、PBSを吸引して細胞を洗浄します。 </li><li> 0.05％トリプシン/ EDTAの3ミリリットルを加え、細胞が（約1分）解離するのを待ちます。 </li><li> 5ミリリットルM10を追加することにより、トリプシンを不活性化し、およそ10倍＆を粉砕することにより、細胞塊を壊す＃160; 10ミリリットルピペットで。ピペットを慎重にメディアに気泡を導入しないようにします。 </li><li>各96ウェルプレートについて15ミリリットルに、転写1mlの細胞を円錐管、5分間、200×gで遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。 </li><li>ステップ2.5で導入細胞の1ミリリットルあたり6ミリリットルM10に細胞を再懸濁。 </li><li>ピペット96ウェルプレートの各ウェルに50μlの細胞と、5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol>嗅覚受容体の3。トランスフェクション<ol><li>プラスミドDNAの調製<ol><li>エンドトキシンフリーのプロトコルを介してプラスミドDNAを調製。注：指定された使用のプラスミドDNA調製用キット「エンドトキシンフリー」、またはプラスミドDNA調製プロトコルにフェノール - クロロホルム抽出工程を追加します。 </li><li> TE緩衝液中100 ngの/μLの濃度にDNAを希釈します。 </li></ol></li><li>近似​​の適切な集密度を確保するために播種した細胞（ステップ2.7）を観察tely 30-50ウェルあたり％、インキュベーターに戻ります。注：このフルエンシーは、脂質トランスフェクション試薬には最適ではないですが、この段階で30から50までパーセントの集密度は、トランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の24時間を測定するために最適である。 </li><li>トランスフェクションミックスの調製<ol><li>プラスミドミックスするために、表1に詳述されたボリュームごとにMEM培地にピペットRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RLプラスミド（示さボリュームは96ウェルプレートあたりの金額です。） <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> プラスミドミックス </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> ウェルあたり </td><td> 96ウェルプレート当たり </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500μL </td></tr><tr高さ= &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ngの</td><td> 240 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">のpCRE-LUC </td><td> 10 NG </td><td> 960 NG </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;">たpSV40-RL </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr></tbody></table> 表1。プラスミドミックス成 ​​分。ウェルあたりとRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RL、およびMEMの96ウェルプレートボリュームあたり。 </li><li>各96ウェルプレートについては、450μlのMEM培地中の18μlの脂質トランスフェクション試薬を希釈する。 </li><li>ピペットプラスミドミックス（ステップ3.3.1から）、PCIプラスミド（ロー-OR-PCI）におけるロドプシンタグ付き嗅覚受容体、および中複雑、詳細にする（ステップ3.3.2から）脂質トランスフェクションミックス<strong&gt;表2砕により溶液を混合し、15分間室温でインキュベートする。 表2によるM10を添加して反応を停止します。注：この反応は、時間と小文字が区別され、30分以上継続させてはいけません。ウェル+ 10％の計算は、後の工程のために十分な容積を確保することが重要である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> 複雑な </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> ウェルあたり </td><td> ウェルあたり+10％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">プラスミドミックス</td><td> 4.2μL </td><td> 4.58μL </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ρ-OR-PCI </td><td> 0.05 NG </td><td> 0.06 NG </td></tr><tr高さ= &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;">脂質トランスフェクションミックス</td><td> 4.2μL </td><td> 4.58μL </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7μL </td><td> 45.83μL </td></tr></tbody></table> 表2。複合成分。ウェル当たり、プラスミド混合物（ 表1）のウェル+ 10％の量、嗅覚受容体プラスミド（Rho-イソたpCI-OR）、および脂質トランスフェクション混合物あたり。 M10を室温で15分間のインキュベーション後、反応をクエンチするために添加される。 </li></ol></li></ol><ol start="4"><li>細胞プレート上のメディアをタップします。 </li><li>ピペット50を各ウェルに複合μlの5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 4。臭気刺激<ol><li>ウェルあたり50〜80パーセントの適切​​な集密度を確保するために、トランスフェクションされた細胞を観察し、インキュベーターに戻す。注：細胞は、50未満である場合％コンフルエント、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ読み取りは、受容体活性化の測定のためには低すぎるであってもよい。プレートを捨てることを検討してください。 </li><li> DMSO中の各臭気の1Mのストック溶液を準備します。 </li><li> CD293培地中の匂い刺激溶液を準備します。 <ol><li>スクリーニング実験のために、100μMまで匂いの原液を希釈。また、（のみCD293）またはバックグラウンド活性化のために制御するために、無臭気制御を準備します。注：実験をスクリーニングするために、各OR /臭気ペアは一度だけ、実験ごとにテストされています。井戸間でいくつかの臭気の拡散が可能なので、各プレートについて1着臭剤で刺激することをお勧めします。 </li><li>用量反応実験のために、各受容体のために1 mMのから始まる三重で臭気原液の7の10倍連続希釈液を調製する。また、臭気の背景活性化のために制御するために、空のベクターをトランスフェクトした細胞のための三重に同じ匂い希釈液を調製する。 NOTE：用量応答実験のために、それぞれODOR濃度処理が3回実施されるべきである。 </li></ol></li><li>細胞プレート上のメディアをタップします。 </li><li>ピペット各ウェルに匂い刺激溶液25μlと4時間インキュベートすること。 </li></ol>ルシフェラーゼアッセイを経由して5。測定又は活動<ol><li> -80℃で、製造元の指示や店舗ごとに再懸濁し、ホタルルシフェラーゼ基質</li><li> 96ウェルプレート当たりホタルルシフェラーゼ基質1mlの解凍する。 </li><li>クエンチャー新鮮ホタルルシフェラーゼ反応を準備し、 ウミシイタケルシフェラーゼ基質試薬（緩衝液1mlあたり5μlのルシフェラーゼはクエンチャー/ シイタケルシフェラーゼ基質）。注：約1ミリリットルの試薬を96ウェルプレート当たりに必要とされる。 </li><li>発光マイクロプレートリーダーを準備します。マイクロプレートリーダーソフトウェアを開きます。システムアイコンの中： <ol><li> 「予熱」タブで、「ON」のチェックボックスをオンにし、25℃に、機械の温度を設定; C. </li><li> 「ディスペンサー」タブの下で、70％エタノール1,000μLとプライム各ディスペンサーは、蒸留水1,000μLが続く。注：各ディスペンサー用アルコールと水の別々のアリコートを使用してください。エタノールはディスペンサーを消毒するために使用され、水が残留エタノールを除去する。 </li><li>プライム空気の1500μlの各ディスペンサー（液体からディスペンサーを削除します）。注意：AIRでのプライミングは、ルシフェラーゼ基質が残留水で希釈されていないことを保証します。 </li><li> （ステップ5.2から）ホタルルシフェラーゼ基質1,080μLと首相ディスペンサー1。 （ステップ5.3から） ウミシイタケルシフェラーゼ基質と首相ディスペンサー2。注：未クロス汚染ルシフェラーゼ基質に注意してください。ルシフェラーゼの基質とプライミング試薬ディスペンサー内のデッドスペースを埋める。 </li></ol></li><li>両方のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発光を読むために以下のプロトコルを設定します。マイクロプレートリーダー、国連と関連するソフトウェア内「ファイル」メニューをデア、「新しいタスク」をクリックしてください。 「プロトコル」を強調表示し、「新規作成」をクリックしてください。次のウィンドウで、次の「標準プロトコル」の円を選択する必要があります。 「OK」をクリックします。画面の左側の「手順」をダブルクリックします。 <ol><li>ディスペンサー1を使用して、すべてのウェルにホタルルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。「アクション」メニューで、「スペンス」をクリックしてください。 「分注ステップ」ウィンドウで、設定：「ディスペンサー」を1に、誰にも負けない「プライミング」、10μLおよび225μL/秒の「速度」に「ボリュームを分注する」。 「OK」をクリックします。 </li><li> 30秒間、プレートを振る。 「アクション」メニューで、「シェイク」をクリックしてください。 SS： &quot;シェイクステップ」ウィンドウで、中、夜12時30分、MMを「時間」を「強」に設定してください。 「OK」をクリックします。 </li><li>ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。 「アクション」メニューで、「読む」をクリック;。 SS、「フィルタセット」を1に、「発光」：午後12時00分50秒、MMに「検出方法」エンドポイントに発光、「読む種類」、「積分時間」：SS設定ウィンドウ、「ステップをお読みください」の穴に、先頭に「光学位置」、135が「ゲイン」とは、1.00ミリメートルに &quot;高さをお読みください」。 「OK」をクリックします。 </li><li>ディスペンサー2を使用して、すべてのウェルにウミシイタケルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。2に設定を除いて、ステップ5.6.1のように「ディスペンサー」の条件を設定します。 </li><li> 30秒間、プレートを振る。ステップ5.6.2のように条件を設定します。 </li><li>ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。ステップ5.6.3のように条件を設定します。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートからふたを外し、マイクロプレートリーダーでプレートを配置します。プレート発光を読むためにステップ5.5で設定したプログラムを起動します。 </li><li>試薬分注ポンプを清掃してください。 「ディスペンサー」タブの下にあるシステムアイコンから： <ol><li> Fの千μLをパージ回収管にホタルルシフェラーゼディスペンサーからireflyルシフェラーゼ基質。 NOTE：ホタルルシフェラーゼは、-80℃で保存して再利用することができる。 </li><li>首相の70％エタノール千μLに続く蒸留水1,000μL、、最終的に空気の1,500μL（液体からディスペンサーをはずして）、各ディスペンサー。注：水が試薬ポンプ、エタノール消毒しからのルシフェラーゼの基質を除去し、空気が残留エタノールを乾燥させる。 </li></ol></li></ol> 6。データ解析<ol><li>データのエクスポート<ol><li>マイクロプレートリーダーソフトウェアでは、画面左側の「レポート/エクスポート·ビルダー」をダブルクリックします。 </li><li>ボタン「Excelへの新たな輸出」をクリックし、「OK」をクリックします。 </li><li> EXPORT1をハイライト表示し、「編集」をクリックします。 <ol><li> 「コンテンツ」の「システムの説明」を確認し、「手順」、「プレートの説明」、および「レイアウトマトリックスプレート」。 「生データ」が含まれるND「データの計算」。 </li><li> 「ワークフロー」の下で、「手続きの完了にする自動実行」を確認してください。エクスポートモードの下では、「新しいワークシートとして &quot;&quot;同じブック内のすべてのプレート &quot;をチェックして。 </li><li> 「ファイル」ファイル名の形式とファイルの場所を選択し、「OK」をクリック下に。 </li><li> 「レポート/エクスポート·ビルダー」ウィンドウを閉じます。 </li></ol></li></ol></li><li>正規化されたルシフェラーゼの値を取得するには、各ウェルのためのウミ発光読み取り（ステップ5.6.6）で各ウェルのためのホタルルシフェラーゼ発光読み取り（ステップ5.6.3）を分割します。 </li></ol>

<ol><li>Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).</li>
<li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+testicular+odorant+receptor+mediating+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis.</a> Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).</li>
<li>Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+odorant+specificity+of+two+human+olfactory+receptors+from+different+phylogenetic+classes+and+evidence+for+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism.</a> Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Matarazzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+two+human+olfactory+receptors+expressed+in+the+baculovirus+Sf9+insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system.</a> Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).</li>
<li>Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extended+receptive+ligand+repertoire+of+the+human+olfactory+receptor+OR17-40+comprising+structurally+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds.</a> Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+heat+shock+protein+enhances+the+expression+of+mammalian+olfactory+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins.</a> Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).</li>
<li>Shirokova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+ligands+for+orphan+olfactory+receptors.+G+protein-dependent+agonism+and+antagonism+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants.</a> The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).</li>
<li>Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+a+human+odorant+receptor+alters+odour+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception.</a> Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).</li>
<li>Menashe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elucidation+of+human+hyperosmia+to+isovaleric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid.</a> PLoS biology. 5 (11), (2007).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Science signaling. 2 (60), (2009).</li>
<li>Jaeger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mendelian+Trait+for+Olfactory+Sensitivity+Affects+Odor+Experience+and+Food+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection.</a> Current Biology. 23, 1-5 (2013).</li>
<li>DeMaria, S., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of smell.</a> The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nauroscience%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+olfactory+receptor+%28OR%29+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily.</a> Human Genomics. 3 (1), 87(2008).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an odorant receptor.</a> Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+a+broad+but+selective+ligand+spectrum+of+a+mouse+olfactory+receptor%3A+mapping+the+odorant-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Retention%2C+Degradation%2C+and+Aggregation+of+Olfactory+G-Protein+Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Molecular+brain+research%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+a+Mammalian+Odorant+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metric+for+odorant+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li>
<li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%3A+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances%5BTitle%5D)+AND+%22Perfumer+and+Flavorist%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb%3A+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li>
<li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+%26%2334%3Bgrassy%26%2334%3B+smelling+odor%2C+cis-3-hexen-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &#34;grassy&#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li>
<li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li>
<li>Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li>
<li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li>
<li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li>
<li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+ROC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li>
<li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Olfactory+Recept.+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li>
<li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

同一性は、付臭剤の嗅覚受容体活性化パターンによって符号化されるが、受容体は活性化され、どの程度にしているなどの受容体の活性化パターンは、ヒト嗅覚受容体1-11未満の6％のために知られている。嗅覚受容体を特徴づけるための努力は、嗅覚受容体ファミリー17,23,24,33,34のサブセットだけに彼らの労働集約的な方法や適用性によって制限されています。 Hana3A異種発現系は、試験された嗅覚受容体の大多数の強い発現を支持し、嗅覚受容体活性化19,26,27を監視するためのcAMP応答性ルシフェラーゼレポーターシステムと組み合わせて使用することができる。 96ウェルフォーマットにおけるこのアッセイの性能は、相互作用を確認するために、臭気物質/嗅覚受容体対および用量反応曲線のための有望な候補を決定し、受容体活性化レベルは、AFであるかを評価するための画面を含むハイスループット実験計画の数をサポート内および種間変動によってフェクト。画面内のより高い活性値を有する臭気物質/受容体対は、有意な用量応答を実証する可能性が高い。これらのデータは、このスクリーニング方法、それにより臭気物質リ...

哺乳類の嗅覚系は、匂い物質の何千もの検出および識別を可能にし、臭気刺激の膨大な数に応答する能力を持っています。嗅覚受容体（ORS）は、嗅上皮12内の嗅細胞によって発現される分子センサーである。哺乳類の匂い認識は匂い物質によるORの差動活性化を介して発生し、または遺伝子ファミリーは、およそ千マウスおよび400ヒト受容体12月16日に、広範囲に及ぶ。嗅覚ニューロンにおける異種細胞でのORの前の機能解析は、さまざまな匂い物質がユニークで認識されていることを示しますが、論理和10,17-20のアンサンブルを重ねてきた。論理和にリガンドを一致させることは嗅覚コードと嗅覚の生のモデルを構築するための不可欠なを理解するために重要です。により、異種システムでの論理和だけでなく、匂い物質と論理和の両方の多数を表現する難しさに、このデータは、Fからのほとんど存在しているield;確かに、人間の論理和未満の6％は、公表リガンド1月11日を持っている。このプロトコルは、付臭剤/ ORの相互作用を特徴づけるルシフェラーゼアッセイの使用が記載されている。このアッセイは、ORのハイスループット特性評価、匂い物質/ ORの相互作用を理解するだけでなく、臭い符号化のモデルを開発するために不可欠であるタスクを可能にします。 ORのハイスループット研究は、三つの主要な課題に直面している。まず、オッズ比は、ERに保持され、その後、プロテアソーム21,22で分解、アッセイ系23〜25内の臭気物質と相互作用するのORを防止し、異種細胞で発現。この問題は、論理和19,26,27の広範囲の安定な細胞表面発現を容易にするアクセサリータンパク質の発見によって対処した。受容体-トランスポータータンパク質1および2（RTP1および2）を促進OR刺激臭剤19に応答して細胞表面発現および活性化。この研究に基づいて、HEK293T細胞であった安定にHana3A細胞株19,27、その結果、長いRTP1（RTP1L）およびRTP2、受容体発現促進タンパク質1、およびGのαolfを発現するように改変された。また、タイプ3ムスカリン性アセチルコリン受容体（M3-R）は、細胞表面での論理和と相互作用し、臭気物質26に反応して活性化を増強する。堅牢でのHana3A細胞の結果にRTP1SとのORとM3-Rの同時トランスフェクション、一貫性があり、細胞表面27でのORの広い範囲の機能的発現。第二に、哺乳類又はレパートリーは非常に大きいです。ヒトでは、例えば、和レパートリーは味覚受容体のレパートリーを超える数々の桁であり、視覚的な受容体のレパートリーを超える数々の2桁。比較的簡単なプロトコルで、単一またはあるのクローンを作成するが、有意なアップフロントの努力は、包括的なライブラリを生成する必要がある。我々は幻の中で、波長は色に変換されることを知っているが、第3、第オーディション周波数がピッチに変換で、臭気の組織はあまりそれが困難な研究者が、臭気物質の代表的なサンプルから補間できるようにすること、理解されている。いくつかの進歩がこのフロント10,28について説明したが、嗅覚風景のマップが不完全なままになります。 ORの数百万の分子に対して、数千の物をスクリーニングすることは困難な作業です。このドメイン内のハイスループットスクリーニングは、慎重に定義のキャンペーンを必要とする。主要な残された課題は、物流とコストではなく、技術に固有の問題点のものです。異種スクリーニングが広く学術基によってリガンドを同定するために使用されていないが、民間企業が100ヒト論理和29に対するリガンドを同定するために同じ技術を使用した。残念ながら、これらのデータは、独自のまま。 ここで概説するハイスループットルシフェラーゼアッセイは、評価OR活性化するために使用される代替方法を超えるいくつかの利点を有する。責任もののネイティブ嗅細胞のSESは電気生理学およびカルシウムイメージングを用いて測定された、これらの技術は、困難なため、嗅覚ニューロンの応答特性の重複にニューロンの応答につながるまたは離れてからかっています。 、GFP標識受容体タイプ30,31にノック32,33嗅覚ニューロンをネズミアデノ経由で特定の受容体を提供するか、17,24,33は単一の受容体の種類に録音をリンクすることができます録音した後、RT-PCRを行うこと、これらの方法ではあるが低スループットと大規模スクリーニングには適していません。異種スクリーニングシステムは、よりスケーラブルであり、2つの主要な形態は、文献で発見されています。cAMP経路の記者やイノシトール三リン酸（IP3）経路の記者。匂い刺激すると、オッズ比は、サイクリックAMP（cAMP）の12の産生をもたらすシグナル伝達カスケードのGαolf伝達を活性化する。交流の制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を共トランスフェクトすることによりAMP応答エレメント（CRE）、ルシフェラーゼ産生の定量化は、OR活性化を可能にする、匂い応答の関数として測定することができる。または活性化はまた、Gα15/16またはGのα15-OLFキメラ24,25,34などのGタンパク質を共発現によりIP3経路にリンクすることができます。我々は3つの要因に基づいてここで紹介するアッセイを選択している：（1）Rhoのタグを付けた嗅覚受容体とRTP1の共発現は、細胞表面19,27の嗅覚受容体の発現が向上します。 （2）のcAMP応答性レポーター遺伝子の使用は、測定OR標準的なセカンドメッセンジャー経路を介した活性化を可能にする;および（3）アッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。 このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、嗅覚の分野に貴重な様々な研究にも適用可能である。まず、論理和をとり、多数の種のための受容体活性化パターンを決定するために、単一臭気物質に対してスクリーニングすることができるecific匂い物質。このタイプの研究は、またはステロイド嗅覚アンドロステ8への対応を担当するようにOR7D4を同定した。逆に、あるORは、受容体応答プロファイル10を決定するために、臭気物質のパネルに対してスクリーニングすることができる。候補嗅覚着臭剤/ OR対は、これらの画面を介して確認された場合、相互作用は、臭気物質の濃度の増加にORの応答を検査する用量反応実験を行うことによって確認することができる。用量応答曲線はまた、進化の種および因果的突然変異を横切る受容体の進化の検査を可能にする、ORの変動は、インビトロ臭剤応答8,9,11,35 に影響し、これらの研究は種間OR変動に拡張することができる方法を評価することができる遺伝36,37は 、最終的に、このアッセイは、既知の着臭剤/受容体対38,39のために拮抗OR特定の臭気物質に応答することができる匂いのアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。要約すると、これは、高スループットルシフェラーゼアッセイを特徴付ける助けるOR活性化パターン及び嗅覚系における臭気符号化のより良い理解を提供する研究の範囲に適用可能である。

<table><tbody><tr><td>Hana3A細胞</td><td>松波研究室よりご希望</td><td></td><td></td></tr>により <tr><td>RTP1S-pCI</td><td>ご要望に応じて</td><td></td><td></td>松波研究室よりご提供</tr>可能 <tr><td>M3-R-pCI</td> ご要望<td>に応じて</td><td></td><td></td>松波研究室よりご提供</tr>可能 <tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a</td></tr><tr><td>>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</A</td></tr><tr><td>>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (Ca2+ および Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">トリプシン</a</td></tr><tr><td>>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL ホワイト/クリアプレート</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td></tr><tr><td>Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">リポフェクタミン</a></td></tr><tr><td>ホタルルシフェラーゼ基質、ホタルルシフェラーゼクエンチャー/Renillaルシフェラーゼ基質:Dual-Glo</td>アッセイ<td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a</td></tr><tr><td>>マイクロプレート リーダー ソフトウェア: Gen5 データ分析ソフトウェア</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td></td><td>BIOSTACK BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>MultiFlo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956;l GripTips</td><td>インテグラ</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956;l GripTips</td><td>インテグラ</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956;l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433<</td><td>a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a</td></tr><tr><td>>12.5 &#956;l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a</td></tr><tr><td>>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>D2650-100ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a</td></tr><tr><td>>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

匂い物質は、約千マウスおよび400人の受容体ファミリーは、匂い物質の数千人を認識できるように、嗅覚受容体活性化のユニークで重複パターンを作成します。臭気物質リガンドは、ヒト受容体1から11未満の6％について公表されています。データの欠如は、機能的に異種系でこれらの受容体を発現する困難さに起因する。ここでは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、嗅覚受容体活性化のハイスループット評価に続いHana3A細胞における嗅覚受容体ファミリーの大部分を発現させる方法を記載している。このアッセイは、嗅覚受容体のパネルに対する臭気物質の（1）スクリーンパネルに使用​​することができ; （2）用量反応曲線を経由して匂い物質/受容体相互作用を確認。および（3）受容体変異体のうち、受容体活性化のレベルを比較する。サンプル·データでは、328嗅覚受容体は、臭気物質26に対してスクリーニングした。様々な応答スコアが匂い物質/受容体ペアは選択範囲だったテッドと用量反応でテスト。これらのデータは、画面が用量反応実験に合格する匂い物質/受容体ペアを濃縮するための効果的な方法、匂い物質に対する善意の応答を持っているすなわち受容体であることを示している。したがって、このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、哺乳類の嗅覚系における臭気符号化のモデルへ嗅覚受容体に必須な工程を特徴付けるための効果的な方法である。

一次スクリーニングでは、100μMの濃度で26悪臭に対して328 ORをテストしました。この臭気濃度を効果的に既知のリガンド10との論理和の大部分を活性化することが実証されている。まず、正規化されたルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ読み取りによってホタルルシフェラーゼ読み取りを割ることによって計算した。次に、ベースライン値は、各ウェル（ 図1）の正規化されたルシフェラーゼの読み取り値から無臭気制御のための正規化されたルシフェラーゼの読み取り値を差し引くことによって計算した。用量応答曲線は48臭剤に対して行わ/ OR対がランダムにベースライン値の範囲にわたって分布した、 図1の有色の棒で示すように論理和が1 mMの1nMのスパニング臭剤の7つの濃度で処理し、得られた応答は、適合させた非線形回帰を使用して、S字曲線に。それは3つの基準を満たした場合に、付臭剤/ ORは、アゴニストと考えられた。（1）標準エラーのlogEC 50未満の1対数単位であった; （2）曲線の上部および下部のパラメーターの95％...

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

次の実験の全体的な目標は、ルシフェラーゼアッセイを介して嗅覚受容体活性化のハイスループット測定を行うことです。これは、H 3 A細胞を、アクセサリータンパク質、ホタル、バニラルシフェラーゼ、および嗅覚受容体を含むベクターでトランスセクトし、異なる嗅覚受容体を発現させることによって達成されます。96ウェルプレートの各ウェルに。第2のステップとして、細胞は臭いで刺激されます。次にルシフェラーゼ基質を添加すると、ルシフェラーゼ酵素を産生した細胞が発光し、嗅覚受容体活性化のレポーターとして機能します。最終的に、結果は、プレート内の各ウェルの発光に基づいて、匂いに対する嗅覚受容体の集団の応答を示しています。この手法は、アデノウイルス、ネイティブニューロンの形質導入、カルシウムイメージングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、ハイスループットスクリーニングに対応し、ネイティブのCM媒介セカンドメッセンジャー経路を利用して嗅覚受容体の活性化を調べることができる点です。この方法は、嗅覚リガンド、つまり嗅覚受容体のマッチング、遺伝的変異が嗅覚受容体の活性化に及ぼす影響の調査など、嗅覚の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルで使用されるHanna three A細胞は、5%CO2で摂氏37度のM 10培地に維持され、10センチメートルの細胞洗浄細胞からトランスフェクション吸引培地用の細胞をプレートするためには、100%コンフルエントである必要があります。10ミリリットルのPBSを添加し、皿を渦巻き、PBSを吸引することにより、3ミリリットルの0.05%tripsin EDTAを追加し、細胞が室温で解離するまで約1分間待ちます。5ミリリットルのM 10培地を添加してトリプシンを不活性化し、10ミリリットルのピペットで約10回のトライレーティングにより細胞塊を分解します。メディアに気泡が入り込まないように慎重にピペットで撫でてください。96ウェルプレートごとに、1ミリリットルの細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。重力の200倍で5分間遠心分離し、細胞ペレットの反応を乱さずに上清を吸引します。細胞を12ミリリットルのM10ピペットに50マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートの各ウェルに懸濁し、5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベートします。この手順を開始する前に、前日に播種した細胞を観察して、ウェルあたり約30〜50%の適切な同時流暢さを確認してください。プレートをインキュベーターに戻し、続行します。トランスフェクションを調製するには、アクセサリータンパク質を発現するためのプラスミドを混合します。ホタルルシフェラーゼおよびランバニラルシフェラーゼは、それぞれTEバッファー中で100ナノグラム/マイクロリットルの濃度に希釈され、プラスミドミックスピペットがこの表に示されている容量ごとにプラスミドをmem培地にピペットします。96ウェルプレートごとに、18マイクロリットルの脂質トランスフェクション試薬を450マイクロリットルのmem培地に希釈して、脂質トランスフェクションミックスを作ります。次に、プラスミドをピペットで移します。プラスミドをオプシンタグ付き嗅覚受容体と混合し、脂質トランスフェクションミックスをきれいなMICROTITERプレートに混合します。この表に詳述されている複合体を作成するには、井戸プラス10%の計算が重要であり、後続のステップに十分な量を確保する必要があります。溶液をトライキュレーションで混合し、室温で15分間インキュベートします。表に従ってM10を追加して反応を停止します。この手順を成功させるには、細胞を2分以上培地なしで放置しないことが重要です。解決策が井戸に追加されている間。インキュベーターから細胞を取り出し、細胞プレートを反転させ、培地ピペットで各ウェルに50マイクロリットルの複合体を引き出し、嗅覚受容体のトランスフェクションの翌日に摂氏37度で5%CO2で一晩インキュベートします。トランスフェクションされた細胞を観察して、細胞をインキュベーターに戻すウェルあたり50〜80%の適切な同時流暢さを確認します。臭気は1モルのストック濃度に希釈されており、スクリーニング実験用のDMSOは、臭気の各ストック溶液を100マイクロモルに希釈します。さらに、嗅覚受容体バックグラウンド活性化を制御するためにCD2 93培地のみを含む無臭制御を調製します。インキュベーターから細胞を取り出し、細胞プレートから培地を取り出します。25マイクロリットルの臭気刺激溶液を各ウェルにピペットで注入し、摂氏37度で5%CO2と4時間インキュベートします。この手順を開始します。96個あたり1ミリリットルのホタルルシフェラーゼ基質を解凍します。ウェルプレートは、新鮮なホタルルシフェラーゼ反応クエンチャーとランバニラルシフェラーゼ基質試薬を準備します。96ウェルドプレートあたり約1ミリリットルの試薬が必要です。次に、予熱タブの下のシステムアイコン内に発光マイクロプレートリーダーを準備します。オンのチェックボックスをオンにして、ディスペンサータブでマシンの温度を摂氏25度に設定します。各ディスペンサーに1000マイクロリットルの70%エタノールをプライミングし、続いて1000マイクロリットルの蒸留水でプライミングします。ディスペンサーごとにアルコールと水の別々のアリコートを使用してください。各ディスペンサーを1, 500マイクロリットルのエアプライムディスペンサーでプライミングします。1080マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質プライムディスペンサーを備えたもの。ラニルルシフェラーゼ基質を持つ2つ。ルシフェラーゼ基質を交差汚染しないように注意してください。ソフトウェア内でホタルルシフェラーゼとバニラルシフェラーゼルミネッセンスを読み取るために、次のプロトコルを設定します。ファイルメニューの下。新しいタスクハイライトプロトコルをクリックし、新規作成をクリックします。次のウィンドウで、標準プロトコルの横の円を選択する必要があります。[OK]をクリックします。手順をダブルクリックします。画面の左側で、アクションメニューの下のディスペンサー1を使用して、10マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質をすべてのウェルに分注し、ディスペンステップウィンドウで[分注]をクリックします。ディスペンサーを1つに設定します。プライミングなし。容量を10マイクロリットルに分配し、毎秒225マイクロリットルにレートします。アクションメニューの下でプレートを30秒間振って、シェイクステップウィンドウでシェイクをクリックします。強度を中に設定し、持続時間を30クリックに設定します。大丈夫です。アクションメニューの下で、ウェルごとに0.5秒間、すべてのウェルの発光を読み取ります。読み取りステップウィンドウで読み取りをクリックし、検出方法、発光、読み取りタイプ、エンドポイントへの積分時間、50、フィルターセット、1つの発光から全体の光学系への位置、トップゲインを1、35、読み取り高さを1.00ミリメートルに設定します。[OK]をクリックします。10マイクロリットルのランルシフェラーゼ基質をディスペンサー2を使用してすべてのウェルに分注します。ディスペンサーの使用条件を図のように設定します。ディスペンサーを2つに設定する以外は1つ。プレートを30秒間振ってください。すべてのウェルの発光をウェルあたり0.5秒間読み取ります。96ウェルプレートから蓋を取り外し、プレートをマイクロプレートリーダーに置きます。読み取りが完了したら、プレート発光を読み取るように以前に設定したプログラムを起動します。ディスペンサータブの下にあるシステムアイコンから試薬ディスペンサーポンプを清掃します。ホタルルシフェラーゼディスペンサーから1000マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質を回復チューブプライムにパージします。各ディスペンサーには、1000マイクロリットルの蒸留水とそれに続く1000マイクロリットルの70%エタノールが含まれています。そして最後に、ここに示されている1, 500マイクロリットルの空気は、100マイクロモルの濃度で26の臭気に対して328の嗅覚受容体またはORをテストした一次スクリーニングの結果です。このヒストグラムは、匂い物質受容体活性化ペアがまばらであるため、画面内の各匂気物質またはペアに対して計算されたベースラインルシフェラーゼ値の頻度またはカウントを示しています。値の大部分はゼロを中心としており、大きな中央分布がこのアッセイのノイズ分布を推定します。用量反応曲線は、色付きのバーで示されているように、ベースライン値の範囲でランダムに分布した48の臭気物質またはペアで実行されました。青色のバーは全用量反応に基づいてアゴニストとして分類されたペアで、赤色のバーはアゴニストとして分類されなかったペアです。次に、真陽性率を R 統計パッケージを使用して偽陽性率に対してプロットしました。曲線下面積またはUCは0.68であり、ルシフェラーゼスクリーン値が高い匂い物質またはペアは、値が低いものよりも用量反応を通過する可能性が高いことを示しています。これらのデータは、一次スクリーニングが、全用量反応実験でアゴニストとして分類される匂い物質またはペアを濃縮するための有用な方法であることを示唆しています。一度習得すると、この技術は、適切に実行された場合のインキュベーション時間を除いて、5 96 oleプレートで約6時間で行うことができます。このビデオを見れば、トランスフェクション臭気刺激を用いた嗅覚受容体のハイスループット解析方法と、ルシフェラーゼアッセイによる活性化の測定方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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Neuroscience

神経科学

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。...

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。...

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

このビデオでは、環状アデノシン一リン酸(cAMP)バイオセンサーと発光検出を使用して、トランスフェクションされた細胞の匂い受容体活性化を測定するためのプロトコルを示しています。この方法は、嗅覚ニューロンにおける受容体-リガンド相互作用とシグナル伝達経路の研究に適用されます。...

リアルタイム環状アデノシン一リン酸アッセイを用いた匂い物質受容体活性化の測定

出典:de March, C. A. et.al., 気相中の匂気物質による匂い受容体活性化のリアルタイム In Vitro モニタリング。J. Vis. Exp.

組換え細胞における匂い物質受容体活性化のリアルタイムモニタリング

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

嗅覚ニューロンの生理学的特性の分析には、まだ技術的な限界があります。ここでは、遺伝子標的マウスの嗅上皮の無傷の準備で穴あきパッチクランプを介してそれらを記録します。この技術により、特定の嗅覚受容体を発現するニューロンの特定のリガンドに対する膜特性と応答の特性評価が可能になります。...

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

嗅覚受容体の機能を特徴づける deorphanization...

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

生理的には、嗅覚受容体は匂い分子気相に吸入によってアクティブ化されます。ただし、ほとんどの in vitro システムは、液相嗅覚刺激を利用します。嗅覚刺激による気相匂い物質受容体活性化のリアルタイムでの in vitro...

気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

学ぶルシフェラーゼアッセイを用いた哺乳類嗅覚受容体のハイスループット活性測定法。H3A細胞への遺伝子導入と発光検出により、受容体リガンド同定を効率化し、嗅覚コードの理解を促進します。

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

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