アン生体外文化システム

この手順の全体的な目標は、ex vivo培養、マウス、胚性甲状腺インプラント、またはローブを解剖して、甲状腺の発達中に発生する形態形成および分化イベントを研究できるようにすることです。これは、最初に上顎と胚の日の体の下部を取り除くことによって達成されます。E 12.5〜E 14.5マウス胚は、胚の頸部領域を単離します。

第2ステップでは、神経管、側組織、舌を切除して、気管と食道の上部を露出させます。次に、甲状腺の芽、領域、または葉から望ましくない組織をさらに洗浄します。最終ステップでは、甲状腺インプラントをコーティングされたマイクロウェルまたはフィルターに培養用に播種します。

最終的には、タイムラプスイメージング、免疫染色、または遺伝子発現分析を実行して、上皮形態形成の三次元組織と卵胞、インプラントの血管新生、または甲状腺前駆細胞の分化を研究することができます。この方法は、主要な発達と分化に答えるのに役立ちます。3Dでの甲状腺上皮細胞の組織化、内腔形成、細胞分化、分極、および成長に関する質問。

この手順を実演するのは、大学院生のフィデル・マルセルとポスドクのマイラ・ラコルテで、どちらも私の研究室の無菌状態で層流フードにいます。甲状腺組織の分離の2時間前に、滅菌された1型コラーゲンを1ミリリットルあたり50マイクログラムに希釈します。10ミリモルの塩化水素に最終濃度を入れ、コラーゲンを氷の上に置きます。

次に、プラスチック製の培養チャンバーの各ウェルを200マイクロリットルの希釈コラーゲンで覆い、室温でチャンバーをインキュベートします2時間後、コラーゲンを吸引します。ウェルをM1 99培地ですすぎ、それぞれに最低200マイクロリットルの培地を追加します。コーティングされたチャンバーをインキュベーターにしっかりと置き、甲状腺解剖を進めます。

まず、解剖した子宮をHBSSが入った10cmプレートに入れます。次に、鉗子を使用して子宮の一方の四肢を保持し、次に小さなハサミで子宮を開いて各胚を連続的に解放します。ハサミを使って胎盤から胚を分離し、次に余分な胚膜内の胚を新鮮なHBSSを含む新しい10センチメートルプレートに移します。

次に、各胚の実体顕微鏡下で解剖を続けます。まず、卵黄の袋と羊膜を取り出します。次に、タングステン針をガラスの毛細血管にナイフとフォークとして保持します。

上顎と耳を含む頭の上部を取り外します。胚を背中に抱きかかえてください。次に、神経管の余分な部分を取り出し、その後、前肢のすぐ下と心臓の上にある胚の下部を取り出します。

組織の向きを変えるには、舌とその首の領域を含む胚スライスを新鮮なHBSSを含む新しい10センチメートルプレートに移し、食道と気管の後方にある神経管と組織を切除します。次に、舌の両側に沿って組織スライスをそっと切片にします。次に、食道と気管の位置を特定し、舌を解剖し、レチノイドの腫れと組織を食道と気管の両側に残します。

舌を取り除いた後、食道を解剖し、気管腹側を上にして置きます。次に、胸腺などの望ましくない組織と、咽頭弓動脈に横方向にあるすべての組織を解剖します。次に、E 13.5またはE 14.5の胚について、気管の両側にある甲状腺葉を視覚化し、さらに気管から葉を解剖します。

E 12.5胚の場合、舌と食道を切除した後まで、示したように解剖を行うことができます。次に、咽頭弓動脈を特定した後、E 13.5〜14.5胚と同様にすべての外側組織を切除します。最後に、P 200マイクロピペットであらかじめ接液したフィルターチップを使用して、単離した組織を予温培地を含む35mmの培養プレートに移します。

E 13.5 から E 14.5 甲状腺 X をめっきする前に説明します。まず、1ミリリットルの予温培地を含む24ウェルプレートの3つのウェルに連続して移し替えて組織を洗浄し、ローブをプレコートチャンバーにプレートします。まず、培地を吸引し、先端がろ過されたマイクロピペットを使用して、各培養チャンバーに1つの甲状腺葉を慎重にプレートします。

余分な培地を取り除き、培養チャンバーを組織培養インキュベーターに入れて、外植片がマトリックスに付着できるようにします。次に、2時間後、200〜300マイクロリットルの予温培地を各ウェルに静かに加え、チャンバーをインキュベーターに戻し、E 12.5気管領域または甲状腺葉を半多孔質フィルターにプレートします。まず、24ウェルプレートのウェルに130マイクロリットルのプレウォーム培養液を入れます。

ミディアムプレイスフィルターをメディウムに貼り付けます。カルチャーフィルターの下に気泡が溜まらないように注意してください。次に、先端がろ過されたマイクロピペットを使用して、甲状腺エクスプランまたはローブを慎重に移し、各フィルターの中心に最小限の量の培地をフィルターあたり最大4 x explanに移します。

X explanをフィルターにFLするときは、媒体がフィルター壁と接触してメニスカスを作成するのを避けるために、最小限の媒体でフィルターの中心にそれらを移すことが重要です。最後に、余分な媒体を取り除き、タングステン針を使用して間隔を空けます。次に、それらを組織培養インキュベーターに最大7日間置き、隔日で培地を交換します。

フィルターで1日培養すると、laaの正中線が上部の長さに広がり、気管の両側に2つの葉を形成する細長い組織として見えます。培養により、葉は拡大し、上皮細胞の形態形成組織化を経て、巨視的に見える濾胞構造になります。これらの画像で示されているように、eコヒーレント陽性の上皮細胞の組織化と分極は、ezrin免疫標識によって視覚化できます。

時間が経つにつれて、エズリン陽性の細胞内構造は、頂端極となる細胞の極と融合しました。この過程で、内皮細胞陽性の4つのpcamが増殖し、発達中の卵胞の周りに組織化して血管濾胞単位を形成します。細胞、細胞、C細胞の分化を定量化するために、培養甲状腺葉から単離されたRNAのR-T-Q-P-C-Rによって遺伝子発現をアッセイできます。

甲状腺転写因子NK×2.1の発現は培養中に変化しませんが、thy特異的なサイログロブリンとC細胞特異的カルシトニンの発現は劇的に増加し、機能分化を示しています。このビデオを見た後、甲状腺の解剖と培養の方法を十分に理解しているはずです。野生型またはNOCO胚を使用して機能獲得および喪失実験を行う準備ができていません。