Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ
2014年6月13日
静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。
この手順の全体的な目標は、細胞接着を定量化することです。これは、まず第2ステップで96ウェルマイクロプレートを接着分子でコーティングすることによって達成されます。初代ヒトT細胞を血液から単離し、CFSEで標識します。
次に、T細胞に治療によって刺激を与え、T細胞の接着性に影響を与えます。最終ステップでは、処理した細胞をマイクロプレートに加え、接着を行います。最終的には、ウェルあたりの蛍光量を測定して、処理条件ごとの接着細胞の割合を決定できます。
この手法の主な利点は、モデルやアンテナへのT細胞の添加のような既存の方法よりも、T細胞とerl細胞の共培養が不要であることです。この方法は、特定の薬剤がリンパ球の接着にどのように影響するかなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、ラインフットの生物学に関する洞察を提供しますが、好中球などの他のマイエ細胞にも適用できます。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、ステップを習得するのが難しく、精度とスキルを必要とするため、非常に重要です 接着分子を含むマイクロプレートをコードするには、まず96ウェルプレートの24ウェルを50マイクロリットルの洗浄溶液で洗浄し、その後、コーティングされていないコントロールウェルを除く各ウェルを50マイクロリットルのコーティング溶液で摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、ピペットの先端がウェルの底に触れないように、コーティング溶液を穏やかに吸引します。次に、さらに50マイクロリットルの洗浄液でウェルを洗浄した後、マイクロプレートをウェルあたり50マイクロリットルの接着溶液でインキュベートします。
再び、摂氏37度で。1時間後、接着液を穏やかに吸引し、50マイクロリットルの洗浄液でウェルをもう一度洗浄します T細胞を分離するには、まず全血の各ミリリットルあたり50マイクロリットルのヒトT細胞濃縮カクテルを十分に混合し、次に処理した血液を室温で20分間インキュベートします。次に、処理した血液6ミリリットルと、1%Dグルコースが豊富な等量のカルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSを室温で50ミリリットルの円錐形チューブに加え、溶液を穏やかに混合します。
次に、15ミリリットルのリンパ調製物を新しい50ミリリットルの円錐管に加え、希釈した血液サンプルをリンパ球分離培地に慎重に重ねます。細胞層をGの400倍、摂氏20度で20分間分離し、ブレークオフします。次に、新しいパスターピペットを使用して上層を取り除き、リンパ球層を界面で乱さないようにします。
リンパ球層を新しいペスターピペットで新鮮な円錐管に移します。リンパ球に9ミリリットルのPBSを加え、細胞を穏やかに引き出して懸濁液全体に均一に分布させます。細胞をスピンダウンし、ペレットを培地に再懸濁します。
次に、細胞をT 75培養フラスコに分注します。適切な培養期間後に細胞を刺激するために、20ミリリットルの培養培地を注入します。まず、6つのT細胞に2.4×10の無血清培地を加え、次に37°Cのインキュベーターで細胞を飢餓状態にします。
2時間後、細胞をスピンダウンし、ペレットを再懸濁します。PBS1ミリリットルに、室温で8分間暗所で蛍光マーカーで細胞を標識し、その後、摂氏37度のPBSを10ミリリットル加えて反応を停止します。次に、細胞をスピンダウンした後、ペレットを1.2ミリリットルの予熱接着溶液に再懸濁します。
コーティングされたマイクロプレートを摂氏37度に温め、次に細胞を1.5で8つの150マイクロリットルアリコートに分割します。ミリリットルチューブは、1ミリリットルあたり10ナノグラムのPMAで1本のチューブを刺激し、ポジティブコントロールとして機能します。刺激の制御、未洗浄の負荷制御、ICAM 1コーティングの制御にサービスを提供するために、3つのチューブを未処理のままにし、抗CD3抗体の濃度が異なる4つのチューブを刺激します。
次いで、刺激された細胞混合物のウェルごとに1×10〜5番目の細胞の50マイクロリットルを直ちにマイクロプレート内の適切なウェルに分注し、プレートを摂氏37度で15分間インキュベートする。接着細胞の割合を決定するには、まず、各ウェルを150マイクロリットルの温かい接着溶液で洗浄します。プレートを数秒間静かに振った後、ピペットチップでウェルの底に触れないように、各ウェルから培地を慎重に吸引します。
洗浄を3回繰り返し、吸引ごとにピペットの角度を変えます。次に、プレートリーダーの電源を入れ、タスクメニューの下にあるプレート読み取りソフトウェアを開きます。[新規] をクリックして、新しいプロトコルを設定します。
次に、アクションメニューで読み取りオプションを選択します。「蛍光強度」をクリックし、「OK」をクリックします。励起波長を 485 として、発光波長を 528 として入力します。
次に、光学オプションメニューで下部を選択し、[OK]をクリックします。次に、アクションメニューに戻り、温度を摂氏37度に設定して、[OK]をクリックします。最後にマイクロプレートをロードし、実行をクリックします。
結果をスプレッドシートにエクスポートした後、数式を使用して、これらの画像内のアドヒアランスセルの割合を計算します。初代T細胞を用いた接着アッセイの一例を、種々の濃度の抗CD3抗体で刺激するものを示す。刺激を受けていない細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。
PMA処理された細胞は、ポジティブコントロールとして機能します 抗CD3抗体の場合、表にはCFSEの相対蛍光強度が表示されます。標識された初代T細胞を異なる用量の可溶性抗CD抗体3個で刺激し、IAM上にプレーティングし、1つのコーティングウェルをコーティングしました。すべての条件について、トリプリケートウェルの平均強度を計算し、ロードされた全細胞の相対的なパーセンテージに変換できます。
典型的な実験では、接着性PMA処理細胞の割合は40〜50%であるのに対し、非刺激細胞の割合は5〜10%であるが、刺激に使用される抗CD3抗体の濃度が増加するにつれて、付着細胞の割合が増加することに留意されたい。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行すれば3時間未満で実行できます。この手順を試行する際には、未洗浄のウェルの蛍光を測定して蛍光入力を決定することを忘れないでください。
データ分析における重要な価値。このビデオを見れば、静的な細胞接着を定量化する方法について十分に理解できるはずです。人間の血液サンプルを扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、白衣や手袋を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
静的接着アッセイは、Tリンパ球と他の細胞型との相互作用を研究するために用いられる手法です。この手法では、マイクロプレートに接着分子をコーティングし、蛍光測定を用いて接着したT細胞を定量化します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞接着
- 免疫学
- 細胞生物学
背景
- T細胞の相互作用を理解することは、免疫学研究において極めて重要です。
- 接着分子は、細胞間相互作用において重要な役割を果たします。
- 接着性を定量化することで、T細胞の挙動に関する知見を得ることができます。
- このアッセイは、さまざまな実験条件に適応させることが可能です。
研究目的
- Tリンパ球の細胞接着性を定量化すること。
- 異なる処理がT細胞の接着性に及ぼす影響を評価すること。
- T細胞間の相互作用を研究するための信頼性の高い手法を提供すること。
使用した手法
- 接着分子による96ウェルマイクロプレートのコーティング。
- 血液からのヒト初代T細胞の単離。
- 蛍光測定のためのCFSEによるT細胞のラベル化。
- T細胞の接着性を変化させるための処理による刺激。
主要な結果
- 蛍光測定により、接着細胞の割合が示されます。
- 異なる処理によって、T細胞の接着レベルに影響が出ます。
- このアッセイは、T細胞の相互作用に関する定量的なデータを提供します。
- 得られた結果は、免疫応答に関するさらなる研究に活用できます。
結論
- 静的接着アッセイは、T細胞の相互作用を研究するのに有効です。
- 接着の定量分析により、重要な生物学的知見を得ることができます。
- この手法は、さまざまな免疫学的研究の文脈で活用できます。
よくある質問
業界における実用的な意義
Tリンパ球におけるインテグリン介在性の接着を定量化することは、免疫細胞のトラフィッキングやシナプス形成に影響を与える免疫調節化合物を評価するためのメカニズム的なリードアウトを提供します。この静的接着アッセイは、細胞内シグナル伝達イベントを機能的な接着出力に結びつけることでターゲットのバリデーションを可能にし、初期探索段階における免疫調節剤候補のリスク低減を支援します。本アッセイは他のインテグリン-リガンドペア（例：VLA-4/フィブロネクチン）にも適応可能であり、炎症性疾患や自己免疫疾患の領域にわたって有用性を広げることができます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：インテグリンのアフィニティ状態を調節するインサイドアウト・シグナル伝達経路を解析し、T細胞活性化に関与する標的のメカニズム的なリスク低減を可能にする。
- 運用的価値：処理条件間での接着レベルを比較するための定量的な蛍光ベースの読み出しを提供し、免疫調節剤スクリーニングにおける仮説検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 抗CD3抗体やPMAなど、リンパ球の接着に影響を与える化合物の用量反応データを生成し、機能的な免疫調節に基づくリード化合物の同定を可能にする。
- 運用の価値： CFSE標識およびプレートリーダーへの適合性を備えた標準的な96ウェル形式を使用しており、中スループットスクリーニングにおけるアッセイの再現性と拡張性をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：インテグリン活性化の分子メカニズムを、免疫細胞の遊走および免疫シナプス形成に関連する細胞表現型に結びつけます。
- 実用的価値：初代ヒトT細胞を用いた疾患関連システムにおいて、接着調節物質の評価を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、定量的な接着測定によって、T細胞の挙動に及ぼす機能的な影響に基づいた免疫調節剤の優先順位付けに寄与します。
- 基礎生物学研究：制御された刺激条件下でインテグリン介在性接着の変化を測定することにより、インサイドアウト・シグナル伝達経路の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：標準化された定量的な蛍光出力を提供し、反復試行を通じてT細胞の接着性に及ぼす化合物の影響を比較することを可能にします。
- 解析：対照群に対する接着細胞率の算出を可能にし、構造活性相関分析のための正規化された指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：生理学的リガンド（例：ICAM-1）でコーティングされたヒト一次T細胞を使用し、ヒトの免疫応答への関連性を高めています。
- 企業の再利用：他のインテグリン-リガンドペアへの適応が可能であり、コアとなる手法を再開発することなく、複数の免疫学プロジェクトで再利用できます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：受容体刺激を機能的な接着結果に結びつけることでメカニズム的な曖昧さを排除し、免疫調節剤の作用機序における予測の信頼性を高める。
- 運用の価値：共培養システムの必要性をなくし、APCを必要とする細胞ベースの接着アッセイと比較して、ワークフローを簡素化しばらつきを低減する。
- 戦略的価値：T細胞の接着を調節できない化合物を特定することで、より早期のGo/No-Go判断を可能にし、メカニズム的に不活性な候補物質への投資を削減する。
- ポートフォリオへの影響：定量的な接着プロファイルに基づいた免疫調節剤のリスク調整済み優先順位付けをサポートし、前臨床開発における資本効率を向上させる。
実施上の検討事項
- 初代ヒトT細胞の分離および蛍光ベースのアッセイ手法に関する専門知識が必要です。
- CFSEの励起（485 nm）および蛍光（528 nm）の検出が可能な蛍光プレートリーダーへのアクセスが必要です。
- ウェル間および実験間での接着測定の再現性を確保するため、コーティング、刺激、および洗浄ステップの標準化が必要です。
- 他のインテグリン-リガンドペア（例：VLA-4/フィブロネクチン）に適用する場合は、コーティング効率およびリガンド特異性の検証が必要です。
- 制限事項として、静止条件下での測定であるため、in vivoで観察されるせん断依存的な接着を完全に再現できない可能性があります。
