海ヤツメウナギ（中肝変態期胆道変性を可視化するための新しい方法の明確化 Petromyzon·マリナス）
2014年6月6日
海のヤツメウナギは変態期胆嚢や胆管、人間の胆道閉鎖症と同様のプロセスを失う。新しい固定および清澄法（CLARITY）はレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて全体胆ツリーを視覚化するために変更されました。この方法では、胆管の変性を研究するための強力なツールが用意されています。
この手順の全体的な目標は、胆道変性の全球的、構造的、細胞的分析のために、肝臓全体と腸との接合部を明らかにすることです。変成Cヤツメウナギで。これは、最初に組織をヒドロゲルモノマー溶液に固定することによって達成されます。
次に、ヒドロゲルを固定組織と重合します。次に、固定組織の原形質膜が除去され、組織が透明になります。最後に、免疫蛍光染色が最終的にレーザー皮膚で行われ、共焦点顕微鏡法を使用して、変成作用cランプリーの胆道変性中の全体的な構造的および細胞的変化を示します。
この方法は、中枢神経系のコネクトームや、私たちの場合は血清点変態中の胆道変性など、生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、このまれな先天性乳児疾患が血清点変態中のary変性と同様の特徴を共有するため、ヒトの胆道または閉鎖症の治療または診断にまで及びます。私たちは最初にこの方法のアイデアを持っていたのは、自然界でニュース記事を見つけ、研究室の会議中にオンラインビデオを発表し、手順を示すのは、私たちの研究室の大学院生であるアン・スコットです リン酸塩緩衝液とリン酸塩緩衝液またはpbを作成した後、テキストプロトコルに従って。
ドラフトで、蒸留水、40%アクリルアミド、2%ビスアクリルアミド、10 XPBS、16%パラホルム、アルデヒド、サポニン、および硫酸アンモニウムを組み合わせて、400ミリリットルのヒドロゲルを準備します。4%SDSと0.2モルのホウ酸からなる清澄溶液1リットルを調製し、80%グリセロールを500ミリリットルにしてヒュームフード内の組織を調製します。10ミリリットルのヒドロゲルモノマー溶液を15ミリリットルの遠心分離チューブにEloquaします。
組織サンプルを解剖し、組織をヒドロゲルの各チューブに入れ、摂氏4度で2日間固定します。ヒュームフードの下でインキュベートした後、5マイクロリットルのテミドを加えて固定組織を重合します。次に、よく混合し、サンプルを室温で2〜3時間インキュベートします。
インキュベーション後、余分なゲルを徹底的に取り除き、組織サンプルを透明にします。それぞれを15ミリリットルの清澄溶液に入れ、透明になるまで摂氏50度、70RPMで数日間インキュベートします。少なくとも1日1回は清澄溶液を交換し、余分なゲルを取り除きます。
0.1モルPBの15ミリリットルで、摂氏37度、70RPMで0.1%Triton X 100でサンプルを一晩移します。新鮮なバッファーでインキュベーションをさらに2回繰り返します。組織が完全に透明になり、余分なゲルがなくなったので、サンプルを一次抗体にPB tritton X 100に浸し、インキュベーション後2日間、摂氏37度、70 RPMでインキュベートし、0.1%トリットンX 100で15ミリリットルのPBを使用して、組織サンプルを摂氏37度、70 RPMで一晩洗浄します。
最終洗浄バッファーを除去した後、洗浄を3回繰り返し、0.1%Trix 100とブロッキング血清を含むPB中の蛍光二次抗体溶液を添加し、37°C、70RPMの暗所で1日間インキュベートします。10ミリリットルのPBトリットン×100で37°C、70RPMで一晩3回試料を洗浄した後、PBSで3回一晩洗浄する。最後に、清澄化した組織をホイルで覆われた80%グリセロールで一晩インキュベートします。
共焦点顕微鏡イメージングは、暗い光または薄暗い光の中で行われますが、このビデオでは視覚化のためにライトが点灯しています。例えば、ここに示すように、胆管と胆嚢はアポトーシスを起こして変性するなど、いくつかの重要な発達イベントがHEPA胆道系で発生します。修正清澄化法を使用し、肝細胞マーカーサイトケラチン19抗抗アポトーシスマーカーで染色した後、BCL 2レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して、無傷の肝臓を光学切片化しました。
染色により、変成過程は変成段階2から4で発生することが明らかになりました。上部パネルは前端から、下部パネルは後端から来ています。ここに示されているのは胆道樹で、ここは暗い樹状突起に見えるアポトーシス細胞と、肝臓の周囲の小管および管ツールを示しています。
この図は、サイトケラチン19およびBCLに対する抗体で標識された変成段階2および3の間の3つの肝臓の共焦点Zシリーズを再構築した3次元画像を表しており、胆道樹および暗い樹状突起に見えるアポトーシス細胞および周囲の小管および管ツールは、それぞれ白と黒の矢印でマークされています。ここに示されているのは、変成期2と3の間の標本の胆管の共焦点光学切片で、内腔に胆汁滴があります。このビデオを見れば、さらなるイメージング分析のために組織全体を透明化する方法を十分に理解できるはずです。
パラフォーム、アルデヒド、ポリアクリルアミド溶液の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋の着用やヒュームフードの使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この研究は、変態中の海鰭鱈の胆嚢と胆管の喪失を、ヒトの胆道閉鎖症と並行して調査します。改良されたCLARITY法を用いて、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて胆道樹を可視化し、胆道変性に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 発生生物学
- 比較解剖学
背景
- 海鰭鱈は変態中に顕著な解剖学的変化を起こします。
- 胆嚢と胆管の喪失は、このプロセスの重要な側面です。
- この現象は、ヒトの胆道閉鎖症で観察される状態に似ています。
- これらの変化を理解することで、胆道変性に関する洞察が得られます。
研究の目的
- 海鰭鱈の肝臓と腸との接合部を明確にします。
- 胆道変性中の全体的な構造的および細胞変化を分析します。
- 全体の胆道樹を可視化する手法を開発します。
使用した方法
- ハイドロゲル単量体溶液による組織の固定。
- 固定された組織によるハイドロゲルの重合。
- 組織の透明化を達成するためのプラズマ膜の除去。
- 免疫蛍光染色に続くレーザー走査共焦点顕微鏡。
主な結果
- 改良されたCLARITY法は、胆道樹の可視化に成功しました。
- 変態中に重要な構造的および細胞変化が観察されました。
- この研究は、胆道変性を調査するための新しいツールを提供します。
- 得られた洞察は、ヒトの類似の状態の理解に影響を与える可能性があります。
結論
- この研究は、海鰭鱈の胆道変性の理解を深めます。
- 改良されたCLARITY法は、複雑な生物学的構造の可視化に効果的です。
- 結果は、ヒトの胆道閉鎖症に関するより広範な研究に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Clarifying and visualizing biliary degeneration in sea lamprey using a modified CLARITY protocol enables high-resolution, three-dimensional analysis of tissue remodeling relevant to rare human diseases such as biliary atresia. This approach supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery by providing a unique comparative model for hepatic and biliary system degeneration. The method enhances predictive confidence for translational research by enabling quantitative, reproducible imaging of complex tissue changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of biliary degeneration mechanisms in a disease-relevant comparative model.
- Supports functional target validation by visualizing cellular and structural changes during organ remodeling.
- Facilitates mechanistic de-risking for hepatic disease pathways by providing direct visualization of degeneration events.
Screening & Assay Development
- Prepares clarified, immunostained tissues suitable for quantitative imaging and downstream analysis.
- Standardizes tissue processing for reproducible, high-content confocal microscopy outputs.
- Enables scalable imaging workflows for comparative studies across developmental stages or experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling biliary atresia-like degeneration in a vertebrate organism.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker localization and quantification.
- De-risks translational hypotheses by enabling direct visualization of tissue-level outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This modified CLARITY protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven imaging of tissue degeneration, supporting both mechanistic studies and translational biomarker research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for biliary system degeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-resolution, three-dimensional readouts for statistical comparison of degeneration stages.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by modeling disease-relevant tissue changes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and clarification workflow for diverse tissue analysis needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in hepatic disease modeling.
- Operational Value: Standardizes tissue clarification and imaging for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative tissue-level data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hepatic and biliary disease targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue clarification, immunostaining, and confocal microscopy.
- Needs access to hydrogel reagents, clearing solutions, and advanced imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different tissue types or developmental stages.
- Involves safety precautions due to hazardous reagents such as paraformaldehyde and acrylamide.
