海ヤツメウナギ（中肝変態期胆道変性を可視化するための新しい方法の明確化 Petromyzon·マリナス）

本手順の目的は、変態期のウミヤツメにおける胆管変性の全般的、構造的、および細胞学的解析を行うため、肝臓全体および腸との接合部を透明化することです。これは、まず組織をハイドロゲルモノマー溶液で固定することで達成されます。

次に、固定した組織とともにハイドロゲルを重合させます。その後、固定組織の細胞膜を除去することで、組織を透明化させます。最終的に、免疫蛍光染色を行い、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、変態過程にある Lampry の胆管変性における全体的な構造的および細胞的変化を可視化します。

この手法は、中枢神経系のコネクトームや、本研究における血清点変態中の胆管変性など、生物医学分野における重要な疑問の解決に寄与します。この技術の意義は、ヒトの胆管疾患や胆道閉鎖症の治療や診断にまで及びます。なぜなら、この希少な乳幼児先天性疾患は、血清点変態中の胆管変性と同様の特徴を共有しているためです。私たちがこの手法を考案したのは、Nature誌のニュース記事を見つけ、当研究室の大学院生であるAnn Scottによる手順を実演したオンライン動画をラボミーティングで提示した時でした。まず、テキストプロトコルに従って、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびリン酸緩衝液（PB）を調製します。

ドラフトチャンバー内で、蒸留水、40% acrylamide 2% bis acrylamide 10X PBS、16% paraformaldehyde、サポニン、および過硫酸アンモニウムを混合し、400 millilitersのハイドロゲルを調製します。4% SDSと0.2 molar ホウ酸からなる透明化溶液を1 liter調製し、さらに組織調製用に80% glycerolを500 milliliters調製します。ハイドロゲルモノマー溶液10 millilitersを15 milliliter遠心チューブに分注します。

組織サンプルを解剖し、組織をハイドロゲル固定液が入った各チューブに入れ、4 °Cで2日間静置します。ドラフトチャンバー内でインキュベートした後、5 µLのTEMEDを加えて固定組織を重合させます。その後、十分に混ぜ合わせ、サンプルを室温で2〜3時間インキュベートします。

インキュベーション後、組織サンプルを透明化させるため、余分なゲルを完全に取り除きます。各サンプルを15 millilitersの透明化溶液に入れ、50 °C、70 RPMsで、透明になるまで数日間インキュベートします。透明化溶液は少なくとも1日1回交換し、余分なゲルを除去してください。

サンプルを0.1% Triton X 100を含む0.1 M PB 15 mLに移し、37 °C、70 RPMで一晩振盪させます。新鮮なバッファーを用いて、このインキュベーションをさらに2回繰り返します。組織が透明になり、過剰なゲルが除去されたら、サンプルをPB Triton X 100で希釈した一次抗体溶液に浸し、37 °C、70 RPMで2日間インキュベートします。インキュベーション後、0.1% Triton X 100を含むPB 15 mLを用いて、組織サンプルを37 °C、70 RPMで一晩洗浄します。

最後の洗浄バッファーを除去した後、洗浄を3回繰り返し、0.1% Triton X-100およびブロッキング血清を含むPBで調製した蛍光二次抗体溶液を加え、暗所で37 °C、70 RPMで1日間インキュベートします。37 °C、70 RPMで10 mLのPB Triton X-100を用いてサンプルを3回洗浄した後、PBSで3回、一晩洗浄を行います。最後に、透明化した組織をアルミホイルで覆い、80% glycerol中で一晩インキュベートします。

共焦点顕微鏡によるイメージングは通常、暗所または低照度下で行われますが、このビデオでは視認性を高めるために照明を点灯させています。ヤツメウナギの変態中、HEPA胆道系ではいくつかの重要な発生事象が起こります。例えば、ここで示されているように、胆管と胆嚢はアポトーシスを起こし、退化します。改良した透明化法を用い、肝細胞マーカーであるcytokeratin 19および抗アポトーシスマーカーであるBCL twoで染色した後、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、そのままの肝臓の光学切片を作成しました。

染色により、変性過程が変態のステージ2から4にかけて起こることが明らかになりました。上段のパネルは前端、下段のパネルは後端のものです。ここに胆管系が示されており、さらに肝臓内の暗色で樹状に見えるアポトーシス細胞と、その周囲の毛細胆管および導管構造が示されています。

この図は、変態ステージ2から3の間の肝臓3個の共焦点Zシリーズから再構成された3次元画像であり、cytokeratin 19およびBCL twoに対する抗体で標識されています。胆管系と、暗い樹状に見えるアポトーシス細胞、および周囲の毛細胆管と胆管は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。ここでは、管腔内に胆汁滴を含む、変態ステージ2から3の個体の胆管の共焦点光学切片を示しています。このビデオを視聴することで、さらなるイメージング解析に向けて組織全体を透明化する方法について十分に理解できるはずです。

パラホルムアルデヒドおよびポリアクリルアミド溶液の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、手袋の着用やドラフトチャンバーの使用などの予防措置を必ず講じてください。