Name: 浸透水透過係数（Pの測定 F）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: 学ぶ植物プロトプラストの浸透圧水透過係数（Pf）測定法。アクアポリン機能を解析し、細胞膜の水輸送機構を解明します。葉からのプロトプラスト単離と体積変化解析により、水透過性を定量的に評価できます。

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この作品は、イスラエル科学財団エルサレム（から、FCへの研究（FNRS）C科学的ベルギー国民基金、大学間アトラクション極プログラム - ベルギー科学政策と「RecherchesConcertéesデCommunautéフランセーズデベルギー·アクション」からの補助金によってサポートされていましたMM（助成番号1311から1312）にISF）、およびNM（助成番号1312から1312）へ。

溶液の調製<ol><li>準備等張（600ミリオスモル）及び低張の10mMのKCl、1mMのCaCl 2、およびを含む（500ミリオスモル）ソリューション8 M 2（N-モルホリン） -エタンスルホン酸（MES）、pHが5.7との適切な量の浸透圧を調整するD-ソルビトール：等張および低張液440 mMのための540 mMの。浸透圧計を使用して（目標値の3％以内）の溶液の浸透圧を確認してください。 </li><li>以下の酵素を含む「酵素ミックス」の乾燥原料の準備：0.55グラムセルラーゼ、0.1グラムのペクトリアーゼ、0.33グラムのポリビニルピロリドンK 30、0.33グラムのBSA（下記表1参照）、ボルテックスにより乾燥粉末を混ぜて、5.7 mgのアリコートを作成し、 -20℃で保存する。 </li></ol>シロイヌナズナ葉肉プロトプラストの単離2。 <ol><li>等張液の約6滴（約30μlの各）でペトリ皿（11センチ）を準備します。 </li><li>ピール背軸（下）シロイヌナズナの葉の表皮、C次いで溶液に触れ、下にさらさ背軸側に降下する等張液に正方形を配置し、約4×4 mm 2で正方形にむいた葉をUT。 </li><li> 、1.5ミリリットルチューブに165μlの等張液中の酵素ミックスの5.7ミリグラム（3.3％w / wで）に溶解し、溶解するまで分程度のためにピペッティングにより穏やかに混合し、同じペトリに酵素溶液を数滴を配置し、同様の一品。 </li><li>酵素溶液が下がる上に、葉片を移し、パラフィルムの1ラウンドでふたを密封皿を閉じ、20分間インキュベート、28℃に設定した水浴中で料理をフローティング。 </li><li>皿に等張液のより数滴（各酵素液滴当たり2滴）を追加します。番目のドロップ（酵素液を洗い流す）に、順次、その後、新たな等張液滴に各リーフピースを転送します。ピンセットを用いて、その縁による作品を持ち上げ、プロトプラストを解放する（ティーバッグのような）第二のドロップでそれを振る。1.5ミリリットルチューブにプロトプラスト（切り取ら100μlのピペットチップを使用して）で滴を収集します。 </li></ol> 3低張挑戦アッセイ：シロイヌナズナ葉肉細胞膨張<ol><li>低張液と等張液と別の列と1列を充填することによって灌流システム（ 図1A）を準備します。バルブを開き、すべての方法ダウンインレットマニホールド（ 図1B）にチューブを埋めるために、いくつかの溶液流（第一低張性、そして等張性）とする。トラップされた気泡が存在しないことを確認した後、バルブを閉じます。 </li><li> （; 図1Cに、チャンバの概略図を参照してください。図1B）プレキシガラススライド内チャンバのための底を作るために、シリコングリス（ 表1）を使用して、カバースリップを密封。プロトプラスト、コート用「スティッキー」（グリースリング内カバースリップの上に向けて露出面）をチャンバ底を作ってそれまたはポリ-L-リシン（水中0.1％、 表1）、正の電荷を担持する硫酸プロタミン（ 表1水中1％）を有する。ピペットチップを用いてカバースリップの上、この「糊」を広げ、1を待つ - 2分、3すすぎ - 等張液で4回、残りの溶液を離れて振る。 </li><li>等張液でチャンバーを埋める。その後、切り取らピペットチップを用いて、チャンバに溶液を含むプロトプラストのドロップを追加し、3待つ - 落ち着くまでプロトプラスト4分。 （下の気泡をトラップ避ける）ソリューション面に触れ透明カバー（ 図1D、1E）とチャンバーカバー。 </li><li> （！チューブ内の気泡に対する保護）灌流システムおよびポンプに接続し、倒立顕微鏡台に（静かに！）スライドを配置し、1ミリリットル/分（より速い速度で一定の灌流のための等張液の流れをオンにする4ml /分）まで、使用することができる。 </li><li>記録のために体積変化は、倒立顕微鏡は、20X対物レンズとし、PCコンピュータに接続されたCCDビデオカメラで使用されている。選択された不動のプロトプラストの60秒のビデオムービーを記録するためにImageJソフトウェアの「CMU 1394カメラのドライバ &#39;プラグイン（この二つのソフトウェア片のダウンロードアドレスについて特定の材料の表を参照）を使用してください（おそらく、一番下に貼り付けたもの） 1画像/秒（1Hz）での割合で。 （灌流の開始から合計60秒を完了するために）45秒低張液に切り替え、（これはベースラインを構成している）等張液の15秒洗浄で録音を開始します。 TIF形式のムービーを保存します。注：形状が球形とその最大周長（ 図2A）で十分に焦点を当てた細胞輪郭を持つ：以下の基準を満たす、できるだけ多くの細胞を用いて視野を選択してください。 </li></ol> ImageJのを用いた細胞体積変化4。分析注：分析するには腫れセルの一連の画像は、「画像エクスプローラ」と（ザビエルDrayeによって書かれた）ImageJソフトウェア14の「プロトプラストアナライザ」プラグインを使用しています。彼らの最初の時点で選択されたプロトプラストを皮切りに、「プロトプラストアナラ​​イザ」プラグインは自動的にプロトプラストのエッジ（輪郭）を検出し、実験中にその地域の時間経過を計算します（プラグインは以下のPfFit解析プログラムで使用可能です） 。 <ol><li> ImageJのを起動します。 「インポート」し、 &#39;画像エクスプローラ」：彼らが展開としてムービーを開くには、連続して、ドロップダウンメニューに、その後、ImageJのパネル上の「ファイル」をクリックします。選択したムービーを強調表示して、それを右クリックして、「プロトプラストアナラ​​イザー」を左クリックします。実験中に大部分が不動のままプロトプラストを識別するために（プロトプラスト画像下部にあるスライダを使用して）、ムービーをブラウズ - これらが分析されます。戻る最初のIMA上GEは、マウスを使用して、その後現れた「検出パラメータ」の表に「OK」をクリックして、選択したプロトプラスト（ 図2B）の周囲（ImageJの描画ツールから採取）の円を描く。 </li><li>プロトプラスト検出アルゴリズムを起動するには、ドロップダウンメニューで、その後、プロトプラスト画像トップパネルの「プロセス」「ローカル」をクリックします。ムービー全体を通して、選択したプロトプラスト（ 図2C）の周りに緑の円を調べます。 Excelファイルの「結果」を保存します。 ImageJのを終了します。注：場合は赤い点が（悪い輪郭フィット感を示すために - 通常不良による画像コントラストに）表示され、異なるパラメータで再実行してください。 </li><li>各セルに属する系統を分離するには、（ - 2つ以上のセルを同時に分析した場合には - 分析はフレーム毎に行われるため、絡み合っされます）、Excelで、セル番号欄（「オブジェクト」で保存されたデータを並べ替える）。 </li><li> DETEへP fの真の価値を得るためのピクセル対程度の変換係数をrmine、同じ20X顕微鏡対物レンズを経由してマイクロメートル定規のイメージをスナップ。定規イメージに沿って（ImageJの描画ツールから採取）のラインをドラッグして、ImageJのメインパネルの下部にある定規の長さに相当画素数をお読みください。 Excelファイル内の任意の画素領域の値は、以下2に変換します。テキストフ​​ァイル（数値のみの2列）として（セルごとに個別に）領域の時間経過を保存します。注：これは、ボリュームフィット」PfFit &#39;プログラムに入力されます。 </li></ol> 5。ImageJのとMatlabのプログラムP Fフィットを使用した実験室内での浸透圧の変化率をモデル化<ol><li>等張液（ &#39;インジケーター色素&#39;を生成するために）100mlに2mgのキシレンシアノール（ 表1、以下）を加える。 </li><li>インジケータ色素と非染めhの（3.1のように）灌流システムを準備しますypotonicソリューション。 </li><li>カバースリップ（前プロトプラストと同様に）でそれをカバーし、顕微鏡ステージ上に置き、ゆっくりインジケーター色素で室内を満たし、プレキシガラス室の底部にシリコングリスを使用してカバースリップを密封。 </li><li>灌流システムとポンプにチャンバーを接続し、リットルml /分で一定灌流のためのインジケーター色素の流れをオンにします。 </li><li> 1Hzの速度で、60秒の動画を記録します。 45秒間の低張液に切り替えて、インジケーター色素の15秒で録画を開始します。撮影を停止します。インジケータ色素（少なくとも30秒間）と面一に、新しいムービーを開始します。 6回、すべての映画を保存する - 約5を繰り返します</li><li>変化する透過率の平均化時間経過を得るために、インジケーター色素の透過率のビデオ画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用する。 <ol><li> ImageJのを起動し、「ファイル」、そして、「開く」をクリックして、映画のために参照します。各映画のために、10ピクセル幅の縦型を描く映画の1 番目の画像上の任意の場所を矩形。 ImageJのメインパネル上の「イメージ」をクリックし、ドロップダウンメニューで「トリミング」をクリックします。 </li><li> 「スタック」と「メイクモンタージュ」（列60、行1）：彼らが展開として一列に（60秒ムービーの）60フレームの位置を調整するには、もう一度「イメージ」をクリックしてから、ドロップダウンメニューに連続してクリックします。どこでも画像の行全体に沿って1ピクセルの高水平の矩形を描画し、ImageJのメインパネルで「分析」をクリックし、ドロップダウン·メニューで「プロットプロファイル」をクリックします。注：ウィンドウのモンタージュのプロット &#39;（図示せず）が表示され、透過率データのリストは、そのメニューから開くことができます。映画の各画像は、その10ピクセル幅の四角形、結果的に「タイムベース」に由来する10透過率の値によって、このリストで表現されている（画像連番）が10倍長い。 </li><li>透過率のdatのリストをコピーしますExcelファイルへ（動画ごとに1つのリスト）。インジケーター色素のフラッシュのいくつかの映画から得た透過率の時間のコースを平均。 0.1画像連番を乗算して実時間ベースを生成する。テキストフ​​ァイルに平均化され、時間経過（2列）を保存します。注：平均化する前に、必要に応じて、いずれかの不規則性を拒否するように、個別の経時変化をプロットします。映画はインジケーター色素の定常状態の透過率の少なくとも5最後の秒が含まれていることを確認。 </li></ol></li><li>浸透圧の時間経過のさまざまなパラメータを計算するためのMatlabのフィッティングプログラムP Fフィット（「指標フィット」のパネル、 図3）を起動します。 NOTE：浴溶液中の既知の初期および最終濃度に基づいて、解の変化、浸透濃度の時間経過は（指標色素透過率から、今度は、計算された）濃度の経時変化から算出される、ことを仮定同じダイナミクスに従う色素濃度。 P Fフィットは無料で使用できるプログラムです。 「PfFit_Installer_web.exeは&#39;からダウンロードできます。詳細な説明と定義を持つフィットユーザガイド「F P P Fフィットプログラムをユーザに理解するのに役立つ補足ファイルとしてJoveのを介してアクセス可能である。 </li><li> 「インジケータフィット」パネルで、インジケーター色素の透過率（「指標データファイル」、 図3A）の平均時間経過のデータをインポートし、手動で現在の実験パラメータおよびパラメータ&#39;width&#39;と&#39;の初期推定を挿入「インジケーター色素濃度の経時変化を記述した（ 図3B。クリック」t_halfインジケーター色素濃度（実際のデータとフィット、 図4A）の経時変化のプロットを表示するには、ファイル名を指定して実行」、およびモデル化された（計算値）浴の浸透圧（ 図4B）注：AGOODデータにフィットする（推奨： 図3に示した値で始まる）が不可欠である。 </li></ol> 6。MatlabのフィッティングプログラムP fのフィットを使用して、P fを決定 注：真と完璧な浸透圧計11とプロトプラストの挙動に関する基本的な仮定に加えて、P fの決定は、P fが P fのこのダイナミクスは、時間の根底にあることを、時間とともに変化することがあることを前提にかかっている細胞体積変化の過程と、その3つのパラメータは、それを記述するために十分である：Pの第 （P fの初期値）、スロープPfを （P fの線形変化率）とディレイ（浴の開始までの期間を細胞体積の変化開始までのオスモル濃度変化）。異なるモデルは、null値11を含む異なるこれらのパラメータの組み合わせとその値、を含む、試験することができる。 P <sub&gt;を精製して、これらのパラメータの最適な組み合わせのための適合を検索するF -計算によって-計算された細胞の体積変化11の実験的な時間経過の最も忠実な再現を、今度は、セルの輪郭領域のインポートシリーズから（参照また補足「P fのフィットユーザガイド」）。 <ol><li> 「ボリュームフィット」パネル（ 図5）に切り替えます。インポート用のエリア·データ·ファイル（分析されたプロトプラスト、 図5Aの「地域」の時間経過したテキストファイル）を選択します。パラメータ·ソースとして「最後のインジケータフィッティング」を選択してください（ 図5B;代替案のための「P fのフィットユーザーガイド」を参照してください）。注：これらのパラメータ（ 図5D）は 、手順を適合ボリューム用浴中の浸透圧の変化を再生するために使用される。 </li><li> 「ボリュームフィット」パネル（ 図5（c））では、（初期化P fは 、スロープPfのディレイ（推奨：）P fのパラメータに対する初期推定を埋めるIIで開始し、マーク：それぞれ、1で始まる1、および30）、 &#39;クラス&#39;（推薦モデルを選んだ嵌合する3つのパラメータすべて）のための「チェックする」。 「ファイル名を指定して実行」をクリックし、暫定的な図形（ 図5E）を眼球、必要に応じて、Delayパラメータとレコードの長さを調整します。 </li><li>適合品質を評価し、フィット感のエラーを記録するために、結果のグラフ（ 図6）調べます。いくつかは、それぞれ倍の初期化パラメータを変更し、「-&#39;Runを再。注：プログラムが動かなくなったときにがっかりしてはいけない - ちょうどプログラムを再起動！ </li><li>フィット誤差の最小値を目指して、初期化パラメータの異なる組み合わせを皮切りに、この手順を数回繰り返します。 </li><li>画面から直接フィット結果のリストをコピーし、またはTでそれらを見つける彼は「_FIT_Vol_Results.txt &#39;ファイルを生成されたPfFit。 </li></ol>

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開示するものは何もありません。

ここで説明すると、他の球状の細胞にも原理的に適用可能な単離された植物プロトプラストのP fを 、 例えば 、カエル卵母細胞11を測定するための簡単かつ非常に効率的な手順です。この方法は、細胞への浸透性投与に応答して、P fは測定することに基づいている。このアプローチに基づく他の方法とは対照的に、しかし、浸透圧モル濃度の溶液の変化、 すなわち 、ベースライン細胞体積がである、等張溶液から始まる、一定浴灌流の間、瞬間が、緩やかではない確立された。さらに、この方法は、吸引ピペットを伴わないので、プロトプラストへの妨害を最小限にする。 ここで紹介するアプローチは、異なる植物または組織から、プロトプラストの多様からの測定を可能にします。しかし、計算を伴うための、唯一の球状の細胞を分析することができる。番目のも、酵素の​​単離Eプロトプラストとソリューションの浸透圧は、アッセイ細胞（例えば、トマトの葉肉プロトプラストの酵素の分離がかなり長くシロイヌナズナプロトプラストの場合よりも、時間ほどかか...

水の取り込みと細胞膜を横切って流れるが、細胞および全植物の両方のレベルでの植物の存在の基本的な要件です。細胞レベルでは、アクアポリン（AQPs）は、細胞膜1-3の浸透水透過係数（P fの ）の調節において重要な役割を果たす。 現在までに、いくつかの方法は、異なる植物器官からのプロトプラストのfを内因Pを測定するために採用されている（ すなわち 、根、葉、内皮、 等 、ショーモンらによって概説4）。 P fを測定するためのアプローチの一つは、浸透チャレンジにプロトプラストを露出させるために、その体積変化（ すなわち 、体積変化の初期の線形位相の傾き）の初期速度を監視することである。二つの異なる方法が以前に両方の溶液の瞬間的な交換に基づいて、このアプローチに基づいて説明した。最初のものはimmobilizで構成されてい吸引マイクロピペットでプロトプラストをると溶液流5とマイクロピペット6を使用して別の溶液からプロトプラストを転送する第1の切り替え。高速の溶液交換の非常に開始時の画像取得を可能にするこれらのマイクロピペット吸引マイクロピペットの転送方法は、可能性が高いプロトプラストへの物理的なストレスを伴う、（体積変化の早い直線位相を捕捉する）と、特殊な装置や専門家のマイクロマニピュレーションを必要とします。 ここで説明する方法はマイクロマニピュレーションを伴わない浴潅流が瞬間的でない場合、P fの導出を可能にし、細胞への障害を最小限に抑えることができます。 酵素消化の後、等張液に沈めプロトプラストは、電荷相互作用によってプレキシガラス（別名ルーサイトまたはパースペックス）チャンバーのカバースリップガラスの底に固定化される。その後、一定の入浴灌流の間に、等張液をプロトプラストに低浸透圧の挑戦を生成する低張液によって洗い流されている。プロトプラストの膨潤は、映像を記録した後、浴灌流の時間経過および細胞膨潤の時間経過に関する情報を組み合わせることにより、P fは画像処理及び曲線適合手順によって決定される。 この方法の利点は、実験は非常に効率的であること、それが単一のアッセイにおいて同時に少数の細胞を監視することが可能であり、それは特別な機器や特定のマイクロマニピュレーション技術を必要としないこと、すなわち 。この方法のためのいくつかの応用が可能である。例えば、このような葉肉などの異なる組織や植物由来の細胞のさまざまなネイティブのP fの決定とシロイヌナズナの葉7、トウモロコシの葉の葉肉や根皮質細胞8-10または懸濁液培養細胞11,12から鞘細胞をバンドル。 additiでに、そのような卵母細胞11のような球状の動物細胞のP fはを決定することが可能である。 P fに貢献すると決意;もう一つの例は、プロトプラスト（ 例えば 、キナーゼの遺伝子またはいずれかの他の遺伝子に影響を与える場合があります）でのそれらの遺伝子の一過性発現によりAQP活動の検討を必要とする。例えば、トマトAQP SlTIP2の発現; PEG変換と決定SlTIP2によるシロイヌナズナ葉肉プロトプラストにおける2; 2関連P 13 F。最後に、溶液に添加異なる分子/物質（薬物、ホルモンなど）のfを Pに対する効果の検討もAQPブロッカーのHgCl 2 7の例について、調べることができる。 以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉肉細胞とそれらのP fの決定のプロトプラストの単離を記載している。

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247-1</td><td><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 任意のソース、肛門グレード</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td></td> <td>11718006<a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 任意のソース、肛門グレード</td></tr><tr><td>2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸 (MES)</td><td>Sigma</td><td>15152002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com 任意のソース、肛門グレード</td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>Sigma</td><td>18032003</td><td>http://www.sigmaaldrich.com 任意のソース、肛門グレード</td></tr><tr><td>セルラーゼ</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS002603</td><td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a</td></tr><tr><td>>Pectolyase</td><td>カーラン、&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;米国アリゾナ州フォニックス</td><td>8006</td><td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン K 30 (PVP)</td><td>シグマ</td><td>81420</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">ウシ血清アルブミン (BSA)</a></td><td>Sigma</td><td>A9418-5G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>硫酸プロタミン</td>シ<td>グマ</td><td>P4380</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>シグマ</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>キシレンシアノール</td><td>シグマ</td><td>X4126</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>シリコーン真空グリース重い</td><td>メルク</td><td>107921</td><td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in。?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA</a></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン</td><td>エクリプス TS100/TS100F</td><td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>BIO-RAD</td><td>EP-1 Econo&nbsp;Pump</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Grayscale digital camera</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1308M</td><td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a</td></tr><tr><td>>CMU 1394 Camera Driver' ImageJ</td><td>Carnegie Mellon</td><td></td> <td>用プラグイン<a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> フリーソフト</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> フリーソフト</td></tr><tr><td>エコノグラディエントポンプ継手キット</td><td>BIO-RAD</td><td>731-9006</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>コネクタ、マニホールド</td><td>DirectMed</td><td></td><td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td></tr><tr><td>ビュレット輸液セット(カラム)</td><td>ウェルフォード</td><td>IF-BR-001</td><td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>タイゴン</td><td>R-3603</td><td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a</td></tr><tr><td>>3M 包装 スコッチテープ 1'', クリア</td><td>バイキング インダストリアル, 英国</td><td>VKMONO25</td><td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#。UuvqOftdy_8</a> 透明な粘着テープ(セロテープなど)なら何でもOKです</td></tr></tbody></table>

浸透水透過係数（pの測定<sub&gt; f</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

AQP調節機構を研究することは、細胞および全植物の両方のレベルでの水関係の理解のために重要である。ここで紹介するようなカエル卵母細胞などの他の球状の細胞にも原理的に適用可能な植物プロトプラストにおける浸透水透過係数（P fを ）決定するための簡単かつ非常に効率的な方法です。アッセイの最初のステップは、適切な等張液と室内への酵素的消化により関心対象の植物組織からのプロトプラストの単離である。第二段階は、浸透圧の挑戦アッセイで構成されています。室の底に固定化されたプロトプラストは、等張液で始まる定数灌流に提出し、低張液が続いている。細胞膨張は、ビデオ記録される。第三のステップでは、画像は体積変化を得るために、オフライン処理され、体積変化の時間経過をosmola変化の時間経過と相関しているチャンバ灌流培地のrity、P fで得た、Matlabの（ &#39;PfFit&#39;）で記述された曲線当てはめ手順を使用する。

P fで決定し、異なるAQPsの活性を比較するために、シロイヌナズナの葉からの葉肉プロトプラストが用いられる。これらのプロトプラストは、低い基底（背景）P fはレベル 7を有することが見出されたかつ再現P fの測定を可能にするために機能的な発現系として働くことができる。 6週齢のシロイヌナズナ植物からの成熟葉からプロトプラストを単離し、3遺伝子は、シロイヌナズナからAQP遺伝子と構築（AtPIP2; 1）、トウモロコシ（ZmPIP1; 2及びZmPIP2; 4）（別途と）一過性であったPEG変換を用いて表現する方法15。プラスミドの多数にかかわらず、その性質のセルに適用され、他の植物系について以前に報告された一つのセルに二つのプラスミドの同期された一過性発現のために100％の成功率を示した結果に基づいて変換するためのイベントが同時であると仮定すると15,16は、それらは形質転換されたプロトプラスト（ ...

細胞の浸透水透過係数（P fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

次の実験の全体的な目標は、植物プロトプラストの浸透水透過係数(PF)を決定することにより、アクアポリンの機能について学ぶことです。軸方向の表皮のない葉から小片を切り取り、等張液の上に置きます。断片を酵素溶液に移し、摂氏28度で20分間インキュベートし、次に新鮮な等張溶液にインキュベートします。次に、先端を切り取ったプロトプラストを含む溶液を回収します。第2ステップとして、実験チャンバーを準備します。スライドの底にシリコングリースを使用してカバースリップを取り付けます。次に、チャンバーの底部を正電荷ベアリング接着剤でコーティングし、チャンバーに等張溶液を充填します。次に、単離されたプロトプラストをチャンバーに加え、チャンバーを顕微鏡ステージ上に繊細に配置します。その後、プロトプラストは低張液にさらされ、ビデオは腫れの時間経過をキャプチャするために記録されます。次に、腫脹の時間経過を、例えば異なるアクアポリン遺伝子の発現によって誘導されるPFの違いを示す数値解析結果が得られる数値解析結果に基づいて、各プロトプラストのPFを決定するために、cur fitting手順を含むソフトウェアによって数値的に分析されます。この方法は、アクアポリンの機能の調節など、細胞膜生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、天然または遺伝子組み換えの植物水植物の水、透過性についての洞察を提供することができます。また、IDE露出の関心のある起源などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始する前に、必要な等張性および高張性溶液を準備し、それらの浸透圧を確認します。.OSM oterを使用すると、各溶液の浸透圧は目標値の3%以内である必要があります。10センチメートルのシャーレに約6滴の等張液を入れます。ABBAシールをはがすか、ウサギのopsysの葉の表皮を下げ、皮をむいた葉を約4×4ミリメートルの正方形に切ります。露出した軸面を下にして、等張溶液滴に小片を置き、溶液に触れます。次に、1.5ミリリットルのチューブに5.7ミリグラムの酵素ミックスを165マイクロリットルの等張液に溶かし、溶解するまで1分ほどピペッティングして穏やかに混合します。同じペトリ皿に酵素溶液の類似した滴を数滴入れます。葉片を酵素溶液に移します。滴。皿を閉じ、1ラウンドのパーフィルで蓋を密封します。摂氏28度に設定された水浴に皿を20分間浮かべます。20分後、鉗子を使用して、等張液をさらに数滴皿に加えます。各リーフピースを端で持ち上げて、新しい等張溶液に移します ドロップ 次に、次に 2 番目のドロップに移します。2滴目でリーフピースを振って、切り取った100マイクロリットルのピペットチップを使用してプロトプラストを放出します。プロトプラストと一緒に滴を1.5ミリリットルのチューブに集めます。1つのカラムに等張液を充填し、もう1つのカラムに低張液を充填して、プロフュージョンシステムを準備します。バルブを開いて、低張液を流し、チューブをインレットマニホールドまで満たします。気泡が溜まっていないことを確認したら、バルブを閉じます。等張性溶液についても繰り返します。プレキシガラススライド内のチャンバーの底を作るためにシリコーングリースを使用してカバースリップを密封し、チャンバーの底をプロトプラスト用に粘着性にし、正の電荷を持つ硫酸プロタミンまたはポリLリジンでコーティングします。ピペットチップを使用して、この接着剤をカバースリップに広げます。1〜2分待ちます。等張液で3〜4回すすぎ、残りの溶液を振り落とします。チャンバーを等張液で満たします。次に、クリップで留めたピペットチップを使用して、溶液を含むプロトプラストをチャンバーに一滴加えます。そして、プロトプラストが落ち着くまで3〜4分待ちます。溶液表面に触れる透明なカバーでチャンバーを覆います。下に気泡を閉じ込めないでください。倒立顕微鏡テーブルにスライドを静かに置き、灌流システムとポンプに接続して、チューブ内の気泡を防ぎます。等張溶液の流れをオンにして、毎分1ミリリットルで一定の灌流を行います。ボリュームの変更を記録するには、球形のセルをできるだけ多く含み、セルの周囲長に焦点が合ったセル輪郭を持つビューフィールドを選択します。選択した動かないプロトプラストの62番目のビデオを、1秒あたり1枚の画像または1ヘルツの速度で記録します。等張液を15秒間洗浄して録音を開始し、高張液に45秒間切り替えます。腫脹細胞の一連の画像を解析するには、Image ExplorerとImage Jソフトウェアのprotoplasts analyzerプラグインを使用して、動画をTiff形式で保存します。画像を開始 J.To ムービーを開き、Image Jパネルの[ファイル]をクリックしてから、インポートを展開するときにドロップダウンメニューを連続してクリックします。次に、画像エクスプローラー。選択したムービーをハイライトします。それを右クリックしてから左にクリックします。protoplasts analyzerをクリックします。最初の画像で、マウスを使用して、選択したプロトプラストの周りに円を描きます。次に、[OK]をクリックします。protoplasts 検出アルゴリズムを起動するように表示される検出パラメータのテーブルで、protoplasts 画像の上部パネルで [local] をクリックします。次に処理します。ドロップダウンメニューで、ムービー全体で選択したプロトプラストの周りの緑色の円を確認します。下部のスライダーを使用して、結果をExcelファイルに保存します。分析はフレームごとに行われます。したがって、複数のセルの場合には、ここでは各セルに属する行を分離してソートする必要がある。3 つのタイム コースは、ピクセルから平方マイクロメートルに変換された面積値で並べ替える前と後に Excel シートに表示されます。その後、各タイムコースは別々のテキストファイルにエクスポートされます。この手順を開始するには、チャンバーを灌流システムとポンプに接続し、インジケーターダイフローをオンにして、1分あたり1ミリリットルの一定の灌流速度で、1ヘルツの速度で62番目のビデオを録画します。インジケーターダイの15秒で録音を開始し、その後、高張液に切り替えます45秒間、録音を停止します。インジケーターと同じ高さにします。少なくとも30秒間再度死にます。新しい映画を始める前に、映画を録画し、5〜6本の映画を保存して映画を分析します。変化するインジケータダイの透過率の平均時間経過を取得するには、画像Jのファイルをクリックします。次に、ムービーを開いて参照します。ムービーごとに、ムービーの最初の画像の任意の場所に幅 10 ピクセルの縦長の長方形を描画し、Image J メイン パネルの画像をクリックします。次に、ドロップダウンメニューの[切り抜き]をクリックします。60フレームを1行に揃えるには、画像をクリックし、ドロップダウンメニューで連続してクリックし、スタックを展開してモンタージュを作成します。画像の行全体に沿って高さ 1 ピクセルの水平長方形を任意の場所に描画し、Image J メインパネルで [分析] をクリックします。次に、plot profileをクリックします。ドロップダウンメニューで、透過率データのリストをExcelファイルにコピーします。インジケータダイフラッシュのSeroムービーから取得した透過率時間コースを平均化します。イメージの連番に 0.1 を掛けて、リアルタイム ベースを生成します。平均時間経過をテキストファイルに保存して、浸透圧時間経過のさまざまなパラメータを計算します。使用可能な MATLAB フィッティング プログラム PF fit を使用します。無料。このプログラムのダウンロードと使用の詳細については、プロトコルのテキストを参照してください。インジケーターフィットパネル。インジケーター染料透過率の平均時間経過のデータをインポートします。現在の実験パラメータを手動で入力し、アリH.Describing 指標色素濃度の時間経過も変更され得る。実行をクリックして、指標DAI濃度とモデル化された浴浸透圧の時間経過のプロットを表示します。データへの適切な適合は、透水性係数を決定するために不可欠です。ボリュームフィットパネルに切り替えます。エリアのデータファイルのインポートを選択します。パラメータソースとして最後の指標フィッティングを選択します。モデルクラスを選択します。2つから始めます。PF パラメータ pf slow PF と delay は、たとえば図のように初期化する必要がありますが、他の値も可能です。マークは、適合する3つのパラメータすべてをチェックします。「実行」をクリックします。次に、暫定的な数値を目視し、必要に応じて遅延パラメータとレコードの長さを調整します。結果グラフを調べて、適合と品質を評価し、適合誤差を記録します。初期化パラメータをそれぞれ数倍変更して、再実行します。この手順を数回繰り返し、初期化パラメータの異なる組み合わせから始めて、水透過係数またはpfを決定するために適合誤差の最小値を目指し、ウサギのopsys葉から異なるアクアポリンMesilプロトプラストの活性を比較し、ウサギのアクアポリン遺伝子を持つ3つの遺伝子コンストラクトで単離され、別々に形質転換された。 opsys と maze。プロトプラストは、増強された緑色蛍光タンパク質をコードするベクターとの共配列によって標識されました。低張チャレンジへの曝露による細胞体積変化の時間経過は、各細胞について取得され、低張チャレンジ中の入浴浸透圧変化の時間経過と同様に、PF値は各細胞について導出されました。PF FITプログラムを用いて、3つのアクアポリンのそれぞれで形質転換したPROTOPLASTのPF値は、GFPのみで形質転換したコントロール細胞のPFよりも有意に高いことが観察されました。この手法を習得すると、適切に実行すれば、数日の実験で数十個の細胞を分析できます。このビデオを見れば、単離されたプロトプラストまたは低張アッセイを受けた他の焦点細胞におけるSMO水透過性を決定する方法について十分に理解できるはずです。ご不明な点がございましたら、お気軽にお問い合わせください。

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

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血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

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単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

学ぶ植物プロトプラストの浸透圧水透過係数（Pf）測定法。アクアポリン機能を解析し、細胞膜の水輸送機構を解明します。葉からのプロトプラスト単離と体積変化解析により、水透過性を定量的に評価できます。

浸透水透過係数（Pの測定

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