浸透水透過係数（Pの測定 _F）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

次の実験の全体的な目標は、植物プロトプラストの浸透水透過係数(PF)を決定することにより、アクアポリンの機能について学ぶことです。軸方向の表皮のない葉から小片を切り取り、等張液の上に置きます。断片を酵素溶液に移し、摂氏28度で20分間インキュベートし、次に新鮮な等張溶液にインキュベートします。

次に、先端を切り取ったプロトプラストを含む溶液を回収します。第2ステップとして、実験チャンバーを準備します。スライドの底にシリコングリースを使用してカバースリップを取り付けます。

次に、チャンバーの底部を正電荷ベアリング接着剤でコーティングし、チャンバーに等張溶液を充填します。次に、単離されたプロトプラストをチャンバーに加え、チャンバーを顕微鏡ステージ上に繊細に配置します。その後、プロトプラストは低張液にさらされ、ビデオは腫れの時間経過をキャプチャするために記録されます。

次に、腫脹の時間経過を、例えば異なるアクアポリン遺伝子の発現によって誘導されるPFの違いを示す数値解析結果が得られる数値解析結果に基づいて、各プロトプラストのPFを決定するために、cur fitting手順を含むソフトウェアによって数値的に分析されます。この方法は、アクアポリンの機能の調節など、細胞膜生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、天然または遺伝子組み換えの植物水植物の水、透過性についての洞察を提供することができます。

また、IDE露出の関心のある起源などの他のシステムにも適用できます。この手順を開始する前に、必要な等張性および高張性溶液を準備し、それらの浸透圧を確認します。.OSM oterを使用すると、各溶液の浸透圧は目標値の3%以内である必要があります。

10センチメートルのシャーレに約6滴の等張液を入れます。ABBAシールをはがすか、ウサギのopsysの葉の表皮を下げ、皮をむいた葉を約4×4ミリメートルの正方形に切ります。露出した軸面を下にして、等張溶液滴に小片を置き、溶液に触れます。

次に、1.5ミリリットルのチューブに5.7ミリグラムの酵素ミックスを165マイクロリットルの等張液に溶かし、溶解するまで1分ほどピペッティングして穏やかに混合します。同じペトリ皿に酵素溶液の類似した滴を数滴入れます。葉片を酵素溶液に移します。滴。

皿を閉じ、1ラウンドのパーフィルで蓋を密封します。摂氏28度に設定された水浴に皿を20分間浮かべます。20分後、鉗子を使用して、等張液をさらに数滴皿に加えます。

各リーフピースを端で持ち上げて、新しい等張溶液に移します ドロップ 次に、次に 2 番目のドロップに移します。2滴目でリーフピースを振って、切り取った100マイクロリットルのピペットチップを使用してプロトプラストを放出します。プロトプラストと一緒に滴を1.5ミリリットルのチューブに集めます。

1つのカラムに等張液を充填し、もう1つのカラムに低張液を充填して、プロフュージョンシステムを準備します。バルブを開いて、低張液を流し、チューブをインレットマニホールドまで満たします。気泡が溜まっていないことを確認したら、バルブを閉じます。

等張性溶液についても繰り返します。プレキシガラススライド内のチャンバーの底を作るためにシリコーングリースを使用してカバースリップを密封し、チャンバーの底をプロトプラスト用に粘着性にし、正の電荷を持つ硫酸プロタミンまたはポリLリジンでコーティングします。ピペットチップを使用して、この接着剤をカバースリップに広げます。

1〜2分待ちます。等張液で3〜4回すすぎ、残りの溶液を振り落とします。チャンバーを等張液で満たします。

次に、クリップで留めたピペットチップを使用して、溶液を含むプロトプラストをチャンバーに一滴加えます。そして、プロトプラストが落ち着くまで3〜4分待ちます。溶液表面に触れる透明なカバーでチャンバーを覆います。

下に気泡を閉じ込めないでください。倒立顕微鏡テーブルにスライドを静かに置き、灌流システムとポンプに接続して、チューブ内の気泡を防ぎます。等張溶液の流れをオンにして、毎分1ミリリットルで一定の灌流を行います。

ボリュームの変更を記録するには、球形のセルをできるだけ多く含み、セルの周囲長に焦点が合ったセル輪郭を持つビューフィールドを選択します。選択した動かないプロトプラストの62番目のビデオを、1秒あたり1枚の画像または1ヘルツの速度で記録します。等張液を15秒間洗浄して録音を開始し、高張液に45秒間切り替えます。

腫脹細胞の一連の画像を解析するには、Image ExplorerとImage Jソフトウェアのprotoplasts analyzerプラグインを使用して、動画をTiff形式で保存します。画像を開始 J.To ムービーを開き、Image Jパネルの[ファイル]をクリックしてから、インポートを展開するときにドロップダウンメニューを連続してクリックします。次に、画像エクスプローラー。

選択したムービーをハイライトします。それを右クリックしてから左にクリックします。protoplasts analyzerをクリックします。

最初の画像で、マウスを使用して、選択したプロトプラストの周りに円を描きます。次に、[OK]をクリックします。protoplasts 検出アルゴリズムを起動するように表示される検出パラメータのテーブルで、protoplasts 画像の上部パネルで [local] をクリックします。

次に処理します。ドロップダウンメニューで、ムービー全体で選択したプロトプラストの周りの緑色の円を確認します。下部のスライダーを使用して、結果をExcelファイルに保存します。

分析はフレームごとに行われます。したがって、複数のセルの場合には、ここでは各セルに属する行を分離してソートする必要がある。3 つのタイム コースは、ピクセルから平方マイクロメートルに変換された面積値で並べ替える前と後に Excel シートに表示されます。

その後、各タイムコースは別々のテキストファイルにエクスポートされます。この手順を開始するには、チャンバーを灌流システムとポンプに接続し、インジケーターダイフローをオンにして、1分あたり1ミリリットルの一定の灌流速度で、1ヘルツの速度で62番目のビデオを録画します。インジケーターダイの15秒で録音を開始し、その後、高張液に切り替えます45秒間、録音を停止します。

インジケーターと同じ高さにします。少なくとも30秒間再度死にます。新しい映画を始める前に、映画を録画し、5〜6本の映画を保存して映画を分析します。

変化するインジケータダイの透過率の平均時間経過を取得するには、画像Jのファイルをクリックします。次に、ムービーを開いて参照します。ムービーごとに、ムービーの最初の画像の任意の場所に幅 10 ピクセルの縦長の長方形を描画し、Image J メイン パネルの画像をクリックします。

次に、ドロップダウンメニューの[切り抜き]をクリックします。60フレームを1行に揃えるには、画像をクリックし、ドロップダウンメニューで連続してクリックし、スタックを展開してモンタージュを作成します。画像の行全体に沿って高さ 1 ピクセルの水平長方形を任意の場所に描画し、Image J メインパネルで [分析] をクリックします。

次に、plot profileをクリックします。ドロップダウンメニューで、透過率データのリストをExcelファイルにコピーします。インジケータダイフラッシュのSeroムービーから取得した透過率時間コースを平均化します。

イメージの連番に 0.1 を掛けて、リアルタイム ベースを生成します。平均時間経過をテキストファイルに保存して、浸透圧時間経過のさまざまなパラメータを計算します。使用可能な MATLAB フィッティング プログラム PF fit を使用します。

無料。このプログラムのダウンロードと使用の詳細については、プロトコルのテキストを参照してください。インジケーターフィットパネル。

インジケーター染料透過率の平均時間経過のデータをインポートします。現在の実験パラメータを手動で入力し、アリH.Describing 指標色素濃度の時間経過も変更され得る。実行をクリックして、指標DAI濃度とモデル化された浴浸透圧の時間経過のプロットを表示します。

データへの適切な適合は、透水性係数を決定するために不可欠です。ボリュームフィットパネルに切り替えます。エリアのデータファイルのインポートを選択します。

パラメータソースとして最後の指標フィッティングを選択します。モデルクラスを選択します。2つから始めます。

PF パラメータ pf slow PF と delay は、たとえば図のように初期化する必要がありますが、他の値も可能です。マークは、適合する3つのパラメータすべてをチェックします。「実行」をクリックします。

次に、暫定的な数値を目視し、必要に応じて遅延パラメータとレコードの長さを調整します。結果グラフを調べて、適合と品質を評価し、適合誤差を記録します。初期化パラメータをそれぞれ数倍変更して、再実行します。

この手順を数回繰り返し、初期化パラメータの異なる組み合わせから始めて、水透過係数またはpfを決定するために適合誤差の最小値を目指し、ウサギのopsys葉から異なるアクアポリンMesilプロトプラストの活性を比較し、ウサギのアクアポリン遺伝子を持つ3つの遺伝子コンストラクトで単離され、別々に形質転換された。 opsys と maze。プロトプラストは、増強された緑色蛍光タンパク質をコードするベクターとの共配列によって標識されました。低張チャレンジへの曝露による細胞体積変化の時間経過は、各細胞について取得され、低張チャレンジ中の入浴浸透圧変化の時間経過と同様に、PF値は各細胞について導出されました。

PF FITプログラムを用いて、3つのアクアポリンのそれぞれで形質転換したPROTOPLASTのPF値は、GFPのみで形質転換したコントロール細胞のPFよりも有意に高いことが観察されました。この手法を習得すると、適切に実行すれば、数日の実験で数十個の細胞を分析できます。このビデオを見れば、単離されたプロトプラストまたは低張アッセイを受けた他の焦点細胞におけるSMO水透過性を決定する方法について十分に理解できるはずです。

ご不明な点が