マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

この手順の全体的な目的は、炎症性心疾患を患った生体動物の心臓をイメージングすることにより、心機能異常を確認することです。これは、まず心筋炎などの疾患を誘導し、次に動物を磁気共鳴顕微鏡イメージングに向けて準備し、動物ホルダーに設置することで達成されます。

次に、心臓画像を撮影するためにマウスを磁石の中に配置します。最後のステップは、segmentソフトウェアを使用して心機能パラメータを解析することです。最終的に、この手法を用いて、自己免疫性心筋炎を発症したマウスの心不全末期拡張期容積および駆出率を算出します。

組織病理学などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、非侵襲的であり、心臓の3次元高解像度像を提供できることです。本手法は、炎症性心疾患の診断を含む循環器学分野における重要な課題の解決に寄与します。一般的に、本手法に不慣れな者は、磁気共鳴マイクロイメージング撮影のための動物調製に習熟していないため、習得に苦労することがあります。

したがって、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。まず、自己免疫性心筋炎を誘導するためのペプチド溶液を調製することから本プロトコルを開始します。cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、最終濃度を2 mg/1.5 mLにします。次に、50 µgの凍結乾燥百日咳毒素を含むバイアルに、滅菌済み1xリン酸緩衝生理食塩水を1 mL加えて、百日咳毒素を調製します。

ストック濃度を50 ng/µLにします。次に、そのストック液20 µLを滅菌済みの1.5 mLチューブに取り、滅菌済みの1×リン酸緩衝生理食塩水980 µLを加えて、作業濃度を1 ng/µLにします。また、40 mgの結核菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv）またはMTB抽出物を10 mLのCFAに加えて、最終濃度を5 mg/mLにした完全フロイントアジュバント（CFA）を調製します。

次に、ペプチドCFAエマルションを調製します。1.5 mLのエマルション分注量を用意するため、1本の1.5 mLチューブに750 µLのcardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52ペプチド溶液を入れ、もう1本の1.5 mLチューブに同量のMTB抽出物添加CFAを分注します。その後、3 mLルアーロックシリンジを用いて、まずペプチド溶液を吸引し、続いてCFA-MTB抽出物を吸引します。このシリンジを3方活栓に取り付け、活栓のもう一方の出口を空の3 mLシリンジに接続します。

ストップコックの開度を調節します。ペプチドCFA混合液が一方のシリンジからもう一方のシリンジへ、適度な抵抗感を持って流れるようにしてください。内容物を一方のシリンジからもう一方へ繰り返し押し出すことで、約1分間混合し、その後、アセンブリ全体を氷上に約3分間置きます。

この手順を最低10回繰り返します。100 mLのガラスビーカーに入れた静止水に、ごく少量の液滴を慎重に滴下し、エマルションの均質性を判定します。液滴が水中で分散しないことを確認してください。分散する場合は、目的の均質性が得られるまで混合を続けます。

エマルションの内容物を3 mLシリンジから1 mLルアーロックシリンジに転送します。ストップコックに取り付けられた2本の3 mLシリンジのうち1本を1 mLシリンジに交換し、その後、27.5ゲージの針を取り付けます。

6〜8週齢の雌性 aj. マウスの両鼠径部に、ペプチドCFAエマルジョン 150 µLを分割して皮下注射します。次に、免疫後の0日目と2日目に、各個体に百日咳毒素懸濁液 100 µLを腹腔内投与します。7日目に免疫手順を繰り返し、ペプチドCFAエマルジョン 150 µLを胸骨の両側に分割して皮下注射します。

このエマルションは、記載の方法で調製直後に使用してください。その後、21日目に動物にMRMイメージングを行います。イメージングの準備として、まず各マウスを加熱パッドで保温した、2% ISO fluorine空気混合物を含む麻酔導入チャンバーに入れます。

その後、動物を専用の動物ホルダーに移します。バイトバーで頭部を固定し、動物を腹臥位で不動化させます。麻酔を維持するため、鼻先をノーズコーンに適合させてください。

実験中の動物の体温を維持するため、エアブローヒーターの吐出ホースをスキャナーの垂直ボードに挿入して電源を入れます。撮像セッションの間、イソフルラン濃度1～2%、流量2 mL/minで麻酔を維持してください。足指をピンチすることで、麻酔状態であることを確認します。

次に、撮像セッション中の呼吸と体温をモニターするため、ニューマチックピローセンサーと直腸温度プローブを設置します。また、左足首にファイバー optic パルスオキシメトリセンサーを取り付け、足は糸のループで固定し、位置を維持するためにテープで留めてください。撮像は、造影剤を使用せずに呼吸信号と心拍信号によるゲーティングを行うことで実施します。

高解像度の3次元磁気共鳴顕微鏡像を得るには、広開口の9.4 Tesla垂直ボアマグネットを使用してください。動物の準備が整ったら、心臓が視野の中心に位置するようにマウスをスキャナーに配置します。次に、イメージングインターフェースを起動し、コマンドバーの「new study type」メニューからチューニングページを開き、「start probe」、「tune」、「autoscale」を順に選択します。

コイル端にあるリモートチューニング・マッチングノブを使用して、RFコイルをプロトンの共鳴周波数である400 megahertzに調整します。次に、プリスキャンページに移動します。周波数およびパワーのキャリブレーションを実行するには、x, Y, Zクイックボタンを押してシミングページを表示させてください。

次に、すべてのイテレーションを選択し、オートシミングを実行します。スカウトシーケンスを選択してください。視野（FOV）を35 millimetersに変更します。

その他の設定はデフォルトのままにし、シーケンスを実行します。心臓が視野の中心にない場合は、アニマルホルダーの位置を調整し、RFコイルのチューニングをやり直して、スカウト画像を再取得してください。その後、gemシーケンスを選択します。

心臓の短軸および長軸に沿った2つの直交平面を取得するために、ここにある取得タブに取得パラメータを入力します。次に、パルスオキシメトリゲージ短軸シネ画像を収集するためのシネシーケンスを選択し、左室の解剖学的および機能的パラメータを測定します。グラジエントエコーシネシーケンスを取得するために、ここに示されているパラメータを入力してください。

心臓の長軸像に基づき、イメージングスライスの位置と角度を調整します。その後、シーケンスを実行してください。イメージングが完了したら、

IOタブを使用して、取得した画像をDICOM形式に変換し、対応するファイルを処理のためにデータセンターへ転送します。撮像手順の終了後、動物をフィルター付きケージ内で麻酔から回復させます。マウスが胸立位を保持できる十分な意識を取り戻すまで、目を離さないでください。

ここでは、Segmentソフトウェアを使用して左室の解剖学的および機能的パラメータを解析します。まず、DICOM形式のシネ画像をソフトウェアに読み込みます。次に、撮像法としてMRGEを、画像タイプとしてcineを、および短軸心室中部を選択します。

画像ビュー平面で、編集メニューの「現在のタイムフレームを拡張末期に設定」および「現在のタイムフレームを収縮末期に設定」サブメニューを使用して、拡張末期と収縮末期に使用するタイムフレームを指定します。次に、右下のパネルにあるLVボタン、続いてendoボタンとEPIボタンを使用します。左心室、心内膜、心外膜をそれぞれ手動で描画し、対応するコマンドボタンを押して乳頭筋を除去します。

計算の精度を高めるために、右上パネルに表示される拡張末期容量、収縮末期容量、1回拍出量、および駆出率などの定量化された左室パラメータを確認します。次に、misコマンドボタンと計測キャリパーコマンドボタンを使用して、壁厚や心室径などの左室パラメータを測定します。最後に、必要に応じて画像を再処理できるよう、「save both image stacks and segmentation」オプションを使用して、セグメンテーションを含む画像をdot mat形式で保存してください。

2腔室ビューの画像取得のために心臓を切り出した角度をここに示します。ここでは、健康なマウスと比較して、実験的自己免疫性心筋炎を発症したマウスの心臓において、左室壁厚がおよそ1.5倍に増加しており、構造的欠陥があることがわかります。左室拡張末期容積および駆出率に基づいて測定した心拍出量は、健康なマウスと比較して、自己免疫性心筋炎を発症したマウスで減少していました。

最後に、上記の治療群の心臓をヘマトキシリン・エオジン染色により評価し、炎症を確認しました。健康なマウスではなく心筋炎マウスの心臓の組織学的評価では、多焦点性のリンパ球浸潤が認められました。この手順を行う際は、実験中に心拍数や呼吸数が大きく変動しないよう、動物の体温を一定に保つことが重要です。これは、再現性のある結果を得るために不可欠です。

このビデオを視聴することで、心筋炎などの炎症性心疾患における機能的異常をマウスで評価するための磁気共鳴顕微鏡法の技術について、十分に理解できるはずです。ただし、高磁場での作業は非常に危険であるため、アニマルホルダーおよびその他の構成部品は非磁性体でなければならないことに留意してください。