Name: マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学ぶ磁気共鳴イメージング顕微鏡法によるマウスの実験的自己免疫性心筋炎における心臓機能異常の非侵襲的評価法。この技術は収縮末期容積と駆出率の定量的解析を可能にし、炎症性心疾患の進行監視に有用です。

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この作業は国立衛生研究所（HL114669)の支援を受けました。CMは、ニュージャージー州心筋炎財団から授与されたポスドク研究フェローシップ助成金の受領者です。

倫理声明： 全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。 実験的自己免疫性心筋炎の1。誘導<ol><li> 2 mg/1.5 mlの最終濃度になるように、1Xリン酸緩衝生理食塩水でMyHCの-α334から352を溶解することにより、ペプチド溶液を調製する。 </li><li> 50 NG /μLのストック濃度を得るために、凍結乾燥されたPTの50μgのを含むバイアルに無菌1X PBSを1ミリリットルを追加することによって、百日咳毒素（PT）を準備します。滅菌した1.5​​ミリリットルチューブにストックの20μLを取り、1 NG /μLの作業濃度を得るために、無菌1X PBSを980μlを加える。 </li><li> 結核菌H37Rv、40mgの（MTB）を加えることにより、完全フロイントアジュバント（CFA）を調製し、最終濃度を得るために、CFAの10mlの抽出5 mg / mlと。 </li><li>ペプチド - CFAエマルジョンを準備します。注：EAM誘導のために、ペプチド-CFAエマルジョンは動物当たりMyHCの-α334から352の100μgのを含む150μLで投与した。例えば、10匹のマウスがMyHCの334から352-α1mgを含有するペプチドCFAエマルジョンを1.5mlを使用して免疫化する。 <ol><li>エマルジョンの1.5ミリリットルを準備するために、一定分量750 1 1.5ミリリットルチューブに334から352ペプチド溶液をMyHCのは、-αのμL、およびCFAを別の1.5ミリリットルチューブにMTBを補った。 CFA / MTBエキスが続き、3ミリリットルルアーロック注射器を用いて、最初のペプチド溶液を描く。 </li><li> 3方活栓にシリンジを取り付け、空の3ミリリットル注射器に活栓の他のコンセントに接続します。活栓の開通性を調節するため、ペプチド - CFAの混合物が適度に良好な耐性を有する他に1シリンジから流出する。 </li><li> 〜1分間繰り返し、他に1シリンジからコンテンツをプッシュすることで混合し、次いで〜3分間氷上にアセンブリ全体を置きます。これを繰り返します手順10倍の最小。 </li><li>慎重に100ミリリットルのガラス製ビーカーに、まだ水の上に小さな水滴を配置することによって、エマルジョンの一貫性を決定する。液滴が水に分散しないと予想される。それがない場合は、所望のコンシステンシーが得られるまで混合を続ける。 </li><li> 1mlシリンジと活栓に取り付けられた2つの3-mlの注射器のいずれかを置き換えることにより、1ミリリットルルアーロックシリンジに3ミリリットルの注射器から、エマルションの内容を転送し、1ミリリットルの注射器に27½G針を取り付けます。 </li></ol></li><li> 6対8週齢の雌のA / Jマウス（〜75μLずつ）の2鼠径地域で皮下に分割用量でペプチド - CFAエマルジョン150μlのを注入する。 </li><li> 0日目と2日目免疫後に腹腔内に各動物にPT懸濁液（100 NG）を100μlを管理します。 </li><li>皮下Tのいずれかの側に分割用量でペプチド - CFAエマルジョン150μlのを投与することにより、7日目に免疫化手順を繰り返します彼は胸骨（〜75μLずつ）。上記のように新鮮なこのエマルジョンを準備します。その後、21日目に、ステップ3を参照して、MRMイメージングに動物をさらす。 </li></ol> 2。動物の取り扱い<ol><li>暖かさを維持し、特別に設計された動物のホルダー（ 図1）に動物を転送するために下に配置加熱パッドで2％イソフルランと空気の混合物を含む麻酔導入チャンバー内に各マウスを置きます。 </li><li>動物ホルダーの腹臥位で動物を固定するので、その鼻は麻酔（ 図1）を維持するためにノーズコーンに適合します。マウスの前歯に装着一口バーでマウスの頭部を固定します。 </li><li>実験中、動物の体温を維持するために、スキャナの垂直穴に挿入され、その出口ホースとエアーブローヒーターの電源をオンにします。 </li><li>全体のイメージングセッションの間に2ml /分の流速で0.5 2％イソフルランで麻酔を維持する。確認するつま先ピンチ方式を用いて麻酔、全く動きが期待できない。 </li><li>空気圧センサ枕、マウス尾/足首光ファイバーパルスオキシメトリセンサ、及びそれぞれ呼吸、心拍数および体温をモニターする直腸温度プローブ、（ 図1）を設定する。注：心臓ゲーティングは動脈血酸素飽和度の非侵襲的モニタリングを可能にするパルスオキシメトリ、を介して行われる。パルスオキシメトリセンサが左足首に装着する必要があり、足が糸ループで固定し、センサ内の足首を維持するためにテープする必要があります。 MRMイメージングは​​、任意の造影剤を使用せずに呼吸と心臓信号をゲーティングすることによって達成される。 </li></ol> 3。画像取得<ol><li>動物（ 図1）を調製した後、磁場均一度が最大となる視野（FOV）の中心に位置する心臓とMRMスキャナの中心にマウスを置き。注：ワイドボア（89 mm）の三重100 G / cmで軸勾配及び4センチ無線周波数（RF）イメージングコイルを備えた9.4 Tの垂直ボア磁石は、高解像度の三次元（3D）画像を得るために使用されるべきである。注：MRIスキャナを使用する際に、非磁性の供給するようにしてください。 </li><li>イメージングインタフェースを実行し、「留学オプション」メニューから「新しい研​​究」を選択します。コマンドバーの「mtuneへ」と入力し、「チューニングGUIの「プルアップするためにそれを実行してください。その後、 &quot;スタートプローブチューニング」を選択し、「オートスケール」ボタンをクリックしてください。チューンGUIは、RF信号を表示するように変更されます。プロトン共鳴周波数（400 MHz）でのRFコイルチューニングしたコイルの端にあるリモートチューン/マッチノブを使用してください。 「スタート」タブに関連するボタンをクリックすることで周波数とパワーキャリブレーションを実行するために「プレスキャン」ページに移動します。シムページをプルアップするためのタブ「研究シム &quot;のタブで&quot; &#39;上のXYZ（クイック）ボタンを押してください。シムページに移動し、繰り返しのすべてを選択して、自動シミングを実行するためにシムボタンを押してください。 </li><li>マウス心臓をローカライズするイメージング·インターフェースの「研究」タブからスカウトシーケンスを選択します。 「取得」タブで35ミリメートル2にFOVを変更して、マシンのデフォルト設定を保持します。シーケンスを実行するには[スタート]ボタンをクリックし、心臓がFOVの中心にない場合、動物ホルダの位置を調整するRFコイルを再調整し、再スカウト画像を得た。 </li><li>その後、短軸と心臓20,21の長軸に沿って二つの直交する平面を得るために、対応する「取得」タブの収集パラメータを入力し、「研究」タブの「GEMS」配列]ボタンをクリックします。注：グラディエントエコースキャンの典型的な取得パラメータは、以下のとおりです。スライス厚、1ミリメートル;繰り返し時間（TR）、200ミリ秒;エコー時間（TE）、2.67ミリ秒（最小）;フリップ角、25°;面内マトリックスサイズ128×128; FOV、22ミリメートル2;取得数、4;そして1分30秒のおおよその取得時間。 </li><li> 「前売」タブでLV解剖学的および機能的なパラメータを測定するために、パルスオキシメータ·ゲーティッド短軸シネMR画像を収集するために「シネ」シーケンスを選択します。マウスのホバリングとドラッグすることで、心臓の長軸像に基づいて撮像スライスの位置や角度を調整します。グラディエントエコーシネ·シーケンス取得するために、「取得」タブでは、次の撮像パラメータを入力してください：TR、500ミリ秒; TE、5ミリ秒; FOV、22ミリメートル2。買収行列、256×256;スライス厚さ1mm;取得数、8;フレーム数、6;そして17分〜の取得時間。取得を開始するには、[開始]をクリックします。 </li><li>イメージングソフトウェアの「I / O」タブを使用して、DICOMフォーマットに取得された画像を変換し、処理のためにデータセンターに対応するファイルを転送する。 </li><li>撮像手順の終了時に、すべてのOWマウスは、フィルタートップケージ内で麻酔から回復する。彼らは胸骨横臥を維持し、必要に応じて更なる研究のためにそれらを保つために十分な意識を取り戻すまで、無人のマウスを放置しないでください。 </li></ol>心臓磁気共鳴顕微鏡イメージングの4。データ解析<ol><li> LV 19の解剖学的および機能的なパラメータを分析するために、セグメントのソフトウェアを使用してください。 「オープン画像ファイル（複数可）」「ファイル」メニューのサブメニューを使用してソフトウェアにDICOMフォーマットのシネ画像をロードすることによって。 GUI上の画像の種類や画像表示面として「短軸半ば心室」などのイメージング技術、「シネ」として「MRGE &#39;を選択します。 </li><li> 「拡張期を終了するために現在の時間枠を設定する」をそれぞれ「編集」メニューのサブメニュー「収縮期を終了するために現在の時間枠を設定する」を通して拡張末期と収縮末期に使用する時間枠を指定してください。 </li><li>最初の「LV」コマンドボタンをクリックし、右下のパネルにある「エンド」と「EPI」コマンドボタンを手動でそれぞれ左心室心内膜と心外膜を描画する。計算の精度を高めるために、対応するコマンドボタンを押すことで乳頭筋を除去する。 </li><li>このような拡張末期容積、収縮末期容積、ストローク量、右上パネルの駆出分画として定量のLVパラメータを読み込む。 「その他」のコマンドボタンを押して、壁の厚さ、および心室直径22などのLVパラメータを測定する「測定キャリパー」コマンドボタンをクリックします。 </li><li>必要に応じて画像を再処理する」。マット」の形式で、セグメント化を含む画像を、保存するために「ファイル」メニューのサブメニュー「両方画像スタックとセグメンテーションを保存」をクリックしてください。 </li></ol>

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利益相反は宣言されなかった。

本研究は、自己免疫性心筋炎に罹患したマウスで心臓の異常を把握するための非侵襲的なツールとして、MRMプロシージャとその有用性を説明しています。 EAMの組織学的特徴は、ヒトの感染後心筋炎に似ているので、マウスモデルは、一般に、心筋傷害23-25 ​​の免疫機構を描写するために使用される。しかし、心筋炎に罹患した動物は、臨床的に正常に表示され、診断、実験7の終了時に組織学に基づいて行われる。動物は通常、21日目に免疫後に屠殺する。一度に、このように疾患プロセスを評価することは、特に治療を受けて病気の進行の監視が重要な要件である医薬品の研究では、これらのモデルの限界の使用を指しています。 生きている動物に心臓の異常を確認するために、MRMのような非侵襲的なモダリティの使用が便利です。ここで説明したMRM技術造影剤を使用する必要なしに、心臓の構造的および機能的特性を得るという利点を提供する。しかしながら、この技術は、強磁場における高分解能の3D解剖画像の取得を必要とする。画像が取得されると、それにもかかわらず、例えば、LV拡張終期容積および駆出...

心不全は、死亡の主要な原因であり、心筋炎、若年青年1における心不全の主な原因の一つである。心筋炎に罹患し、ほとんどの患者は無症候性のままであり、この疾患は、自然に2を解決します。しかし、影響を受ける人々の10〜20％は、拡張型心筋症（DCM）3につながる、慢性疾患を開発することができます。種々の動物モデルは、心筋炎の免疫病因を研究するために開発されてきた。この疾患は、心臓ミオシン重鎖（MyHCの）-αまたはその免疫優勢ペプチドフラグメントまたはコクサッキーウイルスB3 4-9のような病原体に感染させることによって動物を免疫化することによって心筋炎感受性A / JおよびBalb / cマウスにおいて誘導することができる。本研究では、A / JマウスにおけるMyHCの-α334から352に誘導される心筋炎を伴う。心筋の浸潤を示すにもかかわらず、心筋炎の影響を受けた動物は、臨床的に正常に見える。診断は炎症7 Aの心の組織学的評価に基づいているND心エコー10。 磁気共鳴顕微鏡法（MRM）は、（直径10μm以下）微小血管のレベルに機能的詳細の評価を可能にする、高分解能三次元平面と心血管イメージングを得るために一般的に用いられる方法であるが、解像力のこのレベルは解像度は、一般に1ミリメートル11-14までに得られているルーチン磁気共鳴画像（MRI）スキャン手順と達成できない。それは疾患過程14の初期の時点でのパフォーマンスパラメータを導出することも、高解像度画像の取得を可能にし、MRMとしては、利点を提供する。臨床的には、MRM撮像は、広範囲に罹患した心臓、肺または脳15-17の機能パラメータを研究するために適用されている。本研究では、自己免疫性心筋炎に罹患したA / Jマウスにおける心臓の異常を把握するための非侵襲的なツールとしてのMRM技術の使用が示されている。具体的には、T彼のMRMイメージングはできますよう、合理的な精度18と左心室（LV）拡張末期容積と駆出率（EF）などの機能的なパラメータの定量化。各パラメータの定義は次のとおりです。左室拡張末期容積、拡張期のサイクルの終わりに左心室の血液の量、および駆出率、拍出量/拡張末期容積。データ分析は、磁気共鳴スキャナ19により取得されたDICOM準拠の心臓血管画像を処理するために開発された自由に利用できるセグメント·ソフトウェアを用いて行われる。データは、健常マウスにおけるこれらの機能パラメータと比較して、LVの拡張末期容量、一回拍出量と駆出率の低下に対応する、心筋炎の動物におけるLV壁の厚さの増加を明らかにした。

<table><tbody><tr><td>Myhc-A 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td><td>Neopeptide、ケンブリッジ、マサチューセッツ州</td><td></td><td>4 &#176 ストア。C</td></tr><tr><td>CFA</td><td>シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ</td>州<td>5881</td><td>ストア4&#176;C</td></tr><tr><td>MTB H37Rv抽出</td><td>物Difcoラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン</td><td>州231141</td><td>4&#176でストア。C</td></tr><tr><td>PT</td><td>リスト生物製剤研究所、キャンベル、カリフォルニア州</td><td>181</td>ストア<td>4&#176;C</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>コーニング、マナッサス、バージニア</td>州<td>21-040-CV</td><td>ストア4&#176;C</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare, Mumbai, India</td><td>NDC66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Female A/J mice</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td><td>646</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lok sterile 1 ml syrringe</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lok sterile 3 ml syringe</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>滅菌針, 18 G</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td></td>305195</tr><tr><td>滅菌針、27 1/2 G</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>3方向ストップコック</td><td>スミスメディカルASD、Inc.ダブリン、オハイオ州</td><td>MX5311L</td><td></td></tr><tr><td>Kerlixガーゼ包帯ロール</td><td>Covidien、マンスフィールド、マサチューセッツ州</td><td>6720</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional、ロズウェル、ジョージア</td><td>州 34155</td><td></td></tr><tr><td>Protouch Stockinette</td><td>MedlineIndustries, Mundelein, IL</td><td>30-1001</td><td></td></tr><tr><td>滅菌手術用ハサミと鉗子</td><td>INOX tool Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro oven</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermiPAQ 温冷セラピーシステム&nbsp;</td><td>セラミックスコーポレーション、スプリングフィールド、イリノイ州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>爬虫類暖房ランプ</td><td>、エナジーセーバーズアンリミテッド、株式会社カーソン、カリフォルニア州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3Mトランスポアテープターゲット</td><td>コーポレーション、ミネソタ</td><td></td><td></td></tr>州<tr><td>アップアンドアップポリミキシンB硫酸塩/バシトラシン/ネオマイシン硫酸塩抗生物質軟膏</td><td>ターゲットコーポレーション、ミネソタ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>州ノースセーフティDeciDamp-2PVCフォーム耳栓ノース</td><td>セーフティ製品、スミスフィールド、RI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター、6フィート&rsquo;木製の茎&nbsp;</td><td>Jorgensen Laboratories, Inc. コロラド州</td><td></td><td></td>ラブランド</tr><tr><td>麻酔導入室&nbsp;</td><td>Summit Anesthesia Solutions, Ann Harbor, MI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit Anesthesia 麻酔の流れを調節するためのサポートシステム&nbsp;</td><td>Summit Anesthesia Solutions、ミシガン州</td><td></td><td></td>アンハーバー</tr>特別に設計された<tr><td>動物</td><td>ホルダーAgilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;オムニコン F/AIR&nbsp;麻酔ガスフィルターユニット&nbsp;</td><td>A.M. Bickford, Inc. Wales Center, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パルスオキシメータモジュール、MR対応小動物モニタリングおよびゲーティングシステム&nbsp;</td><td>Small Animal Instruments, Inc. ニューヨーク州ストーニーブルック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素ボンベ&nbsp;</td><td>Matheson-Tri Gas、North-Central Zone、Lincoln、NE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガスレギュレーター&nbsp;</td><td>Western Medica, West Lake, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>信号遮断モジュール、MR対応小動物監視およびゲーティングシステム</td><td>Small Animal Instruments, Inc. Stony Brook, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4 T (400 MHz) 89 mm 垂直コアボア MRスキャナー</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 cm ヤスデマイクロイメージングRFコイル</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAM PCモニター</td><td>Small Animal Instruments, Inc. ニューヨーク州ストーニーブルック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定量的医用画像解析ソフトウェア</td><td>http://segment.heiberg.se;&nbsp;セグメントv1.8 R1430,&nbsp;スウェーデン、オレスンスン州メドヴィーゾ</td> Matlabソフトウェア The Mathworks, Inc.&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Natick、マサチューセッツ州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ-UNIXオペレーティングシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

心筋炎、心筋の炎症であるが、影響を受ける人々の唯一の約10％は、疾患の臨床症状を示しています。心筋傷害の免疫事象を研究するために、心筋の種々のマウスモデルが広く用いられている。本研究では、A / Jマウスの心臓ミオシン重鎖（MyHCの）-α334から352を用いて誘導実験的自己免疫性心筋炎（EAM）を関与;影響を受けた動物は、リンパ球性心筋炎を発生するが、明白な臨床徴候と。このモデルでは、α-MyHCの334から352で免疫した動物における心臓の構造的および機能的変化を決定するための非侵襲的な様式として、磁気共鳴顕微鏡法（MRM）の有用性が示されている。 EAMおよび健康なマウスでは4センチヤスデ、高周波イメージングプローブおよび100g / CM三軸勾配を搭載した9.4 T（400 MHz）の89ミリメートル、縦コアボアスキャナを用いて画像化した。心臓画像は、麻酔をかけたグラディエントエコーベースシネパルスシーケンスを用いて動物、およびアニマから入手したlsコマンドは、呼吸およびパルスオキシメトリーによりモニターした。分析は、健康なマウスと比較して、心室の内径の対応する減少と、EAMマウスにおける心室壁の厚さの増加を明らかにした。データは、炎症を起こした心臓の形態学的および機能的変化を非侵襲的に生きている動物にMRMによりモニターすることができることを示唆している。結論として、MRMは進行と回帰感染性病原体によって引き起こされる疾患における心筋傷害のほか、治療に対する反応を評価することの利点を提供しています。

本報告書では、EAMに罹患した動物の心の中に構造的および機能的変化を測定するための非侵襲的なモダリティとして、MRM法の有用性が示されている。心筋炎は、CFA 7におけるMyHCの-α334から352で動物を免疫することにより、A / Jマウスに誘導し、動物は21日目免疫後に、MRM実験に供した。 MRMイメージングは​​、トリプル軸勾配（最大強度は100g / CM）を装備した89ミリメートル垂直ボア磁石を用いた9.4 T（プロトンの400 MHz）で、イソフルラン麻酔下で生きている動物について行った。スカウト像は、長軸4腔像を取得するために、軸方向の画像に続いて、視野の中央にマウス心臓を見つけて、配置するために買収されました。心臓は、2室ビューの画像化されたときの角度は、 図2Aに示されている。心臓画像は、グラディエントエコー系シネパルスシーケンスを用いて4センチヤスデRFイメージングプローブを用いて取得した。心機能MEASurements（撮影：LV壁厚;出力：LV拡張終期容積および駆出率）を、次いで、セグメントソフトウェアを用いて分析した。 EAMの影響を受けたマウスの心臓...

この研究は、自己免疫性心筋炎に罹患したマウスの心臓異常を評価するための非侵襲的ツールとして、磁気共鳴顕微鏡イメージングが成功したことを示しています。 データは、この技術が生きた動物の病気の進行を監視するために使用できることを示しています。

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

この手順の全体的な目的は、炎症性心疾患を患った生体動物の心臓をイメージングすることにより、心機能異常を確認することです。これは、まず心筋炎などの疾患を誘導し、次に動物を磁気共鳴顕微鏡イメージングに向けて準備し、動物ホルダーに設置することで達成されます。次に、心臓画像を撮影するためにマウスを磁石の中に配置します。最後のステップは、segmentソフトウェアを使用して心機能パラメータを解析することです。最終的に、この手法を用いて、自己免疫性心筋炎を発症したマウスの心不全末期拡張期容積および駆出率を算出します。組織病理学などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、非侵襲的であり、心臓の3次元高解像度像を提供できることです。本手法は、炎症性心疾患の診断を含む循環器学分野における重要な課題の解決に寄与します。一般的に、本手法に不慣れな者は、磁気共鳴マイクロイメージング撮影のための動物調製に習熟していないため、習得に苦労することがあります。したがって、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。まず、自己免疫性心筋炎を誘導するためのペプチド溶液を調製することから本プロトコルを開始します。cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、最終濃度を2 mg/1.5 mLにします。次に、50 µgの凍結乾燥百日咳毒素を含むバイアルに、滅菌済み1xリン酸緩衝生理食塩水を1 mL加えて、百日咳毒素を調製します。ストック濃度を50 ng/µLにします。次に、そのストック液20 µLを滅菌済みの1.5 mLチューブに取り、滅菌済みの1×リン酸緩衝生理食塩水980 µLを加えて、作業濃度を1 ng/µLにします。また、40 mgの結核菌（Mycobacterium tuberculosis H37Rv）またはMTB抽出物を10 mLのCFAに加えて、最終濃度を5 mg/mLにした完全フロイントアジュバント（CFA）を調製します。次に、ペプチドCFAエマルションを調製します。1.5 mLのエマルション分注量を用意するため、1本の1.5 mLチューブに750 µLのcardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52ペプチド溶液を入れ、もう1本の1.5 mLチューブに同量のMTB抽出物添加CFAを分注します。その後、3 mLルアーロックシリンジを用いて、まずペプチド溶液を吸引し、続いてCFA-MTB抽出物を吸引します。このシリンジを3方活栓に取り付け、活栓のもう一方の出口を空の3 mLシリンジに接続します。ストップコックの開度を調節します。ペプチドCFA混合液が一方のシリンジからもう一方のシリンジへ、適度な抵抗感を持って流れるようにしてください。内容物を一方のシリンジからもう一方へ繰り返し押し出すことで、約1分間混合し、その後、アセンブリ全体を氷上に約3分間置きます。この手順を最低10回繰り返します。100 mLのガラスビーカーに入れた静止水に、ごく少量の液滴を慎重に滴下し、エマルションの均質性を判定します。液滴が水中で分散しないことを確認してください。分散する場合は、目的の均質性が得られるまで混合を続けます。エマルションの内容物を3 mLシリンジから1 mLルアーロックシリンジに転送します。ストップコックに取り付けられた2本の3 mLシリンジのうち1本を1 mLシリンジに交換し、その後、27.5ゲージの針を取り付けます。6〜8週齢の雌性 aj. マウスの両鼠径部に、ペプチドCFAエマルジョン 150 µLを分割して皮下注射します。次に、免疫後の0日目と2日目に、各個体に百日咳毒素懸濁液 100 µLを腹腔内投与します。7日目に免疫手順を繰り返し、ペプチドCFAエマルジョン 150 µLを胸骨の両側に分割して皮下注射します。このエマルションは、記載の方法で調製直後に使用してください。その後、21日目に動物にMRMイメージングを行います。イメージングの準備として、まず各マウスを加熱パッドで保温した、2% ISO fluorine空気混合物を含む麻酔導入チャンバーに入れます。その後、動物を専用の動物ホルダーに移します。バイトバーで頭部を固定し、動物を腹臥位で不動化させます。麻酔を維持するため、鼻先をノーズコーンに適合させてください。実験中の動物の体温を維持するため、エアブローヒーターの吐出ホースをスキャナーの垂直ボードに挿入して電源を入れます。撮像セッションの間、イソフルラン濃度1～2%、流量2 mL/minで麻酔を維持してください。足指をピンチすることで、麻酔状態であることを確認します。次に、撮像セッション中の呼吸と体温をモニターするため、ニューマチックピローセンサーと直腸温度プローブを設置します。また、左足首にファイバー optic パルスオキシメトリセンサーを取り付け、足は糸のループで固定し、位置を維持するためにテープで留めてください。撮像は、造影剤を使用せずに呼吸信号と心拍信号によるゲーティングを行うことで実施します。高解像度の3次元磁気共鳴顕微鏡像を得るには、広開口の9.4 Tesla垂直ボアマグネットを使用してください。動物の準備が整ったら、心臓が視野の中心に位置するようにマウスをスキャナーに配置します。次に、イメージングインターフェースを起動し、コマンドバーの「new study type」メニューからチューニングページを開き、「start probe」、「tune」、「autoscale」を順に選択します。コイル端にあるリモートチューニング・マッチングノブを使用して、RFコイルをプロトンの共鳴周波数である400 megahertzに調整します。次に、プリスキャンページに移動します。周波数およびパワーのキャリブレーションを実行するには、x, Y, Zクイックボタンを押してシミングページを表示させてください。次に、すべてのイテレーションを選択し、オートシミングを実行します。スカウトシーケンスを選択してください。視野（FOV）を35 millimetersに変更します。その他の設定はデフォルトのままにし、シーケンスを実行します。心臓が視野の中心にない場合は、アニマルホルダーの位置を調整し、RFコイルのチューニングをやり直して、スカウト画像を再取得してください。その後、gemシーケンスを選択します。心臓の短軸および長軸に沿った2つの直交平面を取得するために、ここにある取得タブに取得パラメータを入力します。次に、パルスオキシメトリゲージ短軸シネ画像を収集するためのシネシーケンスを選択し、左室の解剖学的および機能的パラメータを測定します。グラジエントエコーシネシーケンスを取得するために、ここに示されているパラメータを入力してください。心臓の長軸像に基づき、イメージングスライスの位置と角度を調整します。その後、シーケンスを実行してください。イメージングが完了したら、IOタブを使用して、取得した画像をDICOM形式に変換し、対応するファイルを処理のためにデータセンターへ転送します。撮像手順の終了後、動物をフィルター付きケージ内で麻酔から回復させます。マウスが胸立位を保持できる十分な意識を取り戻すまで、目を離さないでください。ここでは、Segmentソフトウェアを使用して左室の解剖学的および機能的パラメータを解析します。まず、DICOM形式のシネ画像をソフトウェアに読み込みます。次に、撮像法としてMRGEを、画像タイプとしてcineを、および短軸心室中部を選択します。画像ビュー平面で、編集メニューの「現在のタイムフレームを拡張末期に設定」および「現在のタイムフレームを収縮末期に設定」サブメニューを使用して、拡張末期と収縮末期に使用するタイムフレームを指定します。次に、右下のパネルにあるLVボタン、続いてendoボタンとEPIボタンを使用します。左心室、心内膜、心外膜をそれぞれ手動で描画し、対応するコマンドボタンを押して乳頭筋を除去します。計算の精度を高めるために、右上パネルに表示される拡張末期容量、収縮末期容量、1回拍出量、および駆出率などの定量化された左室パラメータを確認します。次に、misコマンドボタンと計測キャリパーコマンドボタンを使用して、壁厚や心室径などの左室パラメータを測定します。最後に、必要に応じて画像を再処理できるよう、「save both image stacks and segmentation」オプションを使用して、セグメンテーションを含む画像をdot mat形式で保存してください。2腔室ビューの画像取得のために心臓を切り出した角度をここに示します。ここでは、健康なマウスと比較して、実験的自己免疫性心筋炎を発症したマウスの心臓において、左室壁厚がおよそ1.5倍に増加しており、構造的欠陥があることがわかります。左室拡張末期容積および駆出率に基づいて測定した心拍出量は、健康なマウスと比較して、自己免疫性心筋炎を発症したマウスで減少していました。最後に、上記の治療群の心臓をヘマトキシリン・エオジン染色により評価し、炎症を確認しました。健康なマウスではなく心筋炎マウスの心臓の組織学的評価では、多焦点性のリンパ球浸潤が認められました。この手順を行う際は、実験中に心拍数や呼吸数が大きく変動しないよう、動物の体温を一定に保つことが重要です。これは、再現性のある結果を得るために不可欠です。このビデオを視聴することで、心筋炎などの炎症性心疾患における機能的異常をマウスで評価するための磁気共鳴顕微鏡法の技術について、十分に理解できるはずです。ただし、高磁場での作業は非常に危険であるため、アニマルホルダーおよびその他の構成部品は非磁性体でなければならないことに留意してください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

高周波ドップラー超音波は、局所的な心筋機能を評価するための新しい技術です。この作品は、心筋の歪み、DP / dtは、虚血 -...

高周波高分解能心エコー検査：虚血 - 再灌流マウス心臓における心筋ストレイン、収縮性、および僧帽弁閉鎖不全の非侵襲的な反復測定に関する最初の証拠

造影心臓磁気共鳴（CMR）イメージングは​​、包括的なことができます...

小動物ルックロッカー反転回復（サリー）ラットにおけるMRIを用いた心機能と心筋形態の評価

マウスの心臓のMRIおよびPETイメージングの実行方法について説明します。このプロトコルは、心筋梗塞と心不全のモデルにおける治療効果を評価するように調整されています。...

心筋梗塞マウスモデルにおけるMRIとPET

この方法は、実験的に誘発された心筋虚血のマウスにおいて、心臓の形態、機能、灌流、代謝、および生存率を評価するための量子マイクロコンピュータ断層撮影法(MicroCT)の使用を概説しています。この技術は、ヒト心臓病のさまざまな動物モデルの非破壊ハイスループット縦断的in...

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

本研究では、マウス心臓の左心室機能パラメータを定量化するための包括的な心血管磁気共鳴画像法(CMR)プロトコルについて説明する。プロトコルは、CMR画像の取得、後処理、および分析、ならびに異なる心臓機能パラメータの評価を記述します。...

心臓血管磁気共鳴画像法によるマウス心左心室機能、心筋緊張、血行力の定量化

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マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。...

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における心臓損傷の 3 次元 (3D)...

ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

心筋組織の歪みのようなパラメータを測定するために正確で実用的な方法は、それが示されているので、その株が頻繁に使用されるパラメータEFより収縮不全のためのより高感度およびそれ以前のマーカーである、偉大な臨床的価値があります。...

特徴追跡を用いた磁気共鳴が派生心筋ストレインの評価

学ぶ磁気共鳴イメージング顕微鏡法によるマウスの実験的自己免疫性心筋炎における心臓機能異常の非侵襲的評価法。この技術は収縮末期容積と駆出率の定量的解析を可能にし、炎症性心疾患の進行監視に有用です。

マウスでの磁気共鳴イメージング顕微鏡による実験的自己免疫性心筋炎における心臓の異常を非侵襲的に評価

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