リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。

この手順の全体的な目標は、転移の小惑星中皮細胞共培養モデルにおける卵巣がん細胞の浸潤をリアルタイムで迅速に定量化することです。これは、まず、細胞株からメチルセルロース中の非接着条件下で細胞を培養することにより卵巣癌を生成することによって達成されます。第2のステップは、腹腔の中皮と中皮内層自体の下にある基底膜を模倣するために、2つのチャンバーウェルの上部チャンバーをマトリゲルでコード化することにより、リアルタイム細胞分析装置、CIMプレートを調製することです。

次に、卵巣がんステロイドを採取し、リアルタイムアナライザープレートウェルの上部チャンバーに加えます。最後のステップは、リアルタイムセルアナライザーをプログラムして開始することです。これにより、長期間のアッセイにわたって、あらかじめ定義された間隔で定期的に読み取りが行われます。最終的に、得られた結果は、卵巣がん細胞が細胞およびマトリックスバリアに侵入する際に調節する主要な因子を決定するために使用される、継続的な浸潤プロセスを示しています。

がん細胞浸潤の標準的なトランスワールドアッセイのような既存の方法に対するこの手法の主な利点は、このアプローチにより、長期間にわたるがん細胞の浸潤を連続的に測定できることです。卵巣がんの転移の動的な性質を完全に捉えていない単一エンドポイントアッセイとは異なり、この方法は卵巣がんへの洞察を提供するために使用されますが、乳がんや内皮層を介したがん細胞の結合など、さまざまな種類の転移プロセスを研究するためにも適用できます。同様に、胚着床中の栄養膜浸潤などの正常な細胞浸潤を研究するために使用できます 蛍光細胞標識用の卵巣癌細胞を準備します。

最初に75%coの流暢さで細胞を収穫し、0.1%BSAあたりの予熱PBSの1ミリリットルでミリリットルあたり100万細胞の最終濃度で細胞を懸濁します ウェルごとに最適な量のステロイドを追加し、ステロイドを慎重に取り扱うことは、この手順の成功に重要です。次に、細胞微量CSFE溶液の5ミリモルストックの2マイクロリットルを最終濃度10マイクロモルで細胞に加え、摂氏37度で10〜15分間インキュベートし、水浴中で、10%FBSを含有する氷冷培地1ミリリットルで反応を急冷し、遠心分離により再ペレット化する。レウス。適切な予温増殖培地と種子細胞を、摂氏37度、二酸化炭素5%の75平方センチメートルのフィルターキャップ付きフラスコ培養液に10ミリリットルで、蛍光標識のレベルが検出に適切になるまで費やします。

この手順は、各細胞株に適した培地の量(15ミリリットルからSPHE生成に必要な細胞の量を差し引いたもの)を測定することから始めます。3ミリリットルのメチルセルロースストック溶液を培地に加え、最終的なメチルセルロース濃度を20%にし、穏やかに反転させて完全に混合します。メチルセルロース含有培地に300, 000個の細胞を加え、穏やかな反転ピペット150マイクロリットルの細胞メチルセルロース培地ミックスで96ウェル凹型底部培養プレートの各ウェルに完全に混合します。

これにより、ウェルあたり合計3000個の細胞が、摂氏37度、二酸化炭素5%で1〜4日間、または均一なPHEが形成されるまで培養されます。通常、ウェルごとに1つのステロイドが観察され、リアルタイムセルアナライザーまたはRTCA細胞浸潤アッセイは、16ウェルRTCA2チャンバーCIMプレートを利用します。一度に4つのウェルのグループで作業し、プレートの上部チャンバーの各ウェルに50マイクロリットルのマトリックスを追加して、総表面積が覆われるようにします。

30マイクロリットルのマトリックスをすぐに、しかしゆっくりと取り除き、余分な水分を取り除きます。プレートを摂氏37度で4時間インキュベートしてから、組織培養インキュベーターで使用します。4時間後、各がん細胞株に適した30マイクロリットルの無血清培地を上部チャンバーに加え、160マイクロリットルの血清の有無にかかわらず培地を追加します。

実験計画に従って、下部チャンバーを上部チャンバーにカチッとはめ込み、CIMプレートを組み立て、摂氏37度のインキュベーターで平衡化します。組織培養インキュベーターで1時間、RTCAプログラムを開き、レイアウトタブを選択します。すべての実験用ウェルを強調表示し、ウェルを右クリックして、[ウェルをオンにする]を選択します。

次に、実験条件を記入し、必要に応じて名前を販売します。プログラムにステップまたはサブステップを追加するには、[スケジュール]タブを選択し、[ステップの追加]を右クリックします。最初のステップは、事前にプログラムされたバックグラウンドスイープで、これはプログラムに自動的に組み込まれます。

ステップの追加を選択したら、LP9ヒト中皮細胞単層の確立中に読み取りを記録するRTCAプログラムのステップ2に目的のプログラム詳細を入力します。インピーダンス読み取り値の時間間隔を追加するには、[間隔] タブを選択し、15 分を入力します。実験期間を追加するには、期間タブを選択し、12 時間から 24 時間までの時間を入力します。

後続のステップも同じ方法で追加されます。RTCAプログラムのステップ3は、フリッド侵入中に測定値を取るように機器に指示します。[インターバル] タブに 5 分、[デュレーション] タブに 48 時間を入力します。

メニューバーでプレートを選択し、保存します。この手順を開始するには、CIMプレートをRTCA機器にセットし、前に保存したプログラムを開きます。メニューバーで[実行]を選択し、バックグラウンドスイープを自動的に開始します。

バックグラウンドスイープに続いて、CIMプレートを装置から取り外し、組織培養フードプレートに入れます。50, 000 LP 9細胞を160マイクロリットルの無血清培地に懸濁し、各CIMプレートの上部チャンバーに充填します。ウェルプレートをRTCA装置に置き、LP9単層が翌日の夜に確立している間、15分ごとに読み取りを行い、1ミリリットルのピペットチップの上部を無菌的に切り取り、それを使用して各細胞株の各ウェルの内容物を穏やかに回収します。

滅菌チューブ遠心分離機にステロイドを溜め込みます。ステロイドを120GSで8分間ステロイドし、その後、穏やかな吸引によりメチルセルロース含有培地を除去します。各洗浄の後でステロイドを餌にするために8分間120 GSで使用するためのPBSのcentrifとさらに2回spheを洗いなさい。

各実験井戸について、ResusはPBSなしの媒体の160マイクロリットルに合計10ステロイドを費やします。RTCA 実験を一時停止するには、メニュー バーから [実行] を選択し、[一時停止] をオンにします。装置からCIMプレートを取り外し、組織培養フードに入れます。

各ウェルから培地を吸引し、ステロイド含有培地と交換します。プレートをRTCA機器に戻します。メニューバーから「実行」を選択し、「中止ステップ」にチェックを入れます。

プログラムは自動的に次のステップに進みます。実験を再開するには、メニュー バーから [実行] を選択し、[続行の開始] をオンにします。RTCA プログラムのステップ 3 では、この実験で 2 つの上皮性卵巣がん細胞株 OVCA 4 33 と OVCA 4 29 と卵巣顆粒膜細胞腫瘍株を開始します。

KGNは、一晩培養し、メチルセルロース含有培地に懸濁したU底住居後にステロイドを生成するために使用されました。3つの細胞株はすべて、直径約400〜500マイクロメートルのコンパクトなステロイド構造を形成しました。下のパネルは、単層スケールで成長した一致する細胞株を示しています。

バーは形成されると100マイクロメートルを表します。ステロイドを採取し、R-T-C-A-C-I-MプレートのLP9中皮細胞単層の上に播種しました。位相差顕微鏡下またはパラレル培養物の蛍光顕微鏡下での画像は、RTCAデータの解釈を支援するために定期的に撮影されました。

がん細胞株の浸潤の基底層と、化学療法によって誘発される浸潤の両方を評価することは有益です。この例では、上部と下部の両方のチャンバーに無血清培地またはSFMを添加することにより、基礎浸潤性が測定されます。多くの潜在的な化学療法誘引物質を含む10%FBSを含む完全な培地は、化学療法誘引物質誘発性浸潤を調べるために使用されます。

ここに示されているのは、kgn細胞とLP9つの中皮細胞との間の細胞浸潤の比較からの代表的な結果です。RTCAインベージョンアッセイは、A CIMプレートの底部チャンバーでFBSを使用する場合と使用しない場合で実施しました。結果は、24時間の時点および2日間のアッセイ期間全体にわたる三重ウェルからの平均陽性からSD細胞指数を引いた値として示されます。

これらの結果は、LP 9細胞が基礎または化学誘引剤のいずれかの条件下で2日間にわたって低侵襲であること、したがって卵巣癌細胞との共培養アッセイに使用するのに適した細胞タイプであったことを裏付けています。対照的に、KGと卵巣がんステロイドは、化学療法誘引剤に向かって侵入する能力を示しました。このグラフは、K-G-N-O-V-C-A 4 29およびOVCA 4 33細胞株の浸潤能を2日間にわたって24時間にわたって比較した結果を示しています。

3つの細胞株はすべて、細胞指数の増加によって示されるように、化学療法誘引剤に向かって侵入する能力を示しました。細胞株は、曲線の平行線の傾きで示される同様の浸潤速度を示しました。しかし、OVCA 4 29曲線は、より高い上部asimトート体を示し、これは他の細胞株と比較してより高い最大浸潤レベルを示していた。

対照的に、すべての細胞株の基礎浸潤レベルは低かった。さらに、細胞株は、2.5時間の期間にわたる浸潤データのより詳細な分析によって示されるように、浸潤の開始までの時間に違いを示しました。KGN細胞は細胞バリアとマトリックスバリアに素早く侵入しますが、OVC 4 33細胞とOVC 4 29細胞はそれぞれ3倍と5倍の時間がかかります。

重要なことは、侵入開始時の彼らの行動は、彼らの全体的な侵入能力を予測していなかったことです。これは、がん細胞株の固有の能力が異なることを示唆していますが、ステロイドの早期および後期の浸潤挙動を調節する要因が異なることも示している可能性があります。一度習得すると、この手法は、転移挙動に影響を与える腹膜微小環境内のさまざまなシグナル伝達分子や細胞経路の研究に容易に適応できます。

これは、外因性成長因子、サイトカイン、または阻害剤をウェルの底部または上部チャンバーに添加することで達成できます。あるいは、がん細胞自体や腹膜標的細胞を遺伝子操作することもできます。