SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定
2014年7月6日
タンパク質相互作用：SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。
この手順の全体的な目標は、目的の特定のタンパク質のタンパク質相互作用パートナーを特定することです。これは、まず、炭素と窒素の異なる安定同位体で標識されたアルギニンとリジンを含む細胞培養培地で細胞を増殖させることによって達成されます。第2のステップは、目的タンパク質またはコントロールプラスミドを標識細胞にトランスフェクションし、プラスミドをコーティングすることです。
次に、細胞を溶解し、サンプルを溶解物から免疫沈殿させます。次に、同量のコントロール免疫沈殿物とサンプル免疫沈殿物を組み合わせ、lc MS MS分析に提出します。最後のステップは、質量分析データを分析して、目的のタンパク質と相互作用するタンパク質を特定することです。
最終的に、細胞培養中のアミノ酸の安定同位体標識またはシラックアミノ沈殿物は、組織培養細胞から目的のタンパク質との直接的および間接的な相互作用を多数同定することができます。この手法がタップタギングなどの既存の方法よりも優れている主な点は、研究者が質量分析から個々のバンドを遠ざける必要がないことです。これにより、重要なバイアスの原因が取り除かれ、感度が向上します。
この方法は細胞タンパク質に関する洞察を提供するために使用できますが、タンパク質相互作用は、病原体と宿主の相互作用の研究など、他のシステムにも適用できます。SLAC標識HEK 2 93 T細胞の掻き取りを開始するには、目的のGFPタグ付きタンパク質またはGFPコントロールを細胞培養皿から氷冷PBSに発現させ、細胞懸濁液を220倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞を10ミリリットルの氷冷PBSでさらに3回洗浄し、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解緩衝液200マイクロリットルに細胞ペレットを再懸濁します1つのX濃度で3つを添加し、溶解緩衝液のミリリットルあたり5マイクロリットルのRNAカクテルを加え、氷上で5分間インキュベートします。次に、細胞溶解物をGの13,000倍で摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を可溶性細胞溶解物として保持します。
A BCAアッセイを用いて細胞溶解物のタンパク質濃度を測定します。次に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーを使用して、最終容量500マイクロリットルの各サンプルライセート中のタンパク質濃度を標準化します。1つのxプロテアーゼ阻害剤カクテル3を含む500マイクロリットルの希釈バッファーを、正規化した細胞ライセートのそれぞれに添加して、総量を1ミリリットルに調整します。
抗GFPビーズを調製する際にはライセートを氷上に保持し、サンプルインプットに使用するために各サンプルの50マイクロリットルのアリコートを保持します。ビーズスラリーをボルテックスして、ビーズを再懸濁します。次に、エンドカットオフ付きの200マイクロリットルのピペットチップを使用して、サンプルあたり25マイクロリットルのビーズを新しいチューブに移します。
ビーズスラリーの25マイクロリットルごとに、洗浄するために20容量の希釈緩衝液を追加し、ビーズを2,700倍Gで5分間遠心分離します。ビーズを20容量の希釈バッファーでさらに複数回洗浄します。次に、ビーズスラリー25マイクロリットルあたり100マイクロリットルの希釈バッファーを追加します。
次に、エンドカットオフ付きの200マイクロリットルのピペットチップを使用して、再懸濁されたビーズスラリーの85マイクロリットルをSLACラベル付きサンプルLysatesのそれぞれに移します。サンプルがビーズとインキュベートした後、摂氏4度の回転子でビーズとサンプルをインキュベートし、サンプルを摂氏4度で5分間Gの2,700倍で遠心分離します。50マイクロリットルの上清を非結合サンプルとして保持し、残りの上清を廃棄します。
各チューブ内のビーズを1ミリリットルの希釈緩衝液に再懸濁し、次いで2,700回Gで摂氏4度で5分間遠心分離する。この洗浄ステップを2回繰り返して、ビーズからタンパク質を溶出します。各サンプルに50マイクロリットルの2つのXSDSローディングバッファーを加え、摂氏95度で10分間加熱します。
加熱が終了したら、各サンプルを2、700倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を潤滑済みのチューブに移し、MS分析に提出する準備ができるまでマイナス80°Cで保存します。次に、等量のコントロールアミノ沈殿物とサンプルアミノ沈殿物を混合し、結合したサンプルを質量分析施設に提出してlc ms MS分析を行います。
質量分析データを分析する前に、生データを新しいスプレッドシートにコピーします。次に、このスプレッドシートで、アクセッション番号、一意のペプチドの数の比率、比較サンプル、比率の変動性、およびタンパク質の説明を含む列を除くすべての列を削除します。Excel の並べ替え機能を使用して、ペプチドの数でデータを並べ替え、複数のペプチドが不足しているタンパク質のエントリを削除します。
次に、比率でソートし、SLAC比が欠如しているタンパク質を除去します。次に、slac 比を log 2 値に変換します。数式は、対数括弧、SLAC 比 2、およびセル識別子に SLAC 比が置き換えられる括弧と等しくなります。
次に、Excel ファイルに新しい列を作成し、モック サンプル比率をサンプル モック比率に変換するために、すべてのサンプル モック列の Log 2 SLAC 比率を計算します。1を比率で割ったものに等しい式を使用します。GraphPadプリズムを開きます。
新しいデータテーブルとグラフを選択し、ウィンドウの左側にあるリストから列を選択し、インポートデータを入力します。レプリカ値を積み重ねて列オプションに入力します。[作成]を押します。
次に、Excel スプレッドシートから特定の log 2 サンプル mock SLAC ratio 列を選択して新しいプリズム ファイルにコピーします。次に、ドロップダウンの挿入メニューをクリックし、[新しい分析]を選択します。カラム分析で、度数分布を選択します。
デフォルトのオプションをそのままにして、[OK]をクリックします。結果フォルダには、新しいヒストグラムセクションが生成されます。度数分布セクションを選択し、ドロップダウンの挿入メニューをクリックして、新しい分析XY非線形回帰曲線フィットを選択します。
[Gaussian distribution] をクリックし、[OK] をクリックします。表示される結果ウィンドウには、平均と標準偏差が表示されます。Excel ファイルの平均リターンに 1.96 標準偏差を加算して、しきい値を生成します。
結合ラベル列 A アクセッションという新しいタブを作成し、個々の各実験のすべてのアクセッション番号をこの 1 つの列にコピーします。次に、[データ]タブを選択し、[重複の削除]オプションを選択します。次に、各実験のSLAC比と比の変動性、およびタンパク質名の説明列の列を作成します。
[説明] タブで、VLOOKUP 式を使用して、各アクセッション番号の説明を収集します。式を列の下にドラッグしてタンパク質の説明を入力し、この式を使用して個々の実験から比率と変動性のデータを取得します。結合されたデータセットで相互作用するタンパク質を強調表示するには、特定の実験のしきい値に注意してください。
比率の列を選択し、ホームタブをクリックします。続いて条件付き書式を設定し、セルの強調表示ルールをさらにルールし、次にスタイルを選択します。クラシック形式は、販売値以上を含む販売のみを選択します。ボックスに 1.96 標準偏差の値を入力し、[OK] をクリックします。
各正の交互作用の比率変動性を評価します。変動率を減算すると、ヒットがしきい値を下回る場合。これは注意して扱う必要があります。
各結果列についてこれを繰り返し、2つ以上の実験で同定されたタンパク質が高信頼の相互作用を表している強調表示された実験間で比較します。ウェスタンブロット分析により、目的のGFPタグ付きタンパク質の精製が確認されました。結合したサンプルにギャップDHバンドがないことは、免疫沈降ステップによって相互作用しないタンパク質がサンプルから枯渇したことを示しており、これらのサンプルにEIF 4Gバンドが存在することは、既知の相互作用結合パートナーが保持されていたことを示しています。
同定されたEIF 4 A結合タンパク質のいくつかは、2つのアイソフォーム間で保存されていました。EIF 4 Aと相互作用するタンパク質は高いLAC比で同定されますが、この実験では非特異的に結合したタンパク質の比率は0.96未満です。この開始因子複合体の図では、SLACアミノ沈殿実験で同定されたEIFの4つのA結合タンパク質が赤から白で網掛けされています。
log two SLAC比によると、EIF 4 A 1および2複合体の直接的および間接的な結合パートナーの両方の高いカバレッジは、この手順を試みる一方で、タンパク質レベルの一部の変動はデータ分析段階で補うことができる一方で、覚えておくことが重要です。 タンパク質のインプットレベルを正確に正規化し、洗浄ステップ中にArosビーズを失うのを防ぐことで、これを回避できるのが最善です。
概要
本記事では、タンパク質間相互作用を同定するための手法であるSILAC免疫沈降実験について解説します。本手法を用いることで、真の相互作用と不純物を区別し、低親和性の相互作用を保持できる点について重点的に説明します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- プロテオミクス
背景
- SILACにより、タンパク質量の相対定量が可能になります。
- これは、真の相互作用と実験的ノイズを区別する際に特に有用です。
- この手法は、病原体と宿主の相互作用を含む、さまざまな生物学的システムに適用できます。
- TAPタギングなどの従来の手法と比較して、感度が向上します。
研究目的
- 特定の目的タンパク質のタンパク質相互作用パートナーを同定すること。
- タンパク質相互作用研究の精度を向上させること。
- 細胞内におけるタンパク質相互作用に関する知見を提供すること。
使用された手法
- 安定同位体標識アミノ酸を用いた細胞培養。
- 標識細胞へのプラスミドのトランスフェクション。
- 細胞溶解物からのタンパク質の免疫共沈降。
- 混合サンプルの質量分析。
主な結果
- 多数の直接的および間接的なタンパク質相互作用の同定。
- データ収集における感度の向上とバイアスの低減。
- さまざまな生物学的相互作用の研究に対する本手法の適用成功。
結論
- SILAC免疫沈降は、タンパク質相互作用を研究するための強力なツールです。
- この手法は、複雑な生物学的システムを分析するための信頼性の高い手段を提供します。
- 今後の応用により、生物学および医学のさまざまな分野へ展開される可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
SILACベースの免疫共沈降法により、タンパク質相互作用ネットワークの定量的な探索が可能となり、初期探索段階におけるターゲットのバリデーションおよびメカニズムのリスク低減を支援します。真の相互作用因子とコンタミナントを区別することで、パスウェイ解析における予測精度が向上し、偽陽性のリードが減少します。このアプローチは、治療仮説の優先順位付けに必要な再現性と拡張性のある相互作用データを提供することで、ポートフォリオの選別（トリアージ）を改善します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：直接的および間接的なタンパク質パートナーを体系的に同定することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：緩衝液条件の厳密さを緩和することで低親和性相互作用を維持し、メカニズムの曖昧さを低減する。
- 予測的価値：ポートフォリオの意思決定に向けた、機能的ターゲットのバリデーションおよびパスウェイの解明を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 高い信頼性を持つ相互作用ネットワークを定義することで、ダウンストリームスクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを構築します。
- 実用的価値： アッセイの標準化を可能にするSILAC比を介して、定量的かつ再現性のあるアウトプットを提供します。
- 拡張性： 標準化されたライシス、IP、およびMSワークフローにより、異なる標的クラス間でのプラットフォームの再利用を容易にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：アイソフォーム間で保存されている結合パートナーを介して、探索段階の相互作用データを前臨床検証へとつなげます。
- バイオマーカーの整合性：疾患に関連した発現パターンを持つタンパク質を特定し、トランスレーショナルなバイオマーカー探索を支援します。
- リスク調整後の推進：信頼性の高い相互作用（例：複数の実験で再現されたもの）に基づき、リード最適化における継続または中止の判断を行います。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットへの結合確認からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、メカニズムの理解や化合物スクリーニングの準備に資する相互作用データを提供します。
- 探索生物学：目的タンパク質周辺の相互作用ネットワークをマッピングすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援する。
- スクリーニング：特異的結合と非特異的結合を区別する定量的な相互作用プロファイルにより、アッセイへの適用可能性を実現する。
- 分析：統計的なフィルタリングおよび閾値設定のため、log2変換したSILAC比と変動指標を算出する。
- トランスレーショナルリサーチ：複合体の完全性を検証する保存された相互作用因子（例：EIF4G）を介して、前臨床研究へとつなげる。
- 企業内での再利用：複数の標的や疾患領域に適用可能な、標準化されたプロテオミクス能力を確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測信頼度の向上、偽陽性の低減、およびメカニズム面でのリスク軽減。
- 運用的価値： 細胞株および実験条件全体における標準化、再現性、およびスケーラビリティの確保。
- 戦略的価値： Go/No-go判定の改善、資本効率の向上、および後期の生物学的失敗リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： 反復実験から得られた相互作用信頼性スコアを用いた、リスクに基づくターゲットの優先順位付け。
実施上の検討事項
- 細胞培養、トランスフェクション、免疫共沈降、および質量分析データ解析の専門知識が必要です。
- SILACラベル培地、高品質な抗体、およびLC-MS/MSインフラストラクチャへのアクセスに依存します。
- ばらつきを最小限に抑えるため、溶解、洗浄、および標準化プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項には、不安定な相互作用を維持するためのタグの選択、溶解の厳格さ、およびビーズのハンドリングが含まれます。
- 実用上の制限として、高含有量におけるレシオ圧縮や、コントロールIPによる非特異的結合の制御の必要性が挙げられます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Harvesting of SILAC-labeled Cell Lysates
3:39
Binding Lysate to Anti-GFP Beads
4:45
Preparation of Samples for MS Analysis
6:11
Data Analysis I: Understanding the Results and Removal of Low-confidence Identifications
8:58
Data Analysis III: Merging Replica Datasets
12:22
Conclusion
7:36
Data Analysis II: Selecting High Confidence Interactions for Further Study
10:59
Results: Identification of Translation Initiation Factor – Binding Proteins
